Summary
Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.
Abstract
Lentivirus sont des vecteurs efficaces pour gène de cellules de mammifères. Suite de transduction, le génome des gènes est solidement intégré dans le chromosome de l’hôte et est transmis à la descendance. Ils sont donc un vecteur idéal pour la création de lignées cellulaires stables, en vivo livraison d’indicateurs et la transduction des oeufs seule cellule fertilisée pour créer des animaux transgéniques. Cependant, souris des oeufs fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène des gènes. Lentivirus sont trop grosses pour pénétrer la zona et sont généralement livrés par microinjection de particules virales dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires. L’exigence de techniciens hautement qualifiés et d’équipements spécialisés a réduit au minimum l’utilisation de lentivirus pour la livraison de gène à des embryons de souris. Cet article décrit un protocole pour perméabiliser les oeufs souris fécondée par perforer le zona avec un laser. Laser-perforation n’entraîne pas de dommages aux embryons et permet des lentivirus accéder aux cellules embryonnaires pour la livraison de gène. Transduite embryons peuvent devenir blastocyste in vitro et si implantés chez des souris pseudopregnant, évoluer vers des chiots transgéniques. Le laser utilisé dans le présent protocole est efficace et facile à utiliser. Gènes envoyés par lentivirus stablement incorporent sur les cellules embryonnaires de souris et sont transmissible germline. Il s’agit d’une méthode alternative pour la création de souris transgéniques qui ne nécessite aucun micromanipulation et microinjection des oeufs fécondés.
Introduction
Cette méthode fournit des instructions détaillées pour perméabiliser la zone pellucide des oeufs fécondée de souris pour fabriquer des cellules embryonnaires accessibles pour la livraison de gène de lentivirus. Lentivirus ont été conçues par nature pour la livraison efficace de gène aux cellules de mammifères. Ils infectent les cellules en division et non de division et intègrent le génome des gènes de leur hôte chromosomes1. La plage de cellules de l’hôte des gènes est facilement développée par pseudotypage le lentivirus recombinant avec la glycoprotéine de virus de stomatite vésiculaire (VSV-G), en raison de la large tropisme de la VSV-G protein2. Suite de transduction, les gènes des gènes sont stablement intégrés et exprimées dans le cadre de leurs chromosomes hôtes créant un outil idéal pour la production d’animaux transgéniques. S’il est livré à des cellules embryonnaires au stade précoce, le génome des gènes est reproduit et exprimé dans tout l’organisme. Transduction LENTIVIRAUX a conduit à la production de rat, souris, cailles, poulet et porc3,4,5,6,7 , parmi d’autres espèces d’organismes transgéniques. La méthode typique de la livraison de gène des gènes, toutefois, exige des techniciens qualifiés et un équipement spécialisé pour surmonter la barrière de la zone pellucide qui encapsule les embryons au stade précoce. L’objectif général de cette méthode est de décrire comment permeabilize la zona en utilisant un laser pour faciliter la livraison de gène des gènes.
Des oeufs chez les mammifères sont entourées par la zone pellucide qui durcit après la fertilisation afin de protéger les œufs fécondés contre polyspermie et de limiter les interactions environnementales8,9. Le zona forme une barrière qui empêche les lentivirus loin les cellules embryonnaires jusqu'à ce que les embryons sont éclos comme un blastocyste. Cultivés de souris fécondé les œufs éclosent après 4 jours et doivent être implantés chez des souris pseudopregnant avant l’éclosion pour un développement normal dans les petits. Par conséquent, pour la transduction, lentivirus sont micro avant l’éclosion de la zona dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires.
La zone pellucide est souvent supprimée pour fécondation in vitro des ovocytes humains pour augmenter le taux de fécondation10. Cependant, élimination chimique de souris zone pellucide négativement affecte le développement embryonnaire chez la souris et est nocive pour les cellules embryonnaires11,12. Autres méthodes pour la livraison de gène aux oeufs souris fécondée surmonter la barrière de la zone pellucide par microinjection directe de l’ADN dans le noyau de cellule13. Microinjection pronucléaire est un moyen efficace de transporter les gènes dans des embryons. Toutefois, étant donné que chaque embryon est maintenu en place individuellement pour la micro-injection, la pratique peut être laborieux et fastidieux pour un utilisateur novice.
