Summary
Questo protocollo descrive l'impianto di una finestra di vetro sul midollo spinale del mouse per facilitare la visualizzazione mediante microscopia intravitale.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per la laminectomia del midollo spinale e impianto della finestra di vetro per l'imaging in vivo del midollo spinale del topo. Un vaporizzatore digitale integrato viene utilizzato per ottenere un piano stabile di anestesia a bassa portata di isoflurane. Una singola colonna vertebrale viene rimossa e un vetro di copertura disponibile in commercio viene sovrapposto a un sottile letto di agarose. Una piastra posteriore in plastica stampata in 3D viene quindi apposta sulle spine vertebrali adiacenti utilizzando adesivo tissutale e cemento dentale. Una piattaforma di stabilizzazione viene utilizzata per ridurre l'artefatto di movimento dalla respirazione e dal battito cardiaco. Questo metodo rapido e senza morsetti è adatto per la microscopia acuta multi-fotone a fluorescenza. I dati rappresentativi sono inclusi per un'applicazione di questa tecnica alla microscopia a due fotoni della vascolatura del midollo spinale in topi transgenici che esprimono eGFP:Claudin-5 - una proteina di giunzione stretta.
Introduction
I modelli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti, se combinati con la microscopia intravitale, forniscono una potente piattaforma per affrontare la biologia e la fisiopatologia. Per applicare queste tecniche al midollo spinale, sono necessari protocolli specializzati per preparare il midollo spinale per l'imaging. Una di queste strategie è quella di condurre un impianto della laminectomia e del midollo spinale. Le caratteristiche principali di un protocollo ideale di microscopia includono la conservazione della struttura e della funzione del tessuto nativo, la stabilità del campo di imaging, il tempo di elaborazione rapido e la riproducibilità dei risultati. Una sfida particolare consiste nello stabilizzare il campo di imaging contro il movimento indotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Sono state riportate diverse strategie ex vivo e in vivo per raggiungere questi obiettivi1,2,3,4,5. La maggior parte dei metodi in vivo prevede il bloccaggio dei lati della colonna vertebrale2,4 ed è spesso seguito dall'impianto di un apparato metallico rigido3,4 per la stabilità durante l'intervento chirurgico e applicazioni di imaging a valle. Bloccare la colonna vertebrale può potenzialmente compromettere il flusso sanguigno e indurre il rimodellamento della proteina emato-encefalica (BBB).
Lo scopo di questo metodo è quello di rendere il midollo spinale intatto disponibile per l'imaging ottico nel topo vivente riducendo al minimo l'invasività del protocollo e migliorando i risultati. Descriviamo una singola procedura di impianto di laminectomia e vetro coperto abbinata a una piastra posteriore stampata in plastica ovale minimamente invasiva che raggiunge ancora una robusta stabilità meccanica. La piastra posteriore è direttamente aderisceto alle spine vertebrali anteriori e posteriori con cemento dentale. La piastra posteriore è dotata di bracci di estensione laterali con fori a vite che si attaccano rigidamente allo stadio del microscopio tramite un braccio metallico. Questo ancora efficacemente la vertebra anteriore e posteriore intatta allo stadio del microscopio, fornendo resistenza meccanica al manufatto di movimento che altrimenti sarebbe introdotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Il metodo è stato ottimizzato per la laminectomia di una singola vertebra al livello toracico 12, omettendo i morsetti utilizzati in strategie alternative per la stabilità durante l'imaging in vivo. La procedura è rapida, prendendo circa 30 min per mouse.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi della malattia della BBB. Il BBB è un sistema microvascolare dinamico composto da cellule endoteliali, muscoli lisci vascolari, periciti e processi del piede astrocito che forniscono un ambiente altamente selettivo per il sistema nervoso centrale (SNC). I dati rappresentativi descrivono l'applicazione di questo protocollo in topi transgenici progettati per esprimere proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP):Claudin-5, una proteina di giunzione stretta BBB. I file di stampa backplate forniti possono anche essere personalizzati per applicazioni alternative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti seguono i protocolli dell'Università dell'Illinois, del Chicago Institutional Animal Care e del Comitato d'uso. Questa è una procedura terminale.
1. Preparazione del reagente
- Preparare il fluido spinale cerebrale artificiale (aCSF) per contenere 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucosio, 10 m HEPES, 2 mM MgCl2, 6H2O, 2 mM CaCl22H2H in ddH2O. Filtro Sterile e congelamento in singoli usi. Riscaldare aCSF a bagnomaria a 39 gradi centigradi prima dell'uso.
