Summary
Detta protokoll beskriver implantation av ett glas fönster på ryggmärgen av en mus för att underlätta visualisering av intravital mikroskopi.
Abstract
Detta protokoll beskriver en metod för ryggmärg laminektomi och glas fönster implantation för in vivo avbildning av mus ryggmärgen. En integrerad digital spridare utnyttjas för att uppnå ett stabilt plan av anestesi vid en låg flödeshastighet av isofluran. En enda kotryggrad avlägsnas, och en kommersiellt tillgänglig Cover-glas är överlagras på en tunn aguppstod säng. En 3D-tryckt plast bakplåt fästs sedan på intilliggande vertebrala Taggar med hjälp av vävnadslim och tandcement. En stabiliserings plattform används för att minska rörelse artefakten från andning och hjärtslag. Denna snabba och kläm fria metod lämpar sig väl för akut mikroskopi med multi-Photon fluorescens. Representativa data ingår för en tillämpning av denna teknik för att två-Photon mikroskopi av ryggmärgen vaskulatur i transgena möss uttrycker eGFP: Claudin-5-ett tätt knutpunkt protein.
Introduction
Transgena djurmodeller som uttrycker fluorescerande proteiner, i kombination med intravital mikroskopi, ger en kraftfull plattform för att hantera biologi och patofysiologi. För att tillämpa dessa tekniker till ryggmärgen, är specialiserade protokoll som krävs för att förbereda ryggmärgen för avbildning. En sådan strategi är att genomföra en laminektomi och ryggmärg fönster implantation. De viktigaste inslagen i en idealisk laminektomi protokoll för mikroskopi omfatta bevarande av inhemska vävnad struktur och funktion, stabilitet i imaging fältet, snabb handläggningstid, och reproducerbarhet av resultat. En särskild utmaning är att stabilisera bildområdet mot den rörelse som induceras av andning och hjärtslag. Flera ex vivo - och in vivo -strategier har rapporterats för att uppnå dessa mål1,2,3,4,5. De flesta in vivo metoder innebär fastspänning sidorna av ryggraden2,4 och följs ofta genom att implantera en styv metall apparat3,4 för stabilitet under kirurgi och nedströmsbildprogram. Fastspänning ryggraden kan potentiellt äventyra blodflödet och inducera blod-hjärnbarriären (BBB) protein remodeling.
Syftet med denna metod är att göra den intakt ryggmärgen tillgänglig för optisk avbildning i den levande musen samtidigt minimera invasivitet av protokollet och förbättra resultaten. Vi beskriver en enda laminektomi och täck-glas implantation förfarande i kombination med en minimalt invasiv oval plast 3D-tryckt bakplåt som fortfarande uppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplattan är direkt anslutit sig till främre och bakre vertebrala Taggar med tandcement. Bakplattan är utrustad med laterala förlängningsarmar med skruv hål som stelt fäster mikroskopet scenen via en metall arm. Detta förankrar effektivt intakt främre och bakre Kota till mikroskopet skede, vilket ger mekanisk motståndskraft mot rörelse artefakten som annars skulle införas genom andning och hjärtslag. Metoden har optimerats för laminektomi av en enda kotan på bröst nivå 12, utelämna klämmorna utnyttjas i alternativa strategier för stabilitet under in vivo Imaging. Förfarandet är snabb, tar cirka 30 min per mus.
Detta protokoll kan användas för att studera sjukdomsmekanismer av BBB. BBB är en dynamisk mikrovaskulär system består av endotelceller, vaskulär glatt mus kula, pericyter, och astrocyt fot processer som ger en mycket selektiv miljö för centralanervsystemet (CNS). Representativa data skildrar tillämpningen av detta protokoll i transgena möss konstruerade för att uttrycka förstärkt grönt fluorescerande protein (eGFP): Claudin-5, ett BBB tight Junction protein. De medföljande bakplattan-filerna kan också anpassas för alternativa tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment följer University of Illinois, Chicago institutionella djuromsorg och använda kommitté protokoll. Detta är en terminalprocedur.
