Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Laser-assistert Lentiviral gen levering til musen befruktede egg

doi: 10.3791/58327 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Mus befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot gen levering. Denne artikkelen beskriver en protokoll for perforating i zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og opprette transgene mus.

Abstract

Lentiviruses er effektiv vektorer for gen levering til pattedyrceller. Etter transduction, lentiviral genomet er stabilt integrert i det vert kromosomet og sendes videre til avkom. Dermed er de ideelle vektorer for etablering av stabil cellelinjer, i vivo levering av indikatorer og Albin på én celle befruktet egg til å opprette transgene dyr. Men musen befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot lentiviral gen levering. Lentiviruses er for store til å trenge zona og er vanligvis levert av microinjection av virus partikler i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler. Behovet for svært dyktige teknikere og spesialisert utstyr har minimert bruken av lentiviruses genet levering til mouse embryoer. Denne artikkelen beskriver en protokoll for permeabilizing musen befruktet egg av perforating i zona med en laser. Laser-perforering resultere ikke i skade å embryoer og lar lentiviruses å få tilgang til embryonale celler for gen levering. Transduced embryo kan utvikle seg til blastocysten i vitro, og hvis implantert i pseudopregnant mus, utvikle seg til transgene pups. Laseren som brukes i denne protokollen er effektivt og brukervennlig. Gener levert av lentiviruses stabilt innlemme i mus embryonale celler og er germline overført. Dette er en alternativ metode for oppretting av transgene mus som krever ingen micromanipulation og microinjection av befruktet egg.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metoden gir detaljerte instruksjoner for permeabilizing zona pellucida musen befruktet egg å gjøre embryonale celler tilgjengelig for gen levering av lentiviruses. Lentiviruses er designet av naturen for effektiv gen levering til pattedyrceller. De infisere dele og ikke dele celler og integrere lentiviral genomet i deres vert kromosomene1. Lentiviral vert celleområdet utvides lett ved pseudotyping av rekombinant lentivirus med vesicular stomatitt virus glykoprotein (VSV-G), på grunn av den brede tropism VSV-G protein2. Etter transduction, lentiviral gener er stabilt integrert og uttrykt som en del av deres vert kromosomene skaper et ideelt verktøy for generering av transgene dyr. Hvis leveres til tidlig stadium embryonale celler, er lentiviral genomet replikert og uttrykt i hele organismen. Lentiviral signaltransduksjon har ført til at mus, rotte, kylling, Vaktel, og gris3,4,5,6,7 blant andre arter av transgenics. Den typiske metoden for lentiviral gen levering, men krever dyktige teknikere og spesialisert utstyr for å overvinne den zona pellucida barrieren som omslutter de tidlig stadium embryoene. Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive hvordan permeabilize zona bruker en laser til å lette lentiviral gen levering.

Pattedyr egg er omgitt av den zona pellucida som stivner etter befruktning å beskytte befruktede egg mot polyspermy og begrense miljømessige interaksjoner8,9. Zona danner en barriere som holder lentiviruses fra embryonale celler før embryoene er klekket som en blastocyst. Kultivert musen befruktede eggene klekkes etter 4 dager og må bli implantert i pseudopregnant mus før klekking for normal utvikling i pups. Derfor for transduction, er lentiviruses microinjected før klekking fra zona i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler.

Den zona pellucida er ofte fjernet for i vitro befruktning av menneskelig egg å øke befruktning rate10. Imidlertid kjemiske fjerning av musen zona pellucida negativt påvirker musen embryo utvikling og er skadelig for embryonale celler11,12. Andre metoder for gen levering til musen befruktet egg overvinne zona pellucida barrieren av direkte microinjection DNA i cellen kjernen13. Pronuclear microinjection er en effektiv måte å levere gener til embryoer. Siden hver embryoet holdes på plass for microinjection, kan imidlertid praksis arbeidskrevende og tidkrevende for en nybegynner.

Andre metoder som electroporation og photoporation er nyttig for forbigående kortsiktige gen levering til musen befruktet egg14,15,16. Disse metodene er mye brukt for å levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Imidlertid kan ikke electroporation og photoporation levering av gener brukes effektivt til å opprette transgenics. Spermatozoa som er samlet inn fra punktert musen bitestikkel kan også transduced av lentiviruses og gjelder i vitro fertilisering produsere transgene dyr17,18,19, 20.