- Caldo basso punto di fusione agarose (2%) in aCSF fino a completa dissoluzione in un bagno d'acqua impostato a 65 gradi centigradi. Durante la laminectomia, raffreddare l'agarose siè a 39 gradi centigradi in un bagno d'acqua, in modo che possa essere pronto vicino alla temperatura fisiologica per il passaggio 5.2.
Nota: La soluzione agarose può essere immagazzinata a -20 gradi centigradi in aliquote monouso. - Preparare il carprofene sterile 50 mg/mL in acqua batteristatica. Conservare a 4 gradi centigradi.
- Pulire i copricopre con il 70% di etanolo, tre lavamenti di ddH2O e conservarli a secco in un contenitore privo di polvere.
2. Stampa 3D backplate
- Utilizzare il software CAD 3D per creare un modello per le dimensioni illustrate nella Figura 1. L'interno è un'ellisse più larga sulla superficie inferiore rispetto alla stampante e tagliata con un taglio loft a un'ellisse più piccola che forma un lume sulla superficie opposta. Due bracci sporchi con fori per accettare viti si estendono lateralmente, per l'attaccamento alla forcella di fissaggio posteriore. Da questa struttura 3D, creare un file mesh 3D triangolato (. STL).
Nota: Vedere le figure 1Be file supplementari 1 e 2. - Caricare il file mesh 3D triangolato su una stampante 3D.
- Stampare le backplate utilizzando un ugello hot-end da 0,4 mm e un'altezza dello strato di 0,2 mm. Selezionare la temperatura dell'ugello di 205 gradi centigradi, la temperatura del letto di 45 gradi centigradi e la velocità di stampa di 45 mm/s.
- Valutare visivamente le backplates stampate in 3D risultanti per verificarne l'integrità strutturale(Figura 1E); il cedimento strutturale lordo (lumen assente, parete collassata) indica difetti di stampa (Figura 1F).
3. Preparazione chirurgica
- Preriscaldare la piastra di riscaldamento.
- Caricare l'isoflurane nella siringa di consegna mentre si lavora in una cappa di fumi chimici. Collegare la siringa di consegna all'unità isoflurane.
- Selezionare un mouse vecchio di 8 mesie201212-settimana. Pesare l'animale. Indurre l'anestesia utilizzando 2% isoflurane in una camera di induzione. Iniettare il carprofena a 5 mg/kg sottocutaneo.
- Posizionare il naso-cono e fornire isoflurane al 2% con una portata di 150 mL/min per la manutenzione diun piano chirurgico di anestesia (Figura 2A. Avvolgere il pad di riscaldamento con un cuscinetto assorbente usa e getta per facilità di pulizia.
- Posizionare un animale sul pad di riscaldamento alla stazione chirurgica e installare il cono naso. Lubrificare il termometro con gelatina di petrolio e inserirlo 5 mm nel retto. Nastro la sonda termometro alla coda per la stabilità. Applicare unguento oftalmico agli occhi del mouse.
- Per mantenere l'idratazione, applicare 200 gradi della soluzione della suoneria latata mediante iniezione sottocutanea ogni 30 min fino alla fine dell'esperimento.
- Spruzzare il dorsum con il 70% di etanolo, rimuovere la pelliccia con i clipper e pulire il sito con povidone-iodio.
4. Laminectomia
- Posizionare l'animale tra le barre dell'orecchio; questi mantengono la posizione della testa del mouse rispetto al naso-cone.
- Verificare che l'animale sia profondamente anetizzato come valutato dalla mancanza di riflesso pizzico interdigitale e di un modello respiratorio costante.
- Fare un'incisione rostral-caudale di 1,5 cm alla linea mediana sopra la regione lombare toracica/superiore inferiore utilizzando #11 lama (Figura 2). Separare la pelle afferrandola con pinze tallarate smussate e/o dita guantate. Utilizzare pinze per separare e staccare tutto il tessuto connettivo trasparente rimanente sotto la pelle. La muscolatura superficiale dovrebbe ora essere esposta; spostare questo con una lancia chirurgica schiuma.