1. beredning av reagens
- Förbered artificiell cerebral spinal Fluid (aCSF) för att innehålla 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6H2o, 2 mm CaCl2· 2H2o i DDH2o. sterilt filter och frysa i individuella-use alikvoter. Värm aCSF i ett vattenbad till 39 ° c före användning.
- Varm låg smältpunkt Agreste (2%) i aCSF tills den är helt upplöst i ett vattenbad inställt på 65 ° c. Under laminektomi, kyla smält aguppstod alikvot till 39 ° c i ett vattenbad, så att den kan klara på nära till fysiologisk temperatur för steg 5,2.
Obs: aguppstod-lösningen kan förvaras vid-20 ° c i engångsportioner. - Bered steril 50 mg/mL karprofen i bakteriostatiskt vatten. Förvaras vid 4 ° c.
- Rengör locket-glasögon med 70% etanol, tre tvättar av ddH2O, och förvara torrt i en dammfri behållare.
2. backplate 3D-utskrift
- Använd 3D CAD-programvara för att skapa en modell till måtten som visas i figur 1. Interiören är en ellips bredaste på bottenytan med avseende på skrivaren och skära med ett loftade skära till en mindre ellips bildar en lumen på motsatt yta. Två utskjutande armar med hål för att ta emot skruvar sträcker sig i sidled, för infästning till bakplåtens hållgaffel. Från den här 3D-strukturen skapar du en triangulated 3D mesh-fil (. STL fil).
Anm.: se figur 1b\u2012D och tilläggsfiler 1 och 2. - Ladda upp den triangulerade 3D mesh-filen till en 3D-skrivare.
- Skriv ut bakplåtar med ett 0,4 mm hett munstycke och en 0,2 mm Lagerhöjd. Välj munstycke temperatur på 205 ° c, bäddtemperatur på 45 ° c och utskriftshastighet på 45 mm/s.
- Bedöma de resulterande 3D-tryckta bakplåtarna visuellt för strukturell integritet (figur 1e), grov strukturell svikt (frånvarande lumen, kollapsad vägg) indikerar utskriftsfel (figur 1f).
3. kirurgisk beredning
- Värm värmeplattan.
- Ladda isofluran i leverans sprutan medan du arbetar i en kemisk draghuv. Sätt fast leverans sprutan i isofluran-enheten.
- Välj en 8 \ u201212-veckors gammal mus. Väg djuret. Inducera anestesi med 2% isofluran i en induktions kammare. Injicera karprofen vid 5 mg/kg subkutant.
- Placera näsa-konen och leverera isofluran på 2% med en flödeshastighet på 150 mL/min för underhåll av ett kirurgiskt plan av anestesi (figur 2A\u2012E). Wrap värme pad med en disponibel absorberande pad för att underlätta sanering.
- Placera ett djur på värmeplattan på Operations stationen och installera näsan konen. Smörj termometern med vaselin och sätt in den 5 mm i ändtarmen. Tejpa termometersonden till svansen för stabilitet. Applicera oftalmisk salva till ögonen på musen.
- För att bibehålla hydratisering, applicera 200 μL av laktat Ringers lösning genom subkutan injektion var 30 min tills försöket avslutas.
- Spraya dorsum med 70% etanol, ta bort päls med Clippers, och rengör platsen med povidon-jod.
4. laminektomi
- Placera djuret mellan öron stänger; dessa upprätthåller huvudet positionen av musen med avseende på näsan-konen.
- Bekräfta att djuret är djupt sövda som bedöms av bristande InterDigital nypa reflex och stadig andningsmönster.
- Gör en 1,5 cm rostral-caudal snitt vid mittlinjen över nedre bröstkorg/övre ländryggen med hjälp av #11 blad (figur 2). Separera huden genom att greppa den med trubbiga tandade pinpett och/eller handskar fingrar. Använd tång för att separera och dra tillbaka kvarvarande transparent bindväv under huden. Den ytliga muskulaturen bör nu exponeras; förflytta detta med ett skum kirurgiskt spjut.