I denne protokollen, er lentiviral gen levering til mouse embryoer tilrettelagt av permeabilizing zona ved hjelp av en laser. XYClone laser ble utviklet som et hjelpemiddel i vitro fertilisering21 og dyrking av embryonale stamceller22. Det er en liten apparater som er enkel å konfigurere og enkel å bruke. Når installert på et mikroskop, det opptar for en linsen og den medfølgende programvaren tillater sikter laser mens du ser gjennom mikroskop okularene (se protokoll: avsnitt 3). Når zona er perforert av XYClone laser, kan lentiviruses bli introdusert i kultur media for gen levering23. Flere lentiviruses kan brukes samtidig levere flere gener for chromosomal innlemmelse.

Denne protokollen vil beskrive hvordan du isolerer og kultur mus befruktede egg, illustrerer bruken av laser for perforering av zona pellucida, og demonstrerer signaltransduksjon mus embryonale celler ved lentiviruses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr prosedyrer og behandlinger i denne protokollen ble fulgt NIH/NIEHS dyr omsorg retningslinjene og ble godkjent av dyr omsorg og bruk Committee (ACUC) på NIH/NIEHS, dyr protokollen 2010-0004.

1. forberedelser

  1. Forberede/kjøpe rekombinant ikke-spre lentiviruses bærer din genet av interesse. I denne studien, lentivirus SBI511 uttrykke hele grønne fluorescerende protein (copGFP, forkortet til GFP) fra en forlengelse faktor 1a promoter ble brukt for signaltransduksjon. Standardprotokoller2 ble brukt til å produsere og titer lentiviruses på titers høyere enn 1e8 transducing enheter per mL (TU/mL).
    Merk: Vær forsiktig og bleke alt materiale som har vært i kontakt med lentiviruses. Se din instituttets retningslinjer for sikker bruk og håndtering av lentiviruses.
  2. Oppsett av hekkende par ønsket musen belaste dagen før høsting embryoer. I dette eksperimentet, ble C57BL/6J belastningen av mus brukt. Kvinnelige mus eggstokkene og oviduct samlingen ble ikke behandlet med noen hormoner for superovulation.
  3. 2-24 h før høsting mus befruktet egg, forberede flere kalium Simplex optimalisert Medium24 (KSOM) slipp plater som følger: Legg en 50 μL miste av KSOM medium til midten av en 35 mm vev kultur-behandlet rett og dekk med 2 mL Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) og sted på 37 oC, 5% CO2, 5% O2 og 90% N2 equilibrate.
    Merk: Bruk disponibel sterilt plater og kast etter eksponering for lentiviruses.
  4. Forberede 1 x løsning av hyaluronidase M2 medium fra lagerløsning (100 x, 30 mg/mL, lagre på 20 ° C). 100 x lagerløsning ble utarbeidet i vann.
  5. 24 h legge laser-assistert signaltransduksjon musen befruktet egg, definere hekkende par mellom vasectomized mannlige og kvinnelige mus å forberede pseudopregnant kvinnelige mus.

2. isolering av musen befruktede egg

  1. 16-24 h innlegget parring, Velg kvinnelige mus med vaginal plugger indikativ av vellykket mating og euthanize Human25. Musene som brukes i denne studien var euthanized av cervical forvridning under dyp CO2 eller isoflurane innånding.
  2. Isolere eggstokkene og oviducts ifølge standardprotokoller25.
  3. Overføre eggstokkene og oviducts til en 35 mm rett som inneholder M2 media.
  4. For hver eggstokk, rive ampulla fra hverandre for å frigjøre befruktede egg omgitt av cumulus celler.
  5. Overføre befruktede egg og cumulus celler til 35 mm rett som inneholder 1 x hyaluronidase M2 medium og ruge ved romtemperatur for 3-5 minutter.
  6. Pipetter befruktede egg opp og ned å løslate cumulus cellene.
  7. Overføre befruktede egg til en 35 mm rett som inneholder M2 media og Pipetter opp og ned for å vaske av hyaluronidase.
  8. Overføre befruktede egg til en 35 mm rett som inneholder KSOM og Pipetter opp og ned for å vaske av gjenværende M2 media og hyaluronidase.
  9. Overføre befruktede egg til forberedt KSOM slipp platene fra trinn 1.3.
    Merk: Mus befruktet egg i KSOM holdes i en vev kultur inkubator på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 og 90% N2 til equilibrate. Fjerne plater settefiskanlegg i mer enn 15 min vil resultere i skade embryoer.
  10. Tillate befruktede egg å gjenopprette for 2t i inkubator før du går til neste trinn.