Autres méthodes comme l’électroporation et photoporation sont utiles pour transitoire et à court terme livraison de gène aux souris fécondés oeufs14,15,16. Ces méthodes sont largement utilisés pour livrer les recombinases et composants CRISPR-Cas9. Cependant, électroporation et photoporation livraison de gènes ne peut servir efficacement à créer des organismes transgéniques. Les spermatozoïdes qui proviennent de l’épididyme souris crevé aussi peuvent être transduites par lentivirus et utilisés pour la fécondation in vitro pour produire des animaux transgéniques17,18,19, 20.
Dans ce protocole, la livraison de gène des gènes à des embryons de souris est facilitée par perméabiliser le zona à l’aide d’un laser. Le laser XYClone a été développé pour aider à l’in vitro fertilization21 et de la culture de cellules souches embryonnaires,22. C’est un petit appareil qui est simple à installer et facile à utiliser. Une fois installé sur un microscope, il occupe la place d’une lentille de l’objectif et le logiciel permet pour viser le laser tout en regardant dans les oculaires de microscope (voir protocole: l’article 3). Une fois que le zona est perforé par le laser XYClone, lentivirus peuvent être introduits dans les milieux de culture pour la livraison de gène23. Lentivirus multiples pourraient servir à offrir simultanément plusieurs gènes chromosomiques incorporation.
Ce protocole décrit comment isoler et souris de la culture des oeufs fécondés, illustre l’utilisation de laser pour la perforation de la zone pellucide et illustre la transduction des cellules embryonnaires de souris de lentivirus.
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Protocol
Toutes les procédures animales et les traitements utilisés dans le présent protocole ont été en conformité avec les directives de protection des animaux de NIH/NIEHS et ont été approuvées par la protection des animaux et utilisation Comité (ACUC) au NIH/NIEHS, Animal protocole 2010-0004.
1. les préparatifs
- Préparer/achat recombinants non multiplication lentivirus portant votre gène d’intérêt. Dans cette étude, lentivirus SBI511 exprimant la protéine fluorescente verte copépode (copGFP ; en abrégé GFP) d’un allongement promoteur de facteur 1 a a été utilisé pour la transduction. 2 ont été utilisés pour produire des protocoles standard et lentivirus titre aux concentrations supérieures 1e8 transduction unités / mL (TU/mL).
Remarque : Soyez prudent et eau de Javel tous les documents qui ont été en contact avec des lentivirus. Voir les lignes directrices de l’Institut pour l’utilisation en toute sécurité et de la manipulation des lentivirus. - Installation de couples reproducteurs de souche de souris désiré le jour avant la récolte d’embryons. Dans cette expérience, souche C57BL/6J de souris a été utilisée. Des souris femelles utilisées pour ovaires et oviducte n’étaient pas traités avec des hormones de superovulation.
- 2 – 24 h avant la récolte des oeufs fécondée de souris, préparer plusieurs plaques de goutte Potassium Simplex optimisé Medium24 (HLGHW) comme suit : ajoutez une goutte de 50 μL de moyen de HLGHW au milieu d’un plat de 35 mm-traitée pour la culture de tissus et couvrir avec 2 mL de Diméthylpolysiloxane (DMPS5X) et place à 37 oC, 5 % de CO2, 5 % O2 et 90 % N2 s’équilibrer.
Remarque : Utilisez les plaques stériles jetables et jeter après une exposition à lentivirus. - Préparer 1 x solution de hyaluronidase au M2 moyen de la solution mère (100 x, 30 mg/mL, conserver à-20 ° C). 100 x solution-mère était établie dans l’eau.
- 24h après transduction assistée par laser des oeufs de souris fécondée, mis en place nicheurs entre vasectomie souris mâles et femelles pour préparer des souris femelles pseudo-gravides.
2. isolement des souris des oeufs fécondés
- 16 – 24 h après l’accouplement, sélectionnez souris femelles avec fiches vaginales indicatives du succès reproducteur et humainement euthanasier25. Les souris utilisées dans cette étude ont été euthanasiés par dislocation cervicale sous inhalation profonde de CO2 ou l’isoflurane.
- Isoler les ovaires et les oviductes selon des protocoles standard25.