- Använd skum kirurgiska spjut (eller en Curette) för att rensa bort den återstående, djupare muskulaturen i mål kotan (bröstkorg 12). För att skapa en plats för bakplattan, också rensa bort muskler från den bakre aspekten av bröst 11, och den främre aspekten av bröst 13. Kontrollera blödning genom att applicera ett skonsamt tryck med ett kirurgiskt spjut eller Använd en minimal puls med en diatermi pistol. Fortsätt att ta bort den kvarvarande muskeln bort från senor med hjälp av pinps
- När musklerna avlägsnas, försiktigt lossa senor genom att skära med tång. Det bör finnas gott om utrymme för att visualisera och manipulera sladden när det här steget är klart. Kontrollera att Dura frågan av Inter-vertebrala rymden, semi-transparent laminärt ben, den centrala ytliga blodkärl underbenet, och främre utstrålande artär är nu tydligt.
- Blöt regionen med varm aCSF. Använd mikroborrmaskinen för att upprepade gånger tunna laminärt benet med raka streck parallellt med ryggmärgens långa axel (figur 2, figur 3). Om så önskas, Använd ett glid steg för att rotera den kirurgiska plattformen för förbättrad ergonomisk komfort (t. ex. kan en högerhänt operatör rotera den kirurgiska plattformen moturs för borrnings steget).
Obs: glid steget som används är konstruerat av en övre aluminiumplåt som glider ± 15 mm med avseende på den fasta bottenplattan. - Ta försiktigt tag i den ytliga spindiga processen med pinkoppar och lyft Kota; benet bör lyfta bort lätt. Om det finns motstånd, upprepa ben gallring med borr och vid behov använda Iris sax, är noga med att sikta saxspetsarna uppåt för att undvika att skada vävnaden.
Anmärkning: för att bibehålla Dura intakt, är det viktigt att inte bogserbåt på benet. - Använd #4 tång för att rensa bort eventuella ben skärvor. Använd ett kirurgiskt spjut för att applicera skonsamt stadigt tryck för att kontrollera blödning. Skölj vävnad med varm aCSF. Låt inte vävnaden torka ut.
5. implantation av täckglas
- Applicera försiktigt en 3 mm borosilikatcover-glas till den exponerade sladden.
- Se till att aguppstod kyls till 39 ° c. Med hjälp av en liten spatel, tillämpa varm 2% aguppstod/aCSF till kanten av locket-glas och tillåta kapillärverkan att dra den under ytan.
Anmärkning: vid temperaturer under 39 ° c, kan Agreste börja gel. Om detta inträffar, Värm upp med hjälp av ett vattenbad eller mikrovågsugn. Vissa operatörer föredrar att först tillämpa en droppe Agreste och lägga locket-glas ovanpå. - Applicera vävnad lim till exponerade beniga artikulära processer i intakt angränsande Kota på bröst nivå 11 kotryggrad och bröstkorg nivå 13 kotryggrad. Applicera ytterligare vävnad lim i en ring runt laminektomi plats, över den intilliggande senan och tvärgående process.
Anmärkning: vävnadslim krävs för korrekt följsamhet av tandcement i efterföljande steg. De artikulära processerna bildar en naturlig sits på vilken bakplattan kan vila stabilt (figur 3). Vidhäftning till artikulär processer kommer att utgöra de starkaste punkterna i bilagan. - Blanda Dental cement med Accelerant i en porslin blandnings bricka. Använd en liten spatel för att överföra tandcement på vävnaden lim skiktet. Använd tandcement för att fästa bakplåten på Operations fältet, centrerad över fönstret. Tillåt 10 minuter för tandcement att bota.
Obs: den fasta vidhäftning av bakplattan till främre och bakre artikulär processer ger den grundläggande strukturella stabiliteten i implantatet. - Använd ytterligare tandcement för att fylla i den inre basen av bakplattan, och undersidan av bakplattan: vävnad gränssnitt.