3. perforering mus befruktede egg med XYClone Laser

  1. Setup og kalibrere XYClone laser i henhold til produsentens anbefaling. Andre lasere, vanligvis brukt for i vitro fertilisering, kan erstatte XYClone laseren autoperforering befruktede egg.
    1. Fest laser kontrolleren for ledningen til laser apparatet på mikroskopet.
    2. Fest boksen laser kontrolleren til datamaskinen som kjører laser programvaren via en USB-port. 3.1.3. Koble laser kontrolleren og slå den på.
    3. Ser gjennom okularet, autoperforering en testprøven (f.eks tørr-viske merking på et glass lysbilde).
    4. Bruk en liten skrutrekker (inkludert i laser kit) til å justere X og Y posisjon av laser tilsvarer LED lys synlig gjennom mikroskop okularet og kalibrere laser.
  2. Plass en KSOM slipp plate inneholder musen befruktet egg på mikroskopet scenen. Ikke Oppbevar platen utenfor inkubator lenger enn 15 min.
  3. Se gjennom mikroskopet okularet og sikre at fosterets zona pellucida er i fokus og laser lampe er synlig.
  4. Flytte mikroskop scenen å målrette zona med LED lys/laser.
  5. Bruke dataprogrammer satt XYClone laser til 250 μs.
  6. Justere LED lys størrelsen til ønskede dimensjoner (angi 5 i dette eksperimentet).
  7. Perforere zona hver befruktede egg thrice med laser. Zona kan enten gjennomboret eller tynnet. Med innstillingene ovenfor, vil laser produsere et hull med en diameter på 10 μm (figur 2).
    Merk: Sikte nær polar kroppen holder laser fra embryonale cellen.
  8. Tillate befruktede egg å gjenopprette for 2t i vev kultur inkubator før du går til neste trinn.

4. signaltransduksjon mus befruktet egg etter XYClone Laser perforering

  1. Pipetter 2 μL konsentrert lentivirus (større enn 1e8 TU/mL titer) i 50 μL KSOM fall. Gjør ikke Pipetter opp og ned. Befruktede eggene knytte lett til Pipetter spissen. Basert på vår erfaring, 1e5-5e5 transducing enheter av lentivirus i et volum mindre enn 3 μL er optimal for gen levering.
  2. Tillate befruktede egg å utvikle i blastocysten 4 dager i inkubator. Du trenger ikke å endre media.

5. ikke-kirurgisk overføring av Transduced Mouse embryoer til pseudo gravid mus

  1. Bruk pseudopregnant mus, 3,5 dagen etter parring, utarbeidet i trinn 1.5.
  2. Bruk ikke-kirurgisk Embryo overføre (NSET) enheten til implantatet mouse embryoer i pseudopregnant mus.
    1. Bruke en kirurgisk eller dissekere mikroskop, sette en vaginal spekulum visualisere livmorhalsen.
    2. Ikke-kirurgisk Embryo overføre (NSET) enheten ca 5 mm inn i livmorhalsen og innskudd embryo i et volum på ca 2 μL.
      Merk: Et sterilt NSET enheten er brukt for hver overføring og forkastet etter inngrepet. Reagenser i manipulering av embryoene må sterilt.
  3. Overfør 10-15 sunn blastocysten i 2 μL volum av KSOM til hver pseudopregnant mus.
  4. Fortsette å overvåke og måle vektøkning i pseudopregnant mus i følgende dager å finne ut om NSET var vellykket.
  5. Gjenopprette pups ved at gravide mus å føde naturlig eller utføre et keisersnitt 17 dager etter at fosteret overfører26. En c-delen er ofte nødvendig hvis svært få embryo finnes og de vokser for stor for naturlig fødsel.
  6. Samle vev fra pups for genotyperingteknologi å bestemme frekvensen av transgenesis27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utviklingen av isolert/transduced musen befruktet egg kan kontrolleres under mikroskopet daglig (figur 1). Sunn embryo utvikle i blastocysten innen 3-4 dager. Denne protokollen utvikle 60-70% av ubehandlet embryo i blastocysten23. Ut av 114 laser-perforert transduced embryoer, 54 utviklet i blastocysten (hastighet på 47%) og 46 blastocysts uttrykt GFP (46/54 = 85%)23.