- Transférer les ovaires et les oviductes dans un plat de 35 mm contenant les médias M2.
- Pour chaque ovaire, déchirer ampulla part pour libérer des oeufs fécondés, entourées de cellules du cumulus.
- Transfert des oeufs fécondés et les cellules du cumulus à un 35 mm plat contenant 1 hyaluronidase x dans un milieu M2 et incuber à température ambiante pendant 3 à 5 min.
- Les ovocytes fécondés pipette de haut en bas pour libérer les cellules du cumulus.
- Transférer des oeufs fécondés dans un plat de 35 mm contenant M2 médias et pipette up et down pour laver la hyaluronidase.
- Transférer des oeufs fécondés dans un plat de 35 mm, contenant HLGHW et pipette up et down à laver restant M2 médias et hyaluronidase.
- Transfert des oeufs fécondés des plaques de goutte HLGHW préparés de l’étape 1.3.
Remarque : Des oeufs de souris fécondée en HLGHW doivent être conservés dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 et 90 % N2 s’équilibrer. Enlever les plaques de l’incubateur pendant plus de 15 min se traduira par des dommages aux embryons. - Permettre des oeufs fécondés de récupérer pendant 2 h dans l’incubateur avant de passer à l’étape suivante.
3. perforation de souris fécondés avec Laser XYClone
- Configurer et calibrer XYClone laser conformément à la recommandation du manufacturier. D’autres lasers, généralement utilisés pour la fécondation in vitro , peuvent être substituées à XYClone laser perforer des oeufs fécondés.
- Attachez le fil de boîte de contrôleur laser à l’appareil laser sur le microscope.
- Fixer le boîtier de laser à l’ordinateur exécutant le logiciel laser via un port USB. 3.1.3. Branchez le contrôleur de laser et allumez-le.
- Regardant dans l’oculaire, perforer un échantillon test (p. ex. les marques effaçables à sec sur une lame de verre).
- Utilisez un petit tournevis (inclus dans le kit laser) pour ajuster le X et position Y du laser pour correspondre à la LED lumière visible à travers l’oculaire du microscope et calibrer le laser.
- Posez une plaque de goutte de HLGHW contenant des oeufs fécondée de la souris sur la platine du microscope. Ne gardez pas la plaque à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 min.
- Regardez dans l’oculaire du microscope et veiller à ce que les pellucide de l’embryon est au point et le laser LED lumière est visible.
- Déplacer la platine du microscope pour cibler le zona avec la lumière LED/laser.
- En utilisant le logiciel de l’ordinateur la valeur XYClone laser 250 μs.
- Ajuster la taille de lumière LED aux dimensions désirées (réglage 5 dans cette expérience).
- Perforer la zona de chaque œuf fécondé trois fois avec le laser. Le zona peut être percé ou aminci. Utilisez les paramètres ci-dessus, le laser va produire un trou d’un diamètre de 10 μm (Figure 2).
NOTE : Visant près du corps polaire garde laser de la cellule embryonnaire. - Permettre des oeufs fécondés de récupérer pendant 2 h dans l’incubateur de culture de tissus avant de passer à l’étape suivante.
4. transduction de souris fécondés après Perforation Laser XYClone
- Pipeter 2 μL de lentivirus concentrés (plus de titre TU/mL 1e8) dans la chute de HLGHW 50 μL. Ne pas pipeter de haut en bas. Oeufs fécondés fixer facilement à la pointe de la pipette. Basé sur notre expérience, unités de transduction 1e5-5e5 de lentivirus dans un volume inférieur à 3 μl est optimale pour la livraison de gène.
- Laissez les oeufs fécondés se transformer en blastocyste pendant 4 jours dans l’incubateur. Pas besoin de changer les médias.
5. non-chirurgicale transfert d’embryons de souris transduite à des souris enceintes Pseudo-aléatoire
- Utilisez la souris pseudopregnant, 3,5 jours après l’accouplement, préparé à l’étape 1.5.
- Utiliser le dispositif de transfert d’embryon Non-Surgical (NSET) d’implanter des embryons de souris à des souris pseudopregnant.
- À l’aide d’un microscope chirurgical ou dissection, insérer un spéculum vaginal pour visualiser le col de l’utérus.