Anmärkning: den extra applicering av tandcement förbättrar följsamhet och minskar risken för läckage av Mikroskop objektiva nedsänkning vätska (saltlösning) ut botten av bakplattan. - För vidare den kluven bakplåtshållaren till lämplig position över fönstret. Fäst bakplattan i bakplåtshållaren med skruvar.
Anmärkning: detta protokoll utnyttjas en egenbearbetad bakplåt hållare (figur 2g\u2012H). - Applicera saltlösning på bakplattan för att testa för läckage. Om någon vätska läcker, torka området och tillämpa mer tandcement.
6. förberedelse av avbildning
- Överför djuret på Operations plattformen till det optiska bordet.
Obs: vår kirurgiska plattform, bakplåt hållare, och isofluran näsa-Cone innehavaren kan transporteras mellan kirurgiska och två-Photon Imaging stationer som en enhet, samtidigt tillämpa kontinuerlig isofluran anestesi (figur 2D,H). Liknande enheter kan monteras från att hålla gafflar, balkar, och stödjande stolpar erhållas från kommersiella källor (t. ex. ThorLabs). För intravital mikroskopi, bör det finnas minst 11 inches av clearance mellan mikroskopet mål och den optiska tabellen för att rymma höjden av den kirurgiska plattformen. - Anbringa den kirurgiska plattformen till den optiska tabellen med hjälp av en rostfrittstål monterings stolpe och motborrade spänngaffel.
- Applicera färsk saltlösning i brunnen av bakplattan. Sänk en vatten-nedsänkning lins i brunnen.
- Använd överförd eller epifluorescensljus för att identifiera området av intresse och fokus. Byt till laser skanningsläge och utför in vivo -avbildning enligt lämplig två-Photon laser excitation våglängd, dichroics och bandpass filter för fluoroformer närvarande i vävnaden6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implanterade glas fönster och intravital två-Photon mikroskopi ger ett användbart verktyg för att bedöma dynamiska förändringar i CNS-proteiner. Den funktionella integriteten av BBB påverkas av uttrycket, subcellulär lokalisering, och omsättningshastighet av snäva knutpunkt proteiner7. Tidigare studier har visat att snäva Knut punkts proteiner genomgår snabb och dynamisk ombyggnad vid steady state8. Den för närvarande beskrivna laminektomi och glas fönster beredning har använts i transgena eGFP: Claudin-5 möss9, som bär fluorescerande snäva knutpunkt proteiner, att bedöma BBB tight Junction remodeling i den experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) modell av multipel skleros10. I representativa data, avbildning av eGFP: Claudin-5 uppnåddes med ett två-Photon Mikroskop med 920 nm excitation, en 40 × infraröd mål (0,8 NA), och en grön fluorescens emission filter (figur 4). Optiska stackar samplades vid 2 μm axiella steg till 100 μm under duralytan. Data skildrar visualisering av överföras märkta korsningar hela en vaskulär plexus. Enstaka optiska skivor och Z-projektionsbilder ingår (figur 4). Den tydliga avgränsningen av täta Knut punkts strukturer i Z-projektion (figur 4b) indikerar att minimal X-Y-bilddeplacement produceras efter lyckad laminektomi, fönsterplacering och implantation av ryggplattan.