Mouse embryoer var laser-perforert ved harvest. Den optimale innstillingen for laserbehandling var 3 hull pr befruktet egg og 250 ms. laser bør sikte tynn zona i stedet for å lage et hull (figur 2). Dermed kan de utvikle embryoene til nytte en intakt encapsulating zona pellucida mens bli ettergivende til lentiviral signaltransduksjon. I disse eksperimentene, ble mouse embryoer transduced med en rekombinant lentivirus som uttrykt i det hele GFP (forkortet GFP) fra en forlengelse faktor 1a promoter. For transduction, ble 2 uL av lentivirus introdusert i kultur media. Øke mengden av virus, berørt direkte antall transduced embryo som uttrykt GFP mens negativ påvirker embryo utvikling i blastocysten23. Viral volumer større enn 10% av KSOM slipp volum vil også påvirke blastocysten dannelse (f.eks større enn 5 μL virus i et 50 μL KSOM fall).

For å validere levedyktighet, overført transduced mouse embryoer ikke-kirurgisk til pseudopregnant mus. Seks NSET hendelser, overføre totalt 58 blastocysten, resulterte i 9 GFP transgene pups av totalt 12, gir 75% rente transgenesis 23. NSET protokollen rapporteres til 30-35% levendefødte28 sammenlignet med 21% avkastning som ble observert i vår eksperimenter (12/58). Lentiviral behandling kan ha spilt en rolle i embryo utvikling og bidratt til lav embryoet overføringshastigheten. Pups med flere lentiviral integrasjoner og høy uttrykk for GFP var visuelt grønne under en blå LED-lampe (465-470 nm) (Figur 3). Antall innarbeidet GFP Kopier varierte fra 0-6 eksemplarer og ble bestemt ved å utføre kvalitativ PCR på isolerte chromosomal DNA fra pup vev23.

Figure 1
Figur 1: utvikling av Transduced musen befruktede egg i kultur. C57BL/6J musen befruktet egg var overvåket på dag 0 (høstet befruktede egg), dag 1 (to-celle) dag 2 (8-16 celler), dag 3 (morulastadiet) og dag 4 (blastocysten). Embryo var transduced med en lentivirus som bærer et GFP gen. Tilstedeværelsen av fluorescens i transduced embryoer ble klart dagen 2-3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Laser behandling av musen befruktede egg. Eksempler på perforating zona å produsere et hull vs fortynning av zona.

Figure 3
Figur 3: transgene mus uttrykke GFP. Mørk leseren (DR Spot-lampe, DRSL-9S) ble brukt til å visualisere GFP positive pups i et mørkt miljø. Non-transgene kontroll pups ble lagt til gruppen for kontrast. Resulterende pups (røde piler) var genotyped og inneholdt fra 0-6 kopier av i lentiviral gen/GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evne til lentiviruses å integrere deres vert genomet gjør dem en ideell vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære opptil 8,5 kilobase par (kbp) av genetisk materiale som rommer celle-spesifikke eller induserbart arrangører, markørene eller fluorescerende moieties. Genomisk materiale replikeres som del av deres vert genom og reguleres uttrykkelig eller deaktivere på ønsket tidspunkt. Disse vektorer tillate spatiotemporal kontroll over genuttrykk på ulike stadier av utvikling og merkevare lentiviruses som kraftige verktøy for gen levering.

Laser-assistert lentiviral transgenesis er en effektiv og lett-å-bruke metode for genet uttrykk i vivo. Denne metoden kan brukes for i vivo protein produksjon, uttrykk for genetisk kodet indikatorer eller funksjonelle studier. Sammenlignet med andre metoder, laser-assistert lentiviral gen levering er like effektivt som pronuclear microinjection men krever ingen tekniske ferdigheter eller kostbare microinjection arbeidsstasjoner. XYClone laser er liten, transportabel, og kan enkelt deles blant flere laboratorier.

