Summary
该协议描述将玻璃窗植入小鼠脊髓，以方便通过生命内显微镜进行可视化。
Abstract
该协议描述了一种用于小鼠脊髓体内成像的脊髓层膜切除术和玻璃窗植入方法。集成数字蒸发器用于以亚非卢兰的低流速实现稳定的麻醉平面。一根椎骨脊柱被切除，一个市售的封面玻璃被覆盖在一张薄的甘蔗床上。然后，使用组织粘合剂和牙科水泥将 3D 打印的塑料背板贴在相邻的椎脊上。稳定平台用于减少呼吸和心跳的运动伪影。这种快速和无夹紧的方法非常适合急性多光光荧光显微镜。在表达eGFP：Claudin-5——一种紧密结蛋白的转基因小鼠中，应用该技术在脊髓血管的双光子显微镜上，包括代表性数据。
Introduction
表达荧光蛋白的转基因动物模型与生命内显微镜结合，为解决生物学和病理生理学提供了一个强大的平台。为了将这些技术应用于脊髓，需要专门的协议来准备脊髓进行成像。其中一种策略是进行层切除术和脊髓窗口植入。理想的显微镜层切除术方案的主要特点包括保存原生组织结构和功能、成像场的稳定性、快速处理时间和结果的可重复性。一个特别的挑战是稳定成像场对呼吸和心跳引起的运动。据报道，为了实现这些目标，已经报告了多种前体和体内策略，以实现这些目标1、2、3、4、5。大多数体内方法涉及夹紧脊柱2，4的两侧，然后通常植入一个刚性金属装置3，4在手术期间的稳定性和下游成像应用。夹紧脊柱可能会损害血液流动，并诱导血脑屏障 （BBB） 蛋白质重塑。
这种方法的目的是使完整的脊髓可用于活小鼠的光学成像，同时尽量减少协议的侵入性，并改善结果。我们描述了单一层切除术和盖玻璃植入程序，与微创椭圆形塑料 3D 打印背板配对，仍然可实现坚固的机械稳定性。背板直接附着在前椎和后椎脊柱上，用牙科水泥。背板配有侧延伸臂，带螺钉孔，通过金属臂牢固地连接到显微镜级。这有效地将完整的前椎和后椎固定在显微镜阶段，为否则由呼吸和心跳引入的运动伪影提供机械阻力。该方法针对胸腔12级单椎骨的层切除术进行了优化，省略了在体内成像过程中用于稳定的替代策略中使用的钳子。该过程是快速的，每只鼠标大约需要 30 分钟。
该协议可用于研究BBB的疾病机制。BBB 是一个动态微血管系统，由内皮细胞、血管平滑肌、围细胞和星形细胞足过程组成，为中枢神经系统 （CNS） 提供高度选择性的环境。具有代表性的数据描述了该协议在转基因小鼠中的应用，该实验旨在表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP）：Claudin-5，一种BBB紧密结蛋白。提供的背板打印文件也可以针对其他应用进行自定义。
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Protocol
所有实验都遵循伊利诺伊大学芝加哥机构动物护理和使用委员会的协议。这是一个终端过程。
1. 试剂制备
- 准备人造脑脊髓液 （aCSF） 包含 125 mM NaCl、 5 mM KCl、 10 mM 葡萄糖、 10 mM HEPES、2 mM MgCl2+6H2O、2 mM CaCl2+2H2O 在 ddH2O. 无菌过滤器中冷冻，并冷冻在单独使用的脂肪中。使用前，在水浴中加热至39°C。
- 暖低熔点角蔗角 （2%）在CSF中，直到完全溶解在设置为65°C的水浴中。在拉氏切除术期间，在水浴中冷却融化的甘蔗甘蔗分酸至39°C，使其在接近生理温度下为步骤5.2做好准备。
注意：角玫瑰溶液可储存在-20°C的一次性等分中。 - 在细菌静水中制备无菌 50 mg/mL 卡洛芬。储存在4°C。
- 用 70% 乙醇清洁盖玻璃，三次 ddH2O 洗洗，并干燥存放在无尘容器中。
2. 背板 3D 打印