Figur 1. Anpassad tryckt bak platta stabiliserings anordning. A) ortogonala bakplåtsvyer. B-D) triangulated mesh modeller av rygg-och ventrala ytor av bakplattan. E) korrekt tryckt bakplåt. F) felaktigt tryckt bakplåt. Se kompletterande filer 1 och 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kirurgiska steg för laminektomi. A) isoflurane anestesi leveranssystem med hjälp av en integrerad digital spridare inklusive (i) en pekskärm för att styra anestesi, (II) kontroll rattar, (III) ingångar för valfria tilläggsmoduler fysiologi, (IV) anestesi koncentration justeringsratten, (v) spruta pumppusher block, (vi) spruta med isofluran, (VII) integrerad digital spridare, (VIII) inspirations slang, (IX) inspirations slang för induktions kammare, (x) induktions kammare, (XI) inspirations slang för näsa-Cone, (XII) förfallo slang för näsa-Cone, (XIII) utgångs slang för induktions kammare. B) instrument som används i laminektomi inkluderar (i) återkoppling kontrollerad värmeenhet, (II) K-kopplad rektal termometer sond, (III) flexibel silikon värme pad, (iv) #11 Blade, (v) #5 pincett, (vi) tandad Titan pincett, (VII) Titan Iris sax, (VIII) benmikroborr, (IX) diatermi Gun, (x) 3D tryckt bakplåt, (XI) absorberande skum kirurgiska spjut, (XII) keramisk blandnings bricka för akrylharts, (XIII) akrylharts och Accelerant, (XIII) vävnadslim, (XIV) Oftalmologiskt smörjmedel, (XV) 3 mm Cover-glas. C) stereomikroskop och kirurgisk plattform. Under operationen sitter den kirurgiska plattformen på ett glid Stadium (silver och svart rund bas på Mikroskop stadiet). D) mus placerad på den anpassade kirurgiska plattformen med uppvärmd säng, efter ytliga mittlinjen snitt. Isofluran noskon-hållaren är justerbar i Y-och Z-axlarna för att rymma små och stora möss. Öron stänger stabilisera huvudet med avseende på den Nosecone. Den rektala thermoprobe mäter kärntemperatur. E) kirurgiskt fält vid steget av muskel borttagning. F) kirurgiskt fält efter avlägsnande av muskler. G) kirurgiskt fält under gallring av vertebrala ben. H) kirurgiskt fält efter avlägsnande av vertebrala benet. I) kirurgiskt fält vid placering av täckglas. J) kirurgiskt fält efter placering av täckglas. K) kirurgiskt fält under initial beläggning med akryl. L) kirurgiskt fält efter avslutad bakplattan implanation. M-N) Mus placerad i Operations stationen efter avslutad laminektomi. Mässing gaffel är justerbar i X-, Y-och Z-axlar för positionering över ryggmärgen laminektomi webbplats. Gaffeln är mekaniskt förankrad i den kirurgiska plattformen för att ge optimal stabilisering av bildområdet under kirurgi och nedströms applikationer inklusive två-Photon intravital mikroskopi. Under operationen monteras den kirurgiska plattformen på ett glid Stadium. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk skildring av anatomisk placering av ryggmärgs fönstret. A) Schematisk avbildning av den överlägsna utsikten över en lägre bröst kotkropp, spinös process, och ryggmärg (SC) segment. En prickig cirkel visar sätet för den artikulära processen, den viktigaste stödpunkten för vidhäftning på bak plattan. B) Schematisk skildring av den överlägsna utsikten över ryggmärgs fönstret. Mål kotpelaren (här, T12) har avlägsnats. Ett tunt lager av Agros överlägger ryggmärgen. Ett täckglas vilar ovanpå agasen. Tissue Lim appliceras över de tvärgående processer (och, inte visas här, på den exponerade artikulär process av angränsande, intakt vertebrala taggar). Dental cement överlagringar vävnaden lim. Ryggplattan följer vävnaden cement, vilar på tvärgående processer (visas) och artikulär process av intilliggande, intakt vertebrala Taggar (visas inte i denna panel). Ett extra tunt lager av tandcement appliceras på insidan av bakplåten. Bakplattan avbildas i en cutaway-vy för att visualisera täckglaset. C) Schematisk avbildning av den laterala vyn av ryggmärgs fönstret. Mål kotpelaren (här, T12) har avlägsnats. Ett tunt lager av Agros överlägger ryggmärgen. Ett täckglas vilar ovanpå agasen. Vävnadslim appliceras över den exponerade artikulära processen av intilliggande, intakt T11 och t13 vertebrala taggar. Dental cement överlagringar vävnaden lim. Ryggplattan följer vävnaden cement, vilar på tvärgående processer och artikulär process av intilliggande, intakt vertebrala Taggar (visas). Bakplattan avbildas i en cutaway-vy; i en sann lateral visning av aguppstod