- Insérez le périphérique de transfert d’embryon Non-Surgical (NSET) environ 5 mm dans les col de l’utérus et dépôt des embryons dans un volume d’environ 2 μL.
Remarque : Un dispositif NSET stérile est utilisé pour chaque transfert et jeté après la procédure. Tous les réactifs utilisés dans la manipulation des embryons doivent être stériles.
- Transfert de blastocyste sain de 10 – 15 2 volume μL de HLGHW pour chaque souris pseudopregnant.
- Continuer de suivre et de mesurer le gain de poids chez des souris pseudopregnant dans les jours suivants pour déterminer si le NSET a réussi.
- Récupérer des chiots en permettant les souris enceintes à accoucher naturellement ou d’effectuer une césarienne 17 jours après le transfert de l’embryon26. Une césarienne est souvent nécessaire si les embryons très peu sont présents et ils deviennent trop gros pour accouchement naturel.
- Recueillir des tissus de petits pour le génotypage déterminer le taux de transgénèse27.
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Representative Results
Développement des oeufs de souris isolé/transduites fécondée peut être vérifiée au microscope par jour (Figure 1). Santé des embryons se développent en blastocyste en 3 à 4 jours. Dans ce protocole, 60 à 70 % des embryons non traités développent en blastocyste23. Hors 114 perforé laser transduits embryons, 54 devenue blastocyste (taux de 47 %) et 46 blastocystes exprimé GFP (46/54 = 85 %)23.
Les embryons de souris ont été perforés au laser sur le jour de la récolte. Le réglage optimal pour le traitement au laser a 3 trous par oeuf fécondé et Mme 250 le laser devrait viser pour fluidifier le zona au lieu de créer un trou (Figure 2). Cela permet les embryons en développement de bénéficier d’une encapsulation intact zone pellucide tout en devenant permissive de transduction des gènes. Dans ces expériences, des embryons de souris étaient transduites avec un lentivirus recombinant qui exprime le copépode GFP (abrégé GFP) du promoteur de 1 a facteur d’élongation. Pour la transduction, uL 2 de lentivirus a été introduit dans les milieux de culture. Augmenter la quantité de virus, incidence directe sur le nombre d’embryons transduits qui exprimé GFP tandis que compromettre le développement de l’embryon dans le blastocyste23. Virales volumes de taille supérieure à 10 % du volume de goutte HLGHW porterait également atteinte formation du blastocyste (par ex. supérieure à 5 μL de virus dans une goutte de HLGHW de 50 μL).
Pour valider la viabilité, les embryons de souris transduite ont été transférés sans chirurgie à des souris pseudopregnant. Six NSET événements distincts, transfert d’un total de 58 blastocyste, a donné lieu à 9 chiots transgéniques de GFP sur total de 12, ce qui donne 75 % taux de transgénèse 23. Le protocole NSET est signalé à céder 30-35 % naissances vivantes28 comparée à 21 % de rendement qui ont été observés dans nos expériences (12/58). Le traitement des gènes peut ont joué un rôle dans le développement de l’embryon et contribué au taux de transfert d’embryon faible. Chiots avec des intégrations des gènes multiples et forte expression de la GFP ont été visuellement verts sous une lampe à LED bleue (465-470 nm) (Figure 3). Le nombre de copies GFP incorporés variait de 0 à 6 exemplaires et a été déterminée en effectuant des PCR qualitative sur l’ADN chromosomique isolé du chiot tissu23.
Figure 1 : développement de transduite souris fécondés dans Culture. Oeufs fécondée de souris C57BL/6J ont été suivis au jour 0 (oeuf fécondé récolté), jour 1 (deux cellules), jour 2 (8-16 cellules), jour 3 (morula) et jour 4 (blastocyste). Les embryons ont été transduites avec un lentivirus portant un gène de la GFP. Présence de Fluorescence dans des embryons de transduite est devenu évident par jour 2-3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Laser-traitement de souris fécondés. Exemples de perforer le zona pour produire un trou vs amincissement de la zona.
Figure 3 : des souris transgéniques exprimant des GFP. Lecteur sombre (DR Spot lampe, DRSL-9 s) servait à visualiser les chiots positives GFP dans un environnement sombre. Chiots témoins non-transgéniques ont été ajoutés au groupe pour le contraste. Chiots qui en résulte (flèches rouges) ont été génotypés et confinée de 0-6 exemplaires de la génétique des gènes/GFP.