- 使用 3D CAD 软件创建如图 1所示的尺寸的模型。内部是相对于打印机的底面最宽的椭圆，并切割与放样切割到较小的椭圆，形成相对表面的流明。两个带孔的投影臂，用于接受螺钉横向伸出，用于连接到背板固定叉。在此 3D 结构中，创建三角化 3D 网格文件 （.STL 文件）。
注意：参见图 1B\u2012D和补充文件 1 和 2。 - 将三角化 3D 网格文件上载到 3D 打印机。
- 使用 0.4 mm 热端喷嘴和 0.2 mm 层高度打印背板。选择喷嘴温度205°C，床温45°C，打印速度45毫米/s。
- 直观地评估结果的 3D 打印背板的结构完整性 （图 1E）;严重结构故障（缺少流明、倒塌的墙壁）表示打印缺陷（图1F）。
3. 外科准备
- 预热加热垫。
- 在化学烟气罩中工作时，将烟胶装入输送注射器中。将输送注射器连接到分路器单元。
- 选择一个 8\u201212 周大的鼠标。称量动物。诱导室中使用2%的分路胶诱导麻醉。在皮下注射5毫克/千克的卡洛芬。
- 将鼻锥放置并交付 2% 的正弦，流速为 150 mL/min，用于麻醉手术平面的维护（图 2A_u2012E）。用一次性吸水垫包裹加热垫，便于清理。
- 将动物放在手术台的加热垫上，并安装鼻锥。用石油果冻润滑温度计，并将其插入直肠 5 mm。将温度计探头贴在尾部以保持稳定。在老鼠的眼睛上涂上眼膏。
- 为了保持水化，每30分钟通过皮下注射施用200μL的哺乳环合溶液，直到实验结束。
- 用70%乙醇喷洒去水，用剪子去除毛皮，用波维酮碘清洁现场。
4. 拉米内切切除术
- 将动物放置在耳杆之间;这些保持鼠标相对于鼻锥的头部位置。
- 确认动物被深度麻醉，评估缺乏数字间捏反射和稳定呼吸模式。
- 使用#11刀片在下胸/上腰椎区中线进行 1.5 厘米的玫瑰-斜面切口（图 2）。用钝齿钳和/或戴手套的手指抓住皮肤，分离皮肤。使用钳子分离和剥离皮肤下剩余的透明结缔组织。表面的肌肉现在应该暴露;用泡沫手术矛代替这一点。
- 使用泡沫手术矛（或固化器）清除目标椎骨的剩余、更深的肌肉（胸腔12）。要创建一个座椅的背板，也清除远离肌肉从胸11的后方面，和胸板13的前方面。通过用手术矛施加轻柔的压力，或使用烧灼枪的最小脉冲来控制任何出血。继续用钳子从肌腱上去除剩余的肌肉
- 一旦肌肉被移除，用钳子切开肌腱小心分离。完成此步骤时，应该有足够的空间来可视化和操作电源线。检查椎间空间的杜拉物质、半透明的层骨、骨骼下方的中央表面血管和前放射动脉现在清晰可见。
- 用温暖的ACSF来湿润这个地区。使用微钻重复薄拉皮纳骨使用直线笔划平行于脊髓的长轴（图2，图3）。如果需要，利用滑翔阶段旋转手术平台，以提高人体工程学的舒适性（例如，右手操作员可以逆时针旋转手术平台进行钻孔步骤）。
注意：使用的滑翔阶段由上部铝板组成，相对于固定底板滑动 ±15 mm。 - 用钳子轻轻抓住表面的旋转过程，抬起椎骨;骨头应该很容易抬起来。如果有阻力，用钻头重复骨变变，如有必要，使用虹膜剪刀，小心将剪刀尖向上瞄准，以免损坏组织。
注意：为了保持杜拉完好无损，必须不要拖拽骨头。 - 使用#4钳子清除任何骨片。使用手术矛施加温和的稳定压力来控制任何出血。用温暖的ACSF冲洗组织。不要让组织干涸。
5. 盖玻璃植入
- 轻轻地将 3 mm 硼硅酸盐盖玻璃涂抹在裸露的电源线上。
- 确保甘蔗冷却至39°C。使用小铲子，将温暖的 2% 甘蔗糖/aCSF 涂抹在盖玻璃的边缘，并允许毛细管作用将其画在表面之下。
注意：在低于39°C的温度下，角胶可能开始凝胶化。如果发生这种情况，请使用水浴或微波炉重新加热。一些操作员喜欢先涂抹一滴甘蔗，并将盖玻璃放在上面。 - 在胸椎级11级和胸椎级13级椎骨脊上，将组织粘合剂涂在胸腔11级椎骨的裸露骨关节工艺上。在层切除术部位周围的环中，在相邻的肌腱和横向过程中，在环中涂上额外的组织粘合剂。
注意：在随后的步骤中，需要组织粘合剂才能正确粘附牙科水泥。关节过程形成一个自然座椅，背板可以固定（图3）。对关节过程的粘附将形成最强烈的附着点。 - 将牙科水泥与助剂混合在陶瓷搅拌盘中。利用小铲子将牙科水泥转移到组织粘合层上。使用牙科水泥将背板固定在手术现场，中心在窗口上。留出10分钟，让牙科水泥固化。
注意：背板与前关节和后关节工艺的牢固粘附为植入物的基本结构稳定性。 - 使用额外的牙科水泥填充背板的内部底座，以及背板的底面：组织界面。
注意：牙科水泥的额外应用可提高依从性，并降低显微镜物镜浸入液（盐水）从背板底部泄漏的风险。 - 将分叉背板支架推进到窗口上的相应位置。用螺钉将背板固定到背板支架中。
注意：此协议使用了定制加工的背板支架 （图 2G\u2012H）。 - 将盐水涂在背板上以测试泄漏情况。如果有任何液体泄漏，干燥区域并涂抹更多牙科水泥。
6. 成像准备
- 将手术台上的动物转移到光学台。
注：我们的手术平台、背板支架和离黄眼鼻锥支架可作为一个单元在外科和双光子成像站之间运输，同时应用连续的离黄麻醉（图2D，H）。类似的装置可以从从商业来源获得的固定叉、横梁和支撑柱柱组装而成（例如。托尔实验室）。对于生命内显微镜，显微镜物镜和光学台之间应至少有11英寸的间隙，以适应手术平台的高度。 - 使用不锈钢安装柱和反吸夹叉将手术平台固定在光学表上。
- 将新鲜的盐水涂抹在背板的井中。将浸入式透镜放入井中。
- 使用透射或荧光光确定感兴趣和焦点的区域。切换到激光扫描模式，并根据适当的双光子激光激发波长、二色和带通滤波器对组织6中的荧光道进行体内成像。
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Representative Results
植入的玻璃窗和生命内的双光子显微镜为评估中枢神经系统蛋白质的动态变化提供了一个有用的工具。BBB的功能完整性受紧密结蛋白7的表达、亚细胞定位和周转率的影响。先前的研究表明，紧密结蛋白在稳定状态8下进行快速和动态的重塑。目前描述的拉氏切除术和玻璃窗制剂已用于转基因eGFP：Claudin-5小鼠9，其中含有荧光紧密结蛋白，以评估BBB紧密结重塑在实验自身免疫多发性硬化症的脑脊髓炎（EAE）模型10。在代表性数据中，eGFP：Claudin-5的成像是通过具有920nm激发、40°红外目标（0.8 NA）和绿色荧光发射滤波器的双光子显微镜实现的（图4）。光学堆栈在2μm轴向步道到100μm的膜表面下取样。数据描述了整个血管丛中荧光标记的结的可视化。包括单个光学切片和 Z 投影图像 （图 4）。Z 投影中紧密结结构的清晰划定（图 4B） 表明，在成功进行层切除术、窗口放置和背板植入后，产生的 X-Y 图像位移最小。
图 1.自定义打印背板稳定装置。A）正交背板视图。B-D）背板背板背和腹面的三角网格模型。E）正确打印的背板。F）背板打印不正确。请参阅补充文件 1和2。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.拉米内切手术切除手术步骤。A）使用集成数字蒸发器的超脱麻醉输送系统，包括：（i） 用于控制麻醉的触摸屏显示屏，（ii） 控制表盘，（iii） 可选附加生理模块的输入，（iv） 麻醉浓度调节旋钮，（v）注射器泵推杆块，（vi）带偏胶的注射器，（vii）集成数字蒸发器，（八）灵感管，（九）感应室的灵感管，（x）感应室，（xi）鼻锥的灵感管，（xi）用于鼻锥的过期管，（xiii） 用于感应室的过期管。B）用于层切除术的仪器包括：（i） 反馈控制加热装置，（ii） K 耦合直肠温度计探头，（iii） 柔性硅胶加热垫，（iv） #11刀片，（v） #5钳，（vi） 齿状钛钳，（vii） 钛虹膜剪刀，（八）骨微钻，（ix）烧结枪，（x）3D打印背板，（xi）吸水泡沫手术矛，（xii）丙烯酸树脂陶瓷混合托盘，（xiii）丙烯酸树脂和助剂，（xiii）组织粘合剂，（xiv）眼科润滑剂，（xv）3毫米盖玻璃。C）立体显微镜和手术平台。手术期间，手术平台位于滑翔阶段（显微镜台上的银色和黑色圆形底座）。D）鼠标位于定制的手术平台上，带加热床，表面中线切口后。在 Y 轴和 Z 轴中可调节无主锥体锥体支架，以适应小型和大型小鼠。耳杆相对于诺塞内稳定头部。直肠热探针测量芯温度。E）肌肉切除步骤的手术场。 F）切除肌肉后的手术场。G）椎骨变薄期间的手术场。H）切除椎骨后的手术场。I）在放置盖玻璃时的手术场。J）放置盖玻璃后的手术场。K）在初始涂层与丙烯酸的手术场。L）完成背板内爆后的手术场。M-N）完成拉氏切除术后，小鼠定位在手术站。黄铜叉可调节X轴、Y轴和Z轴，用于定位脊髓层膜切除术部位。分叉机械地固定在手术平台上，在手术和下游应用（包括双光子生命内显微显微镜）期间提供成像领域的最佳稳定性。手术期间，手术平台安装在滑翔台上。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.脊髓窗口的解剖位置的图解描述。A）下胸椎体、脊柱和脊髓 （sc） 段的优越视图的图解描述。虚线圆圈描绘了关节过程的座位，这是背板粘附的主要支撑点。B）脊髓窗口的优越视图的图解描述。目标椎骨脊柱（此处为 T12）已被删除。一层薄薄的甘蔗覆盖脊髓。盖玻璃放在甘蔗的上面。组织粘合剂涂在横向工艺上（此处未显示，用于相邻完整椎骨脊的外露关节过程）。牙科水泥覆盖组织粘合剂。背板粘附在组织水泥上，停留在横向过程（如图所示）和相邻、完整的椎骨脊柱的关节工艺上（未在此面板中显示）。在背板边缘内部涂上一层薄薄的牙科水泥。背板在切口视图中显示，以可视化盖玻璃。C）脊髓窗口横向视图的图解描述。目标椎骨脊柱（此处为 T12）已被删除。一层薄薄的甘蔗覆盖脊髓。盖玻璃放在甘蔗的上面。组织粘合剂涂在相邻的、完整的T11和T13椎骨脊的外露关节工艺上。牙科水泥覆盖组织粘合剂。背板粘附在组织水泥上，位于相邻、完整的椎骨脊柱的横向过程和关节工艺上（如图所示）。背板在切口视图中表示;在真正的横向视图中，板干和盖玻璃将被背板的侧壁遮蔽。解剖结构是基于详细的磁共振成像的C57Bl/6脊柱由哈里森和他的同事进行11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.由eGFP可视化的紧密结微结构：Claudin-5在小鼠脊髓中通过生命内双光子显微镜。A）在健康的 eGFP：Claudin-5 鼠标的硬膜表面下 30 μm 处拍摄的单个光学部分。红色箭头表示 eGFP：Claudin-5 紧密交汇段，垂直于纵向紧密交汇轴。刻度条表示 5 μm. 内联：刻度条表示 10 μm. B）在健康小鼠脊髓的硬膜表面下延伸 100 μm 的血管网络 Z 投影。光学堆栈以 2 μm 轴向步长大小采样，包括面板 A 中的切片。未执行图像对齐。在 Z 投影中对交汇结构的清晰描绘表明连续帧之间的图像位移最小。C）从产生的 Z 堆栈以 10 μm 的间隔获取光学切片的代表性子集。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件 1.请点击此处下载此文件。
补充文件 2.请点击此处下载此文件。
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Discussion
此处描述的方法允许通过玻璃窗稳定成像小鼠的脊髓。该方法已应用于评估转基因eGFP：Claudin5+/-小鼠的BBB重塑，表达荧光BBB紧密结蛋白，但同样适用于脊髓中任何荧光蛋白或细胞的研究。
已经开发出了用于拉皮切除术和脊髓稳定的方法。所有协议都用于在成像和窗口实现期间稳定脊髓，以便直观地访问感兴趣的结构。切除的椎骨数量和可用协议的侵入性程度各不相同（例如，像本协议中那样粘在表面骨骼表面的成分，与嵌入得更深）。达瓦洛斯和阿卡索格鲁2开发了一种拉皮切除方法，使用可拆卸的钳子在脊柱的每一侧和一个夹在小鼠的尾巴底部，以稳定脊髓。这种暂停动物的创新策略缓解了一些因肺运动对手术台扩张而导致的胸腔置换。为了为水浸式显微透镜制造一口用于浸入式流体的井，在脊髓周围制作了一个明胶密封圈（例如凝胶密封），并填充了ACSF。密封轮在成像过程中可能会中断，但在会话结束时也很容易擦去，以便伤口闭合和随后的再成像。这种方法已被广泛使用12，13。其他团体也制定了其他稳定方法。弗里奇等人4手准备的修改回形针，作为固定脊柱的方法。这些经过修改的回形针用氰丙烯酸酯胶水固定在侧椎骨上，并作为永久植入手柄维护，用于可拆卸的外部夹子和外部固定叉，实现出色的运动稳定性。Cupido和他的同事提出了上述方法的变体，将覆盖在绳子2，4，12的甘蔗。Farrar和Schaffer3开发了一种四边形金属稳定器，可以允许在三个椎骨上实现玻璃窗，而不仅仅是一个。这种方法还允许在成像过程中用螺钉将脊髓连接到更大的桥稳定器上，以减少潜在的运动。还开发了一种小型单光子显微镜，直接植入层切除术成像室，用于在自由移动的小鼠体内记录单光子水平，但大多数实验室尚未获得任何专利。.换一种做法，是Weinger等人。1解剖了整个脊髓，并将其嵌入到 Agarose 中进行外生成像，这允许不可逾越的运动稳定性和进入腹腔脊髓，但可吸收血流。这些发展的一些局限性包括漫长的手术时间4，明胶密封轮2的可能中断，需要定制覆盖玻璃尺寸，以适应脊髓4的所需区域，手动修改回形针4，12，相对侵入性的手术技术12，14，和气泡形成时，使用硅弹性体3，4。
我们开发了一种替代方法，它提供了几个优点。该协议已经过优化，以减少手术期间花费的时间。而有些手术方案需要更长的手术时间，从一个半小时到一小时3;一旦掌握了，这种层切除术方法可以在大约30分钟内完成。 减少手术时间可以减少小鼠的生理压力，并促进高通量实验。该协议去除单个椎骨，并纳入稳定装置的表面粘附，使其比某些类似的协议4，5，12，14的侵入性小。与Figley等人的方法一样，利用塑料植入物，该协议提供了与声学成像5的兼容性。
为了避免因空气、水和组织折射率的差异而导致的光散射（在生命内显微镜期间），大多数协议将光学透明基质覆盖在裸露的脊髓上。常见的基材包括高纯度、低熔融温度甘蔗10、12或硅聚合物3、4、5。Agarose 具有易用性的优点，气泡形成最小，适用于急性成像过程。为了保护组织免受热损伤，在层切除术期间，将角糖加热到熔点以外，然后让它在水浴中冷却至+39°C，以便随时为暴露的脊髓应用做好准备。对于慢性成像，硅聚合物对脱水的抵抗力更强。在开发当前方案期间进行的试验中省略了阿甘蔗层或覆盖玻璃，并发现随后的光散射降低了成像的可用深度。
该协议的一个显著特征是将 3D 打印背板和支撑背板叉架结合在一起。在层切除术和窗户植入后，通过添加3D打印的椭圆形背板，用牙科水泥固定到位，使制备稳定。背板具有两种功能：第一，它提供脊髓的结构支撑和稳定;第二，它创建一个唇来容纳液体，用于显微镜的浸入目标。在此设置的原型中，使用了市售的支柱柱、适配器和固定叉;我们最近切换到自定义加工零件，如此处所述。在这两种情况下，基本特征是提供结构严谨性，以稳定成像场，以抵御心跳和呼吸引起的空间和时间扰动。虽然动物的身体松散地停留在加热垫上，但脊髓及其成像场在保持叉上轻微悬浮，这也减少了呼吸位移。塑料基板提供轻微的灵活性，以适应拧入板支架的张力。用于打印的黑色塑料颜色将极小的光线反射到荧光场中。通过这些方法，我们成功生成了无需临时对齐调整即可使用的图像堆栈。此外，本文描述的 3D 背板制作成本低廉，每次打印时每次打印的成本仅为几便士。此外，3D打印机的成本近年来有所下降。与该协议一起发布的3D打印背板结构文件（见补充文件1和2）可以很容易地修改，以满足个别实验室的需要。我们设计了背板的长尺寸，以适应通过切除胸椎12椎骨，它覆盖腰椎2/3脊髓段11造成的椎间空间。要将此技术应用于其他椎骨部分，可以修改随附的 CAD 文件。
该协议利用市售的低流量麻醉系统，部署数字集成直喷蒸发器，作为传统被动蒸发器的替代品。低流量装置的主要特点是减少了操作员接触的亚洛兰，对健康有显著的好处。低流量麻醉装置还可节省成本，因为减少使用胶质和利用房间空气而不是压缩气体。在本研究中，2%的非二聚苯基苯基在150mL/min下，加上反馈控制热支持，实现了稳定的麻醉平面和核心体温的适当维持。与此一致，已公布的数字集成蒸发器和传统蒸发器的比较还得出结论，数字集成蒸发器可产生稳定的麻醉平面，并很好地保存核心体温、心率、呼吸速率，和恢复，同时利用较少的无二苯并少15，16。
非类固醇消炎药（NSAID），如卡洛芬，可作为辅助镇痛剂在术前施用。在几个小时内，NSAIDs抑制炎症性细胞因子转录和间质水肿;多日治疗减轻神经炎疾病的严重程度，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎，多发性硬化症的动物模型17，18。特别是在神经炎病的研究中，在确定麻醉和麻醉时，必须仔细权衡卡洛芬痛感的有益作用，以与实验密切协调。适当的监管委员会。
此方法的一个限制是，它不容易在多日内重复成像会话。主要原因是背板结构太大，无法关闭皮肤。因此，有一个风险，鼠标会脱落后，从麻醉醒来的背板。如果重复成像至关重要，则可以部署多种策略，包括减小背板尺寸或更改安装件。与任何外科手术一样，操作者有一个学习曲线。需要与机构动物照料办公室和审查委员会密切协调。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
S.E. Lutz 由国家促进转化科学中心、国家卫生研究院、格兰特 KL2TR002002 和伊利诺伊大学芝加哥医学院启动基金提供支持。西蒙·阿尔福德得到RO1 MH084874的支持。内容完全由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。作者感谢哥伦比亚大学医学中心神经内科的Dritan Agalliu为Tg eGFP：Claudin-5小鼠，科学讨论，并深入了解手术协议和成像应用的发展。作者感谢加州大学欧文分校神经生物学和行为系的苏尼尔·甘地设计了立体定向装置和动物温度控制器的第一个原型，讨论了手术方案，以及双光子显微镜训练。作者还感谢史蒂夫·皮肯斯（W.Nuhsbaum，Inc.）协助定制手术立体显微镜，罗恩·利平斯基（鲸鱼制造）用于加工立体定向部件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
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