och täck-glas skulle skymmas av den laterala väggen i bakplattan. Anatomiska strukturer är baserade på detaljerad magnetisk resonanstomografi av C57Bl/6 spinal kolumnen utförs av Harrison och kollegor 11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tight Junction mikrostruktur visualiseras av eGFP: Claudin-5 i mus ryggmärgen av intravital två-Photon mikroskopi. A) en optisk sektion som tagits 30 μm under duralytan i en frisk egfp: Claudin-5 Mouse. Röd pil skildrar en eGFP: Claudin-5 tight Junction segment sträcker sig vinkelrätt mot den längsgående snäva knutpunkten axeln. Skalstapeln representerar 5 μm. infällbar: skalstapeln representerar 10 μm. B) Z-projektion av det vaskulära nätverket som sträcker sig 100 μm under dural ytan av friska mus ryggmärgen. Den optiska stacken samplades vid 2 μm axiell steg storlek och inkluderar segmentet från panel A. Ingen Bildjustering har utförts. Skarpa avgränsningen av av strukturer i Z-projektion visar minimal Bildförskjutning mellan på varandra följande ramar. C) representativ delmängd av optiska skivor tagna med 10 μm mellanrum från den resulterande Z-stacken. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 2. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här möjliggör stabil avbildning av ryggmärgen i möss genom ett glas fönster. Denna metod har tillämpats för att bedöma BBB remodeling i transgena eGFP: Claudin5 +/-möss som uttrycker en fluorescerande BBB tight Junction protein, men det kan tillämpas lika bra för studier av alla fluorescerande proteiner eller celler i ryggmärgen.
Flera metoder för laminektomi och ryggmärgs stabilisering har utvecklats. Alla protokoll adress stabiliserande ryggmärgen under Imaging och fönster genomförande för visuell tillgång till strukturen av intresse. Antalet borttagna kotan och graden av invasivitet av de tillgängliga protokollen varierar (t. ex. komponenter limmade på ytan av ytliga ben, som i det nuvarande protokollet, kontra inbäddade djupare). Davalos och Akassoglou2 utvecklat en laminektomi metod med löstagbara klämmor på vardera sidan av ryggraden och en klämma vid basen av svansen på musen för att stabilisera ryggmärgen. Denna innovativa strategi för att avbryta djuret lättade några av bröstkorg förskjutning orsakad av förflyttning av lungorna expanderar mot operationsbordet. För att skapa en brunn för innehållande nedsänkning vätska för en vatten-nedsänkning mikroskopiskt objektiv, en fälg av gelatin sigill (t. ex. gelseal) gjordes runt ryggmärgen och fylld med acsf. Tätnings fälgen kan störas under bildtagning, men kan också lätt torkas bort i slutet av sessionen för att möjliggöra sår stängning och efterföljande reimaging. Denna metod har antagits i stor utsträckning12,13. Andra grupper har utvecklat alternativa stabiliserings metoder. Fenrich et al. 4 handpreparerade modifierade gem som ett sätt att säkra ryggraden. Dessa modifierade gem säkrades i laterala vertebrala pediklarna med cyanoakrylat lim och underhålls som permanent implanterade handtag för en avtagbar extern klämma och extern hållande gaffel för utmärkt rörelse stabilitet. Cupido och kollegor har presenterat variationer på ovan nämnda metoder med inblandning av Agreste överlagt på sladden2,4,12. Farrar och Schaffer3 utvecklat en fyrsidig metall stabilisator som kan möjliggöra genomförandet av ett glas fönster på tre Kotor snarare än bara en. Denna metod tillät också ryggmärgen att fästas med skruvar till en större brygga stabilisator under avbildning för att minska potentiella rörelse. En miniatyriserad en-Photon Mikroskop implanteras direkt på laminektomi Imaging kammaren har också utvecklats för in vivo inspelning i fritt rörliga möss på en-Photon nivå, men är ännu inte lätt tillgänglig för de flesta laboratorier13 . I ett annat tillvägagångssätt, Weinger et al. 1 dissekerade en hel ryggmärg och inbäddade den i aguppstod för ex vivo Imaging, vilket möjliggör oöverpasslig rörelse stabilitet och tillgång till den ventrala ryggmärgen, men upphäver blodflödet. Vissa begränsningar av dessa utvecklingar inkluderar lång kirurgisk tid4, möjliga störningar av gelatin Seal RIM2, behovet av att anpassa locket-glas dimensioner för att passa det önskade området av ryggmärgen4, manuell modifiering av gem4,12, relativt invasiva kirurgiska tekniker12,14och luftbubblor som bildas vid användning av silikonelastomer3,4.
Vi har utvecklat en alternativ metod som erbjuder flera fördelar. Detta protokoll har optimerats för att minska den tid som tillbringas under operationen. Vissa kirurgiska protokoll kräver längre procedur tider som sträcker sig från en och en halv timme4 till en timme3; När behärskar, denna laminektomi metod kan utföras i cirka 30 min. minska den tid som tillbringas i kirurgi kan minska fysiologisk stress till musen, och underlätta högre genomströmning experiment. Detta protokoll tar bort en enda kotan, och innehåller ytlig vidhäftning av stabiliserings anordningen gör det mindre invasiva än vissa jämförbara protokoll4,5,12,14. Liksom metoden för Figley et al., genom att använda ett plast implantat detta protokoll erbjuder kompatibilitet med akustisk avbildning5.
För att undvika ljusspridning (under intravital mikroskopi) som kan orsakas av skillnaderna mellan brytningsindex för luft, vatten och vävnad, de flesta protokoll overlay ett optiskt transparent substrat över den exponerade ryggmärgen. Vanliga substrat är hög renhet, låg smälttemperatur aguppstod10,12 eller silikon polymerer3,4,5. Agreste erbjuder fördelen av användarvänlighet, med minimal bubbla formation, och är lämplig för akuta bildsessioner. För att skydda vävnaden från värmeskador, är det lämpligt att värma aguppstod till bortom smältpunkten och sedan låta den svalna till ~ 39 ° c i ett vattenbad under laminektomi, så det kan vara klar vid lämplig tidpunkt för ansökan till den exponerade ryggmärgen. För kronisk avbildning är silikon polymerer mer motståndskraftiga mot uttorkning. Pilot försök under utvecklingen av det nuvarande protokollet utelämnade antingen aguppstod skiktet eller överliggande täckglas, och fann att den därav ljusspridningen minskat tillgängligt djup av avbildning.
Ett differentierande inslag i detta protokoll är införlivandet av en 3D tryckt bakplåt och stödjande bakplåt gaffelhållare. Efter laminektomi och fönster implantation, är preparatet stabiliseras genom tillsats av en 3D-tryckt oval bakplåt som är fast på plats med tandcement. Bakplattan tjänar två funktioner: för det första ger strukturellt stöd och stabilisering av ryggmärgen, och för det andra, det skapar en läpp för att hålla vätska för nedsänkning mål för mikroskopi. I prototyper av denna inställning användes kommersiellt tillgängliga pelar stolpar, adaptrar och hållgafflar. Vi har nyligen bytt till anpassade maskinbearbetade delar som avbildas här. I båda fallen är den viktigaste funktionen att ge strukturell stringens att stabilisera imaging fältet mot störningar i rymden och tid som orsakas av hjärtslag och andning. Även om kroppen av djuret vilar löst på värmeplattan, ryggmärgen och dess Imaging fält är något upphängd från anläggningen gaffel, vilket också minskar respiratorisk förskjutning. Plast underlaget ger liten flexibilitet för att rymma spänningar från skruvning i plattan hållaren. Den svarta plast färgen som används för tryckning reflekterar minimalt med ljus i fluorescensfältet. Med hjälp av dessa metoder genererar vi bild stackar som kan användas utan justering för post hoc -justering. Dessutom är 3D bakplattan beskrivs häri billigt att producera, kostar bara pennies i material för varje utskrift, när skrivaren är köpt. Dessutom har kostnaderna för 3D-skrivare sjunkit under de senaste åren. De 3D-tryckta bakplåtsfilerna (se kompletterande filer 1 och 2) som publicerats med detta protokoll kan lätt modifieras för att tillgodose individuella laboratorie behov. Vi konstruerade den långa dimensionen av bakplattan för att rymma den intervertebral utrymme som skapas genom avlägsnande av bröstkorg 12 kotpelaren, som ligger över ländryggen 2/3 ryggmärgen segment11. För att tillämpa denna teknik på en annan vertebrala avsnitt, kan de medföljande CAD-filer ändras.