Laser-assistert lentiviral gen levering er stabil og ikke forbigående, som electroporation eller photoporation av befruktet egg. Forbigående gen levering er flere fordeler for levering av CRISPR-Cas9 komponenter eller recombinases siden utvidet uttrykk kan føre til avvikende konsekvenser. I denne protokollen, kan integrase mangelfull lentiviruses (IDLVs) erstatte forbigående signaltransduksjon musen befruktede egg. IDLVs beholder lentiviral infectivity men bare beholde en brøkdel (mindre enn 8%) av integrerende evne lentiviruses29. Laser-assistert lentiviral transgenesis er et ekstra gen leveringsalternativ for brukernes å vurdere basert på deres ønsket utfall.

Den store ulempen med lentiviral signaltransduksjon er tilfeldige innsetting av leverte genet. Celler i samme fosteret kan også være vert flere lentiviral integrasjoner som fører til mosaicism i den transgene. Genotyperingteknologi av avkommet og flere runder med planlagte formering er nødvendig for å etablere en enkelt locus transgene dyr. Lignende avl strategier er også ansatt i konvensjonelle transgenesis metoder30.

Et viktig skritt i denne protokollen er tiden brukt på laser perforering. Musen befruktet egg kultivert i KSOM kan ikke holdes utenfor inkubator lenger enn 15 min. En nybegynner bør flytte befruktede eggene til M2 middels, bruke avansert KSOM Embryo Medium eller begrense hvor mange embryoer per plate. Ifølge våre resultat utvikle 47% av transduced kulturperler musen befruktet egg i blastocysts23. Derfor vil dyrking 30-40 befruktede egg per plate sikre tilstrekkelig antall transduced blastocysts i en plate for overføring til pseudopregnant mus.

Laser-assistert perforering av musen befruktet egg zona kan også gjelde zona av andre arter og tillatelsesoppføring for andre typer virus eller hva reagenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er takknemlige til Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams for kritisk lesing av manuskriptet og nyttige råd. Vi ønsker også å erkjenne og takker Dr. Bernd Gloss, Knockout kjernen, Flow cytometri anlegget, fluorescens mikroskopi og Imaging Center og komparativ medisin gren fasiliteter i NIEHS for deres teknisk bidrag. Vi vil gjerne takke Mr. David Goulding i sammenlignende medisin grenen og Ms. Lois Wyrick av Imaging Center på NIEHS for å gi oss med bilder og illustrasjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD510B-1 plasmid System Biosciences CD510B-1 used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane Sigma DMPS5X culturing embryos
hyaluronidase Sigma H3506 used to remove cumulus cells
XYClone Laser Hamilton Thorne Biosciences perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device ParaTechs 60010 NSET of embryos
KSOM medium Millipore MR-020P-5F culturing embryos
Composition of KSOM: mg/100mL
NaCl 555
KCl 18.5
KH2PO4 4.75
MgSO4 7H2O 4.95
CaCl2 2H2O 25
NaHCO3 210
Glucose 3.6
Na-Pyruvate 2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt 0.174mL
10 mM EDTA 100µL
Streptomycin 5
Penicillin 6.3
0.5% phenol red 0.1mL
L-Glutamine 14.6
MEM Essential Amino Acids 1mL
MEM Non-essential AA 0.5mL
BSA 100
M2 medium Millipore MR-015-D culturing embryos
Composition of M2: mg/100mL
Calcium Chloride 25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous) 16.5
Potassium Chloride 35.6
Potassium Phosphate, Monobasic 16.2
Sodium Bicarbonate 35
Sodium Chloride 553.2
Albumin, Bovine Fraction 400
D-Glucose 100
Na-HEPES 54.3
Phenol Red 1.1
Pyruvic Acid 3.6
DL-Lactic Acid 295

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443, (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15, (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7, (4), e35335 (2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7, (12), e50817 (2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13, (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2, (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74, (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77, (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6, (11), e27677 (2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99, (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79, (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28, (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9, (3), e91892 (2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27, (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006, (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23, (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14, (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82, (14), 7111-7119 (2008).
Laser-assistert Lentiviral gen levering til musen befruktede egg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).More

Martin, N. P., Myers, P., Goulding, E., Chen, S. H., Walker, M., Porter, T. M., Van Gorder, L., Mathew, A., Gruzdev, A., Scappini, E., Romeo, C. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (141), e58327, doi:10.3791/58327 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter