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Biology

लेजर की सहायता से माउस निषेचित अंडे को Lentiviral जीन डिलिवरी

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

माउस निषेचित अंडे और प्रारंभिक चरण भ्रूण zona pellucida, एक ग्लाइकोप्रोटीन मैट्रिक्स है कि जीन वितरण के खिलाफ एक बाधा रूपों द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । यह आलेख lentiviral वैक्टर के साथ भ्रूण कोशिकाओं transduce करने के लिए और ट्रांसजेनिक चूहों बनाने के लिए एक लेजर के साथ zona वेध के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।

Abstract

Lentiviruses स्तनधारी कोशिकाओं को जीन वितरण के लिए कुशल वैक्टर हैं । transduction के बाद, lentiviral जीनोम छुरा मेजबान गुणसूत्र में शामिल किया है और संतति को पारित कर दिया है । इस प्रकार, वे स्थिर सेल लाइनों के निर्माण के लिए आदर्श वैक्टर हैं, संकेतकों के vivo वितरण में , और एक कोशिका के transduction ट्रांसजेनिक पशु बनाने के अंडे निषेचित । हालांकि, माउस निषेचित अंडे और प्रारंभिक चरण भ्रूण zona pellucida, एक ग्लाइकोप्रोटीन मैट्रिक्स है कि lentiviral जीन वितरण के खिलाफ एक बाधा रूपों द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । Lentiviruses भी zona घुसना करने के लिए बड़े हैं और आम तौर पर perivitelline गुहा में वायरल कणों के microinjection द्वारा दिया जाता है, zona और भ्रूण कोशिकाओं के बीच अंतरिक्ष. अत्यधिक कुशल प्रौद्योगिकीविदों और विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता माउस भ्रूण के लिए जीन वितरण के लिए lentiviruses के उपयोग को कम कर दिया है । यह आलेख वर्णन करता है कि माउस permeabilizing के लिए एक प्रोटोकॉल एक लेज़र के साथ zona छिद्रित अंडे निषेचित । लेजर वेध भ्रूण को किसी भी नुकसान में परिणाम नहीं है और lentiviruses जीन वितरण के लिए भ्रूण कोशिकाओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । Transduced भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट में इन विट्रो में विकसित कर सकते हैं, और अगर pseudopregnant चूहों में प्रत्यारोपित, ट्रांसजेनिक पिल्ले में विकसित. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया लेजर प्रभावी और प्रयोग करने में आसान है । lentiviruses द्वारा दिया जीन छुरा माउस भ्रूण कोशिकाओं में शामिल है और germline प्रसारणीय हैं । यह ट्रांसजेनिक चूहों कि कोई micromanipulation और निषेचित अंडे की microinjection की आवश्यकता है के निर्माण के लिए एक वैकल्पिक तरीका है ।

Introduction

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इस विधि permeabilizing के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है माउस निषेचित अंडे की zona pellucida भ्रूण कोशिकाओं lentiviruses द्वारा जीन वितरण के लिए सुलभ बनाने के लिए । Lentiviruses स्तनधारी कोशिकाओं को कुशल जीन वितरण के लिए प्रकृति द्वारा डिजाइन किए हैं । वे विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित और उनके मेजबान गुणसूत्रों में lentiviral जीनोम एकीकृत1। vesicular-जी प्रोटीन2के व्यापक stomatitis के कारण ग्लाइकोप्रोटीन VSV वायरस tropism (VSV-g) के साथ रिकॉमबिनेंट lentivirus को pseudotyping करके lentiviral होस्ट कोशिकाओं की रेंज का आसानी से विस्तार किया जाता है । transduction के बाद, lentiviral जीन छुरा और एकीकृत कर रहे है उनके मेजबान गुणसूत्रों ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाने के भाग के रूप में व्यक्त की है । अगर प्रारंभिक चरण भ्रूण कोशिकाओं को दिया, lentiviral जीनोम दोहराया और पूरे जीव में व्यक्त की है । Lentiviral transduction चूहों, चूहे, चिकन, बटेर और सुअर3,4,5,6,7 transgenics की अंय प्रजातियों के बीच के उत्पादन के लिए नेतृत्व किया है । lentiviral जीन वितरण की ठेठ विधि, तथापि, कुशल तकनीशियनों और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है zona pellucida बाधा है कि जल्दी चरण भ्रूण encapsulates पर काबू पाने । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए कैसे एक लेजर का उपयोग करने के लिए lentiviral जीन वितरण की सुविधा zona permeabilize का वर्णन है ।

स्तनधारी अंडे zona pellucida जो निषेचन के बाद polyspermy के खिलाफ निषेचित अंडे की रक्षा करने के लिए और पर्यावरण8,9बातचीत की सीमा के बाद सख्त कर रहे हैं । zona एक बाधा है कि भ्रूण कोशिकाओं से दूर lentiviruses रहता है, जब तक एक ब्लास्टोसिस्ट के रूप में रची जाती हैं । सुसंस्कृत माउस निषेचित अंडे हैच 4 दिनों के बाद और pseudopregnant चूहों में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए पहले पिल्ले में सामांय विकास के लिए सेने । इसलिए, transduction के लिए, lentiviruses perivitelline गुहा, zona और भ्रूण कोशिकाओं के बीच अंतरिक्ष में zona से सेने से पहले microinjected हैं ।

zona pellucida अक्सर में के लिए हटा दिया है इन विट्रो मानव अंडे के निषेचन के लिए निषेचन दर10वृद्धि हुई है । हालांकि, रासायनिक हटाने माउस zona pellucida प्रतिकूल माउस भ्रूण विकास को प्रभावित करता है और भ्रूण कोशिकाओं11,12के लिए हानिकारक है । जीन डिलीवरी के लिए अंय तरीके माउस निषेचित अंडे कोशिका नाभिक13में डीएनए के प्रत्यक्ष microinjection द्वारा zona pellucida बाधा पर काबू पाने के । परमाणु microinjection भ्रूण को जीन पहुंचाने का एक कुशल साधन है. हालांकि, के बाद से प्रत्येक भ्रूण microinjection के लिए व्यक्तिगत रूप से जगह में आयोजित किया जाता है, अभ्यास श्रमसाध्य और एक नौसिखिया उपयोगकर्ता के लिए समय लेने जा सकता है ।

ऐसे electroporation और photoporation के रूप में अंय तरीकों क्षणिक और अल्पकालिक जीन वितरण के लिए माउस निषेचित अंडे14,15,16के लिए उपयोगी होते हैं । इन पद्धतियों बड़े पैमाने पर CRISPR-Cas9 घटकों और recombinases देने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, जीन के electroporation और photoporation डिलिवरी को transgenics बनाने के लिए कुशलतापूर्वक इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । शुक्राणु कि पंचर माउस अधिवृषण से एकत्र कर रहे है भी lentiviruses द्वारा transduced जासकता है और इन विट्रो निषेचन के लिए इस्तेमाल के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं का उत्पादन17,18,19, 20

इस प्रोटोकॉल में, माउस भ्रूण को lentiviral जीन डिलिवरी एक लेज़र का उपयोग कर zona permeabilizing द्वारा सुविधा है । XYClone लेजर के लिए एक सहायता के रूप में विकसित किया गया था इन विट्रो निषेचन21 और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की खेती22. यह एक छोटा सा उपकरण है कि स्थापना के लिए सरल और प्रयोग करने में आसान है । एक बार एक खुर्दबीन पर स्थापित, यह एक उद्देश्य लेंस के अंतरिक्ष में रह रहे है और साथ सॉफ्टवेयर लेजर लक्ष्य के लिए अनुमति देता है, जबकि माइक्रोस्कोप eyepieces के माध्यम से देख ( प्रोटोकॉलदेखें: 3 अनुभाग) । एक बार zona XYClone लेजर द्वारा छिद्रित है, lentiviruses23जीन वितरण के लिए संस्कृति मीडिया में पेश किया जा सकता है । एकाधिक lentiviruses के लिए एक साथ गुणसूत्र निगमन के लिए कई जीन देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अलग और संस्कृति माउस निषेचित अंडे, zona pellucida के वेध के लिए लेजर का उपयोग करें दिखाता है, और lentiviruses द्वारा माउस भ्रूण कोशिकाओं के transduction दर्शाता है ।

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Protocol

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सभी पशु प्रक्रियाओं और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उपचार NIH/NIEHS पशु देखभाल दिशानिर्देश के अनुपालन में थे और पशु देखभाल और उपयोग समिति (NIH/NIEHS, पशु प्रोटोकॉल 2010-0004 पर ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. तैयारी

  1. अपनी रूचि के जीन को ले रिकॉमबिनेंट गैर-प्रचारण lentiviruses तैयार/ इस अध्ययन में, lentivirus SBI511 copepod ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (copGFP; GFP के लिए संक्षिप्त) एक बढ़ाव फैक्टर 1a प्रमोटर से transduction के लिए इस्तेमाल किया गया था । मानक प्रोटोकॉल2 का उपयोग किया गया था और titer lentiviruses पर titers उच्च 1e8 transducing यूनिट प्रति एमएल (टू/एमएल) ।
    नोट: सावधानी और ब्लीच सभी सामग्री है कि lentiviruses के साथ संपर्क में रहा है का उपयोग करें । lentiviruses के सुरक्षित उपयोग और हैंडलिंग के लिए अपने संस्थान के दिशानिर्देशों का संदर्भ लें ।
  2. सेटअप वांछित माउस के जोड़े प्रजनन भ्रूण कटाई से पहले दिन तनाव । इस प्रयोग में चूहों के C57BL/6J तनाव का प्रयोग किया गया । अंडाशय और ओवीडक्ट संग्रह के लिए इस्तेमाल महिला चूहों superovulation के लिए किसी भी हार्मोन के साथ इलाज नहीं किया गया ।
  3. 2-24 एच हार्वेस्टिंग माउस निषेचित अंडे से पहले, कई पोटेशियम सिंप्लेक्स अनुकूलित मध्यम24 (KSOM) ड्रॉप प्लेटों के रूप में इस प्रकार है: एक ३५ मिमी ऊतक संस्कृति के बीच करने के लिए KSOM मध्यम के एक ५० μL ड्रॉप जोड़ें-इलाज डिश और कवर के 2 मिलीलीटर के साथ Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) और जगह पर ३७ सी, 5% कं2, 5% o2 और ९०% N2 से equilibrate ।
    नोट: डिस्पोजेबल बाँझ प्लेट का उपयोग करें और lentiviruses के लिए निम्नलिखित जोखिम त्यागें ।
  4. शेयर समाधान से M2 माध्यम में hyaluronidase का 1x समाधान तैयार (100x, 30 मिलीग्राम/एमएल, स्टोर पर-20 ° c) । पानी में 100x स्टॉक सॉल्यूशन तैयार किया गया ।
  5. 24 एच पोस्ट लेजर-माउस निषेचित अंडे की सहायता transduction, vasectomized पुरुष और मादा चूहों के बीच प्रजनन जोड़े pseudopregnant मादा चूहों तैयार करने के लिए सेट करें ।