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Discussion
La capacité des lentivirus à intégrer dans leur génome de l’hôte rend un vecteur idéal pour la livraison de gène stable. Vecteurs LENTIVIRAUX peuvent transporter jusqu'à 8,5 kilobases paire (kbp) du matériel génétique pouvant accueillir les promoteurs spécifiques des cellules ou inductibles, marqueurs de sélection ou moitiés fluorescents. Constituée de matériel génomique peut répliquer dans le cadre de leur génome de l’hôte et réglementé pour exprimer ou désactiver aux moments souhaités. Ces vecteurs permettent la maîtrise spatio-temporelle expression à divers stades de développement et de lentivirus marque comme de puissants outils pour la livraison de gène.
Transgénèse LENTIVIRAUX assistée par laser est une méthode efficace et facile à utiliser pour l’expression génique in vivo. Cette méthode peut être utilisée en vivo de production de protéines, expression d’indicateurs génétiquement encodés ou études fonctionnelles. Par rapport aux autres méthodes, livraison de gène des gènes assistée par laser est aussi efficace que la microinjection pronucléaire mais ne nécessite pas des compétences techniques ou postes de travail coûteux microinjection. Le laser XYClone est petit, portable et peuvent facilement être partagées entre plusieurs laboratoires.
Livraison de gène des gènes assistée par laser est stable et non transitoires, comme dans l’électroporation ou photoporation des oeufs fécondés. Livraison de gène transitoire est plus d’avantages pour la livraison de composants CRISPR-Cas9 ou recombinases puisque l’expression prolongée peut conduire à des conséquences aberrantes. Dans le présent protocole, les lentivirus déficiente de l’intégrase (IDLVs) peuvent être substitués pour la transduction transitoire des oeufs fécondée de la souris. IDLVs conserver l’infectivité des gènes mais seulement une fraction (moins de 8 %) de capacité intégrative d’un lentivirus29. Transgénèse LENTIVIRAUX assistée par laser est une option de livraison de gènes supplémentaires pour les utilisateurs à évaluer basé sur leur résultat souhaité.
L’inconvénient majeur de transduction des gènes est l’insertion aléatoire du gène livré. Aussi, les cellules dans l’embryon même pourraient héberger plusieurs intégrations des gènes qui mène à un mosaïcisme dans le transgénique. Le génotypage de la progéniture et plusieurs cycles de reproduction prévue sont nécessaires d’établir un animal transgénique locus unique. Les stratégies de sélection similaires sont également utilisés dans les méthodes de transgénèse classique30.
Une étape cruciale dans le présent protocole est la longueur du temps passé sur la perforation laser. Oeufs de souris fécondée cultivées en HLGHW ne peuvent être maintenus en dehors de l’incubateur pendant plus de 15 min. Un utilisateur novice doit déplacer les œufs fécondés au milieu de la M2, utiliser Advanced HLGHW embryon Medium ou limiter le nombre d’embryons par plaque. Selon nos résultats, 47 % des oeufs transduite cultivés de souris fécondés se développent en blastocystes23. Par conséquent, 30 à 40 œufs fécondés par plaque de culture assurera un nombre suffisant de blastocystes transduits dans une assiette pour le transfert à des souris pseudopregnant.
Perforation assistée par laser de la souris fécondée œuf zona peut également s’appliquer à la zona d’autres espèces et permettent l’entrée pour d’autres types de virus ou de réactifs de transfection.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros du National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Nous sommes reconnaissants à m. Robert Petrovich et le Dr Jason Williams pour une lecture critique du manuscrit et conseils utiles. Nous tenons aussi à remercier Dr. Bernd Gloss, le noyau Knockout, le Flow Cytometry Facility, la microscopie de Fluorescence et centre d’imagerie et les installations de la direction générale de la médecine Comparative du NIEHS pour leurs contributions techniques. Nous tenons à remercier M. David Goulding de la branche de médecine Comparative et Mme Lois Wyrick le centre d’imagerie du NIEHS pour nous avoir fourni les photos et illustrations.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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