Detta protokoll utnyttjar en kommersiellt tillgänglig låga flöden anestesisystem som distribuerar en digital integrerad direktinsprutning spridare som ett alternativ till den traditionella passiva spridare. Det viktigaste inslaget i låg-flöde enhet är den minskade operatören exponering för isofluran, en betydande hälso för del. Den låga flödet anestesi enheten erbjuder också kostnadsbesparingar på grund av minskad konsumtion av isofluran och utnyttjande av rumsluft istället för komprimerad gas. I den nuvarande studien, 2% isofluran levereras av integrerad digital spridare på 150 mL/min, tillsammans med feedback-kontrollerad termiskt stöd, uppnått ett stabilt plan av anestesi och lämpligt underhåll av kroppstemperaturen. I linje med detta, publicerade jämförelser av digitala integrerade förångare och traditionella förångare har också dragit slutsatsen att den digitala integrerade spridare ger ett stabilt plan för anestesi och bra bevarande av kroppstemperatur, hjärtfrekvens, andningsfrekvens och återhämtning medan du använder mindre isofluran15,16.
En icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) såsom karprofen kan administreras pre-operativt som en kompletterande analgetikum. Under loppet av några timmar, NSAID hämmar inflammatorisk cytokin transkription och interstitiellt ödem; Multi-Day administration dämpar svårighetsgraden av neuroinflammatoriska sjukdomar inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit, en djurmodell av multipel skleros17,18. Särskilt i studiet av neuroinflammatorisk sjukdom, de positiva effekterna av karprofen analgesi måste noga vägas mot sjukdomsmodifierande effekter vid bestämning av analgesi och anestesi för ett experiment i nära samordning med lämpliga tillsyns nämnder.
En begränsning av denna metod är att det inte är lätt att mottaga upprepade bildsessioner över flera dagar. Den främsta orsaken är att bakplåten strukturen är för stor för att stänga huden över. Därför finns det en risk att en mus skulle få bort ryggplattan på vakna från anestesi. Om upprepad avbildning var viktigt, det finns flera strategier som kan sättas in, inklusive att minska storleken på bakplattan, eller ändra fästet. Som med alla kirurgiska ingrepp, det finns en inlärningskurva för operatörerna. Det krävs en nära samordning med institutionella djur omsorgs kontor och gransknings tavlor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
S. Lutz stöds av National Center for framryckande translationella vetenskaper, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 och University of Illinois Chicago College of Medicine start fonder. Simon Alford stöds av RO1 MH084874. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på NIH. Författarna tackar Dritan Agalliu på Institutionen för neurologi vid Columbia University Medical Center för TG eGFP: Claudin-5 möss, vetenskapliga diskussioner och insikter i utvecklingen av kirurgiska protokoll och Imaging applikationer. Författarna tackar Sunil P. Gandhi i Institutionen för neurobiologi och beteende vid University of California, Irvine för att utforma den första prototypen av stereotaktisk apparat och djur temperatur Controller, diskussion om det kirurgiska protokollet, och utbildning i två-Photon mikroskopi. Författarna tackar också Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) för hjälp med att anpassa den kirurgiska stereomicroscope, och Ron Lipinski (val tillverkning) för bearbetning stereotaktiska delar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