2. माउस निषेचित अंडे का अलगाव

  1. 16 – 24 एच पोस्ट सहवास, योनि प्लग सफल संभोग और humanely euthanize25का संकेत के साथ महिला चूहों का चयन करें. इस अध्ययन में प्रयुक्त चूहों गहरी सह2 या isoflurane साँस लेना के तहत गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा euthanized थे.
  2. अलग अंडाशय और oviducts मानक प्रोटोकॉल के अनुसार25
  3. अंडाशय और M2 मीडिया युक्त एक ३५ mm डिश के लिए oviducts स्थानांतरण ।
  4. प्रत्येक अंडाशय के लिए, मेघपुंज कोशिकाओं से घिरा निषेचित अंडे जारी करने के लिए अलग आंसू कलसा ।
  5. निषेचित अंडे और मेघपुंज कोशिकाओं एक ३५ mm के लिए M2 मध्यम में 1x hyaluronidase युक्त पकवान स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 3 के लिए गर्मी-5 मिनट ।
  6. प्लास्टिक निषेचित अंडे ऊपर और नीचे मेघपुंज कोशिकाओं को रिहा करने के लिए ।
  7. स्थानांतरण के लिए एक ३५ मिमी डिश युक्त अंडे के लिए निषेचित मीडिया और प्लास्टिक ऊपर और नीचे hyaluronidase से धो लो ।
  8. एक ३५ mm KSOM युक्त पकवान को निषेचित अंडे हस्तांतरण और प्लास्टिक ऊपर और नीचे शेष M2 मीडिया और hyaluronidase से धो लो ।
  9. १.३ कदम से तैयार KSOM ड्रॉप प्लेट्स निषेचित अंडे हस्तांतरण ।
    नोट: माउस निषेचित अंडे KSOM में एक ऊतक संस्कृति मशीन में रखा जाना चाहिए ३७ ° c, 5% सह2, 5% O2 और ९०% N2 equilibrate करने के लिए । अब से 15 मिनट के लिए मशीन से प्लेटें निकालना भ्रूण को नुकसान में परिणाम होगा ।
  10. निषेचित अंडे को अगले कदम पर जाने से पहले मशीन में 2 एच के लिए ठीक होने की अनुमति दें ।

3. XYClone लेजर के साथ माउस निषेचित अंडे का वेध

  1. सेटअप और निर्माता की सिफारिश के अनुसार XYClone लेजर जांचना । अंय पराबैंगनीकिरण, आमतौर पर इन विट्रो निषेचन के लिए इस्तेमाल किया, XYClone लेजर के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है छिद्रित अंडे निषेचित ।
    1. खुर्दबीन पर लेजर उपकरण के लिए लेजर नियंत्रक बॉक्स तार देते हैं ।
    2. एक यूएसबी पोर्ट के माध्यम से लेजर सॉफ्टवेयर चलाने के कंप्यूटर के लिए लेजर नियंत्रक बॉक्स संलग्न करें । 3.1.3. लेजर नियंत्रक में प्लग और पर यह स्विच ।
    3. ऐपिस के माध्यम से खोज, एक परीक्षण नमूना वेध (जैसे सूखी-एक गिलास स्लाइड पर निशान मिटा) ।
    4. एक छोटा सा पेंच ड्राइवर का प्रयोग करें (लेजर किट में शामिल) के लिए लेजर के एक्स और वाई की स्थिति को समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप ऐपिस के माध्यम से दिखाई एलईडी प्रकाश मैच और लेजर जांचना ।
  2. एक KSOM ड्रॉप प्लेट वाले माउस को माइक्रोस्कोप स्टेज पर निषेचित अंडे रखें । प्लेट मशीन के बाहर नहीं रखने के लिए अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए ।
  3. माइक्रोस्कोप ऐपिस के माध्यम से देखो और सुनिश्चित करें कि भ्रूण की zona pellucida ध्यान में है और लेजर एलईडी प्रकाश दिखाई दे रहा है ।
  4. एलईडी लाइट के साथ zona को लक्षित करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाएँ/
  5. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग XYClone लेजर २५० μs के लिए सेट करें ।
  6. (इस प्रयोग में 5 सेट) वांछित आयामों के लिए एलईडी लाइट आकार समायोजित करें ।
  7. प्रत्येक निषेचित अंडे के zona लेजर के साथ तीन छिद्र । zona या तो छेदा या thinned किया जा सकता है । ऊपर सेटिंग्स का उपयोग करना, लेजर 10 माइक्रोन (चित्रा 2) के एक व्यास के साथ एक छेद का उत्पादन होगा ।
    नोट: ध्रुवीय शरीर के करीब लक्ष्य लेजर भ्रूण कोशिका से दूर रखता है ।
  8. निषेचित अंडे को अगले कदम पर जाने से पहले ऊतक संस्कृति मशीन में 2 एच के लिए ठीक होने की अनुमति दें ।

4. माउस निषेचित अंडे के Transduction XYClone लेजर वेध निंनलिखित

  1. प्लास्टिक 2 μL ऑफ केंद्रित lentivirus (अधिक से अधिक 1e8 TU/एमएल titer) में ५० μL KSOM ड्रॉप । ऊपर और नीचे मत प्लास्टिक । निषेचित अंडे आसानी से प्लास्टिक टिप को देते हैं । हमारे अनुभव के आधार पर, 1e5-5e5 transducing इकाइयों में lentivirus की एक मात्रा से कम 3 μL जीन डिलिवरी के लिए इष्टतम है ।
  2. निषेचित अंडे ब्लास्टोसिस्ट में मशीन में 4 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दें । मीडिया को बदलने की जरूरत नहीं ।

5. छद्म गर्भवती चूहों को Transduced माउस भ्रूण के गैर सर्जिकल हस्तांतरण

  1. pseudopregnant चूहों का प्रयोग करें, ३.५ दिन सहवास के बाद, १.५ चरण में तैयार.
  2. pseudopregnant चूहों में माउस भ्रूण प्रत्यारोपण करने के लिए गैर सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण (NSET) डिवाइस का उपयोग करें ।
    1. एक शल्य चिकित्सा या विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग, गर्भाशय ग्रीवा कल्पना करने के लिए एक योनि जांच पड़ताल डालें ।
    2. लगभग 2 μL की मात्रा में गर्भाशय ग्रीवा और जमा भ्रूण में गैर सर्जिकल भ्रूण हस्तांतरण (NSET) डिवाइस लगभग 5 मिमी डालें ।
      नोट: एक बाँझ NSET डिवाइस प्रत्येक स्थानांतरण के लिए उपयोग किया जाता है और प्रक्रिया के बाद छोड़ दिया है । भ्रूण के हेरफेर में इस्तेमाल होने वाले सभी रिएजेंट बाँझ होने चाहिए.
  3. प्रत्येक pseudopregnant चूहों को KSOM के 2 μL आयतन में 10 – 15 स्वस्थ ब्लास्टोसिस्ट का अंतरण.
  4. पर नजर रखने और pseudopregnant चूहों में वजन बढ़ाने के उपाय करने के लिए निम्न दिनों में निर्धारित करें कि क्या NSET सफल रहा था.
  5. गर्भवती चूहों को स्वाभाविक रूप से जन्म देने या भ्रूण हस्तांतरण26के बाद एक सीजेरियन धारा 17 दिनों के प्रदर्शन की अनुमति देकर पिल्ले ठीक. एक सी खंड अक्सर आवश्यक है अगर बहुत कुछ भ्रूण मौजूद है और वे प्राकृतिक जंम के लिए बहुत बड़ा हो जाना ।
  6. transgenesis27की दर निर्धारित करने के लिए genotyping के लिए पिल्ले से ऊतक ले लीजिए ।

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Representative Results

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अलग/transduced माउस निषेचित अंडे के विकास के तहत जांच की जा सकती माइक्रोस्कोप दैनिक (चित्रा 1) । स्वस्थ भ्रूण 3 के भीतर ब्लास्टोसिस्ट में विकसित-4 दिन । इस प्रोटोकॉल में, 60-अनुपचारित भ्रूण के 70%23ब्लास्टोसिस्ट में विकसित । ११४ लेजर छिद्रित transduced भ्रूण के बाहर, ५४ ब्लास्टोसिस्ट में विकसित (४७% की दर) और ४६ blastocysts व्यक्त GFP (46/54 = 85%)23

चूहा भ्रूण फसल के दिन लेजर छिद्रित थे । लेजर उपचार के लिए इष्टतम सेटिंग निषेचित अंडे और २५० के प्रति 3 छेद था सुश्री लेजर के बजाय एक छेद (चित्रा 2) बनाने के zona पतली करने के उद्देश्य से किया जाना चाहिए । यह विकासशील भ्रूण एक बरकरार encapsulating zona pellucida से लाभ के लिए अनुमति देता है, जबकि lentiviral transduction के लिए स्वतंत्र बनने । इन प्रयोगों में, माउस भ्रूण एक रिकॉमबिनेंट lentivirus कि एक बढ़ाव कारक 1a प्रमोटर से copepod GFP (संक्षिप्त GFP) व्यक्त के साथ transduced थे । transduction के लिए, lentivirus के 2 उल संस्कृति मीडिया में शुरू की गई थी । वायरस की मात्रा में वृद्धि, सीधे transduced भ्रूण है कि GFP व्यक्त की संख्या में प्रभावित है जबकि ब्लास्टोसिस्ट23में प्रतिकूल भ्रूण विकास को प्रभावित । वायरल KSOM ड्रॉप की मात्रा के 10% से बड़ा भी प्रतिकूल ब्लास्टोसिस्ट गठन को प्रभावित करेगा (उदाहरण के लिए एक ५० μL KSOM ड्रॉप में वायरस के 5 μL से अधिक) ।

व्यवहार्यता को मांय करने के लिए, transduced माउस भ्रूण गैर शल्य चिकित्सा pseudopregnant चूहों को हस्तांतरित किया गया । छह अलग NSET घटनाओं, ५८ ब्लास्टोसिस्ट की कुल स्थानांतरित, 12 के कुल के बाहर 9 GFP ट्रांसजेनिक पिल्ले के परिणामस्वरूप, transgenesis 23की ७५% की दर से उपज । NSET प्रोटोकॉल 30-35% जीवित जंम28 21% उपज है कि हमारे प्रयोगों (12/58) में मनाया गया की तुलना में उपज की सूचना है । lentiviral उपचार भ्रूण विकास में एक भूमिका निभाई है और कम भ्रूण हस्तांतरण दर में योगदान कर सकते हैं । कई lentiviral एकीकरण और GFP की उच्च अभिव्यक्ति के साथ पिल्ले नेत्रहीन हरे रंग के तहत एक नीली एलईडी लैंप (465-470 एनएम) (चित्रा 3) थे । शामिल GFP प्रतियां की संख्या 0-6 प्रतियां से लेकर और पिल्ला ऊतक23से अलग गुणसूत्र डीएनए पर गुणात्मक पीसीआर प्रदर्शन से निर्धारित किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: Transduced माउस का विकास संस्कृति में अंडे निषेचित । C57BL/6J माउस निषेचित अंडे 0 दिन पर नजर रखी गई (काटा निषेचित अंडा), 1 दिन (दो सेल), दिन 2 (8-16 कोशिकाओं), 3 दिन (मोरूला), और 4 दिन (ब्लास्टोसिस्ट) । भ्रूण एक GFP जीन ले lentivirus के साथ transduced थे । transduced भ्रूण में प्रतिदीप्ति की उपस्थिति दिन 2-3 से स्पष्ट हो गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: लेजर-माउस निषेचित अंडे का उपचार । zona वेध के उदाहरण zona के thinning बनाम एक छेद का उत्पादन करने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसजेनिक चूहों GFP व्यक्त । डार्क रीडर (डॉ स्पॉट लैंप, DRSL-9एस) एक अंधेरे वातावरण में GFP सकारात्मक पिल्ले कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कंट्रास्ट के लिए ग्रुप में नॉन-ट्रांसजेनिक कंट्रोल पिल्लर जोड़े गए थे । परिणामी पिल्ले (लाल तीर) genotyped थे और lentiviral जीन की 0-6 प्रतियां से समाहित/GFP ।

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Discussion

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lentiviruses की क्षमता को अपने मेजबान जीनोम में एकीकृत उंहें स्थिर जीन वितरण के लिए एक आदर्श वेक्टर बनाता है । Lentiviral वैक्टर अप करने के लिए ले जा सकते है ८.५ kilobase जोड़ी आनुवंशिक सामग्री है कि सेल विशिष्ट या inducible प्रवर्तकों, चयन मार्कर, या फ्लोरोसेंट moieties समायोजित कर सकते है की (kbp) । शामिल जीनोमिक सामग्री अपने मेजबान जीनोम के भाग के रूप में दोहराने और व्यक्त या वांछित समय बिंदुओं पर निष्क्रिय विनियमित कर सकते हैं । इन वैक्टर जीन वितरण के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकास और ब्रांड lentiviruses के विभिंन चरणों में जीन अभिव्यक्ति पर spatiotemporal नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं ।

लेजर असिस्टेड lentiviral transgenesis vivo मेंजीन एक्सप्रेशन के लिए एक कारगर और आसान-से-उपयोग की विधि है । इस विधि के लिए vivo प्रोटीन उत्पादन, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतक, या कार्यात्मक अध्ययन की अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय तरीकों की तुलना में, लेजर सहायता lentiviral जीन वितरण परमाणु microinjection के रूप में के रूप में प्रभावी है, लेकिन कोई तकनीकी कौशल या महंगा microinjection कार्यस्थानों की आवश्यकता है । XYClone लेजर छोटे, पोर्टेबल है, और आसानी से कई प्रयोगशालाओं के बीच साझा किया जा सकता है ।

लेजर की सहायता से lentiviral जीन वितरण स्थिर और परिवर्तनीय नहीं है, के रूप में electroporation या निषेचित अंडे की photoporation में । क्षणिक जीन वितरण CRISPR-Cas9 घटकों या recombinases के वितरण के लिए अधिक लाभ के बाद से विस्तारित अभिव्यक्ति ंयायपालिका परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकता है । इस प्रोटोकॉल में, integrase कमी lentiviruses (IDLVs) माउस निषेचित अंडे के क्षणिक transduction के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । IDLVs बनाए रखने के lentiviral infectivity लेकिन केवल एक अंश (lentiviruses29के एकीकृत क्षमता के कम से 8%) बनाए रखने के । लेजर की सहायता से lentiviral transgenesis उपयोगकर्ताओं के लिए एक अतिरिक्त जीन वितरण विकल्प है जो उनके वांछित परिणाम के आधार पर मूल्यांकन करता है ।

lentiviral transduction के प्रमुख नुकसान दिया जीन के यादृच्छिक प्रविष्टि है । इसके अलावा, एक ही भ्रूण के भीतर कोशिकाओं को कई lentiviral एकीकरण कि ट्रांसजेनिक में मोज़ेक की ओर जाता है मेजबान सकता है । संतान की Genotyping और नियोजित प्रजनन के अनेक दौर में एक एकल लोकस ट्रांसजेनिक पशु की स्थापना आवश्यक है. इसी तरह की प्रजनन कार्यनीतियां भी परम्परागत transgenesis पद्धतियों में कार्यरत हैं30.

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम लेजर वेध पर खर्च समय की लंबाई है । माउस निषेचित अंडे KSOM में प्रसंस्कृत से अधिक समय के लिए मशीन के बाहर नहीं रखा जा सकता है 15 मिनट । एक नौसिखिया उपयोगकर्ता M2 माध्यम के लिए निषेचित अंडे कदम, उंनत KSOM भ्रूण माध्यम का उपयोग करें, या थाली प्रति भ्रूण की संख्या सीमित करना चाहिए । हमारे परिणाम के अनुसार, transduced के ४७% प्रसंस्कृत माउस निषेचित अंडे blastocysts में विकसित23। इसलिए, संवर्धन 30-40 निषेचित अंडे थाली प्रति pseudopregnant चूहों में हस्तांतरण के लिए एक थाली में transduced blastocysts की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करेगा ।

लेजर की सहायता से वेध माउस निषेचित अंडा zona अन्य प्रजातियों के zona पर भी लागू हो सकता है और अन्य प्रकार के वायरस या अभिकर्मक रिएजेंट के लिए प्रवेश की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH), राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया । हम डॉ रॉबर्ट Petrovich और पांडुलिपि और उपयोगी सलाह के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ जेसन विलियंस के आभारी हैं । हम यह भी स्वीकार करते है और डॉ. बर्न ग्लॉस, नॉकआउट कोर, फ्लो Cytometry सुविधा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर, और उनके तकनीकी योगदान के लिए NIEHS की तुलनात्मक दवा शाखा सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम तुलनात्मक चिकित्सा शाखा और सुश्री Lois Wyrick इमेजिंग केंद्र के NIEHS पर हमें तस्वीरें और चित्र के साथ उपलब्ध कराने के लिए से श्री डेविड Goulding शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443, (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
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लेजर की सहायता से माउस निषेचित अंडे को Lentiviral जीन डिलिवरी
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Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).

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