- Utilizzare schiuma lance chirurgiche (o una curette) per cancellare la restante, muscolatura più profonda della vertebra bersaglio (toracico 12). Per creare un sedile per la piastra posteriore, anche cancellare il muscolo dall'aspetto posteriore del toracico 11, e l'aspetto anteriore del torace 13. Controllare qualsiasi sanguinamento applicando una leggera pressione con una lancia chirurgica o utilizzare un impulso minimo con una pistola cautaria. Continuare a rimuovere il muscolo rimanente lontano dai tendini
- Una volta rimossi i muscoli, staccate attentamente i tendini tagliando con le pinze. Ci dovrebbe essere un sacco di spazio per visualizzare e manipolare il cavo quando questo passaggio è completo. Controllare che la materia dura dello spazio intervertebrale, l'osso laminare semitrasparente, il vaso sanguigno superficiale centrale sotto l'osso e l'arteria radiante anteriore siano ora chiaramente visibili.
- Umide la regione con aCSF calda. Utilizzare il microdrill per assottigliare ripetutamente l'osso laminare con tratti rettilinei paralleli all'asse lungo del midollo spinale (Figura 2, Figura 3). Se lo si desidera, utilizzare una fase di scorrimento per ruotare la piattaforma chirurgica per un maggiore comfort ergonomico (ad esempio, un operatore destrorso può ruotare la piattaforma chirurgica in senso antiorario per la fase di perforazione).
Nota: La fase di planata utilizzata è costituita da una piastra di alluminio superiore che scorre 15 mm rispetto alla piastra di base fissa. - Afferrare delicatamente il processo spinoso superficiale con pinze e sollevare la vertebra; l'osso dovrebbe sollevarsi facilmente. Se c'è resistenza, ripetere il diradamento osseo con il trapano e, se necessario, utilizzare le forbici da bagno, facendo attenzione a puntare le punte delle forbici verso l'alto per evitare di danneggiare il tessuto.
Nota: Al fine di mantenere la dura intatta, è essenziale non tirare l'osso. - Utilizzare #4 pinze per eliminare eventuali frammenti ossei. Utilizzare una lancia chirurgica per applicare una leggera pressione costante per controllare qualsiasi sanguinamento. Risciacquare il tessuto con aCSF caldo. Non lasciare che il tessuto si asciughi.
5. Impianto in vetro coperto
- Applicare delicatamente un vetro di copertura borosilicato da 3 mm sul cavo esposto.
- Assicurarsi che l'agarose sia raffreddato a 39 gradi centigradi. Utilizzando una piccola spatola, applicare caldo 2% agarose / aCSF al bordo del vetro di copertura e consentire l'azione capillare per disegnarlo sotto la superficie.
Nota: A temperature inferiori a 39 gradi centigradi, l'agarose può iniziare a gelare. In questo caso, riscaldarsi utilizzando un bagno d'acqua o un forno a microonde. Alcuni operatori preferiscono applicare prima una goccia di agarose e posare la copertura-vetro sulla parte superiore. - Applicare l'adesivo tissutale ai processi articolari ossei esposti della vertebra adiacente intatta al livello toracico 11 vertebrale vertebrale e al livello toracico 13 della colonna vertebrale. Applicare adesivo tissutale aggiuntivo in un anello intorno al sito della laminectomia, sopra il tendine adiacente e il processo trasversale.
Nota: l'adesivo del tessuto è necessario per una corretta aderenza del cemento dentale nelle fasi successive. I processi articolari formano un sedile naturale su cui la piastra posteriore può poggiare stabilmente (Figura 3). L'adesione ai processi articolari formerà i punti più forti di attaccamento. - Mescolare il cemento dentale con l'accelerante in un vassoio di miscelazione in porcellana. Utilizzare una piccola spatola per trasferire il cemento dentale sullo strato adesivo dei tessuti. Utilizzare cemento dentale per aderire la piastra posteriore al campo chirurgico, centrato sopra la finestra. Lasciare curare 10 minuti affinché il cemento dentale guarisca.
Nota: L'aderesi saldamente della piastra posteriore ai processi articolari anteriori e posteriori fornisce la stabilità strutturale fondamentale dell'impianto. - Utilizzare ulteriore cemento dentale per riempire la base interna della piastra posteriore, e la parte inferiore della piastra posteriore : interfaccia del tessuto.
Nota: L'applicazione supplementare del cemento dentale migliora l'aderenza e riduce il rischio di perdita di liquido di immersione obiettivo al microscopio (saline) dal fondo della piastra posteriore. - Far avanzare il supporto della piastra posteriore con forcella nella posizione appropriata sopra la finestra. Fissare la piastra posteriore nel supporto backplate con viti.
Nota: Questo protocollo utilizzava un supporto per la piastra posteriore su misura (Figura 2G-u2012H). - Applicare la salina sulla piastra posteriore per verificare la perdita. In caso di perdite di liquido, asciugare l'area e applicare più cemento dentale.
6. Preparazione dell'imaging
- Trasferire l'animale sulla piattaforma chirurgica al tavolo ottico.
Nota: La nostra piattaforma chirurgica, il supporto backplate e il supporto del cono naso isoflurano possono essere trasportati tra le stazioni di imaging chirurgiche e a due fotoni come un'unità, applicando l'anestesia isoflurane continua (Figura 2D,H). Unità simili possono essere assemblate da forcelle, travi e montani di supporto ottenibili da fonti commerciali(ad esempio. ThorLabs). Per la microscopia intravitale, ci dovrebbero essere almeno 11 pollici di spazio tra l'obiettivo del microscopio e la tabella ottica per ospitare l'altezza della piattaforma chirurgica. - Apporre la piattaforma chirurgica al tavolo ottico utilizzando un montante in acciaio inossidabile e la forcella di bloccaggio controanno.
- Applicare la salina fresca nel pozzo della piastra posteriore. Abbassare una lente per l'immersione dell'acqua nel pozzo.
- Utilizzare la luce trasmessa o l'epifluorescenza per identificare l'area di interesse e messa a fuoco. Passare alla modalità di scansione laser ed eseguire l'imaging in vivo secondo l'appropriata lunghezza d'onda di eccitazione laser a due fotoni, dicrochi e filtri bandpass per i fluorofori presenti nel tessuto6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le vetrate impiantate e la microscopia a due fotoni intravitale forniscono uno strumento utile per valutare i cambiamenti dinamici nelle proteine del SNC. L'integrità funzionale della BBB è influenzata dall'espressione, dalla localizzazione subcellulare e dai tassi di turnover delle proteine di giunzione strette7. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine di giunzione strette subiscono un rimodellamento rapido e dinamico a stato costante8. La laminectomia e la preparazione della finestra di vetro attualmente descritta sono state utilizzate nei topi transgenici eGFP:Claudin-59, che portano proteine di giunzione fluorescenti strette, per valutare il rimodellamento stretto della giunzione BBB nel sistema autoimmune sperimentale modello di encefalomite (EAE) di sclerosi multipla10. Nei dati rappresentativi, l'imaging di eGFP:Claudin-5 è stato ottenuto con un microscopio a due fotoni coneccitazionedi 920 nm, un obiettivo infrarosso di oltre 40 (0,8 NA) e un filtro di emissione a fluorescenza verde ( Figura 4 ). Le pile ottiche sono state campionate a 2 gradini assiali di 2 m a 100 m sotto la superficie durale. I dati mostrano la visualizzazione delle giunzioni fluorescenti etichettate in tutto un plesso vascolare. Sono incluse singole sezioni ottiche e immagini di proiezione z (Figura 4). La chiara delineazione di strutture di giunzione strette nella proiezione z (Figura 4B) indica che lo spostamento minimo dell'immagine X-Y viene prodotto dopo il successo della laminectomia, del posizionamento della finestra e dell'impianto della piastra posteriore.
come illustrato nella Figura 1. Dispositivo di stabilizzazione backplate stampato personalizzato. A) Viste sul backplate ortogonale. B-D) Modelli a rete triangolata di superfici dorsali e ventrali della piastra posteriore. E) Piastra posteriore stampata correttamente. F) Backplate stampato in modo errato. Vedere File supplementari 1 e 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Passi chirurgici per laminectomia. A) Sistema di erogazione anestesia Isoflurane utilizzando un vaporizzatore digitale integrato tra cui (i) un display touch screen per il controllo dell'anestesia, (ii) quadranti di controllo, (iii) ingressi per moduli fisiologici aggiuntivi opzionali, (iv) concentrazione di anestesia manopola di regolazione, (v) blocco di pompa di siringa, (vi) siringa con isoflurane, (vii) vaporizzatore digitale integrato, (viii) tubo di ispirazione, (ix) tubo di ispirazione per camera di induzione, (x) camera di induzione, (xi) tubo di ispirazione per naso-cono, (xii) tubo di scadenza per nose-cone, (xiii) tubo di scadenza per camera di induzione. B) Gli strumenti utilizzati nella laminectomia includono (i) il feedback unità di riscaldamento controllato, (ii) k-accoppiato termometro rettale, (iii) pad di riscaldamento in silicone flessibile, (iv) #11 lama, (v) pinze #5, (vi) denti a titanio, (vii) irium iris forbici, (viii) microdrill osseo, (ix) pistola cautery, (x) piastra posteriore stampata in 3D, (xi) assorbente schiuma filochirurgico, (xii) vassoio di miscelazione in ceramica per la resina acrilica, (xiii) risina acrilica e accelerante, (xiii) tessuto adesivo, (xiv) vetro di copertura. C) Stereomicroscopio e piattaforma chirurgica. Durante l'intervento chirurgico, la piattaforma chirurgica si trova su uno stadio di scivolamento (base rotonda argento e nero sullo stadio del microscopio). D) Mouse situato sulla piattaforma chirurgica personalizzata con letto riscaldato, dopo l'incisione mediana superficiale. Il supporto del cono nasale isoflurano è regolabile negli assi Y e z per ospitare topi piccoli e grandi. Le barre dell'orecchio stabilizzano la testa rispetto al cono del naso. Il termosono rettale misura la temperatura interna. E) Campo chirurgico al passo della rimozione muscolare. F) Campo chirurgico dopo la rimozione del muscolo. G) Campo chirurgico durante l'assottigliamento dell'osso vertebrale. H) Campo chirurgico dopo la rimozione dell'osso vertebrale. I) Campo chirurgico durante il posizionamento della copertura. J) Campo chirurgico dopo il posizionamento della copertura. K) Campo chirurgico durante il rivestimento iniziale con acrilico. L) Campo chirurgico dopo il completamento dell'implanazione della piastra posteriore. M-N) Mouse posizionato nella stazione chirurgica dopo aver completato laminectomia. La forcella in ottone è regolabile negli assi X, Y e z per il posizionamento sul sito della laminectomia del midollo spinale. La forcella è ancorata meccanicamente alla piattaforma chirurgica per fornire una stabilizzazione ottimale del campo di imaging durante l'intervento chirurgico e le applicazioni a valle, tra cui la microscopia intravitale a due fotoni. Durante l'intervento chirurgico, la piattaforma chirurgica è montata su uno stadio di scivolamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Rappresentazione schematica del posizionamento anatomico della finestra del midollo spinale. A) Rappresentazione schematica della vista superiore di un corpo vertebrale toracico inferiore, processo spinoso e segmento del midollo spinale (sc). Un cerchio punteggiato raffigura la sede del processo articolare, il punto di supporto principale per l'adesione della piastra posteriore. B) Rappresentazione schematica della vista superiore della finestra del midollo spinale. La colonna vertebrale bersaglio (qui, T12) è stata rimossa. Un sottile strato di agarose sovrappone il midollo spinale. Una copertina poggia sulla parte superiore dell'agarose. L'adesivo del tessuto viene applicato sui processi trasversali (e, non mostrato qui, sul processo articolario esposto delle spine vertebrali adiacenti e intatte). Il cemento dentale sovrappone l'adesivo del tessuto. La piastra posteriore aderisce al cemento del tessuto, appoggiato sui processi trasversali (mostrati) e il processo articolare delle spine vertebrali adiacenti e intatte (non mostrato in questo pannello). Un ulteriore sottile strato di cemento dentale viene applicato all'interno del bordo della piastra posteriore. La piastra posteriore è raffigurata in una vista tagliata per visualizzare la vetrata. C) Rappresentazione schematica della vista laterale della finestra del midollo spinale. La colonna vertebrale bersaglio (qui, T12) è stata rimossa. Un sottile strato di agarose sovrappone il midollo spinale. Una copertura di vetro poggia sulla parte superiore dell'agarose. L'adesivo del tessuto viene applicato sul processo articolare esposto delle spine vertebrali T11 e T13 adiacenti. Il cemento dentale sovrappone l'adesivo del tessuto. La piastra posteriore aderisce al cemento del tessuto, appoggiato sui processi trasversali e il processo articolare delle spine vertebrali adiacenti e intatte (mostrate). La piastra posteriore è raffigurata in una vista tagliata; in una vera e propria vista laterale l'agarose e il vetro di copertura sarebbero oscurati dalla parete laterale della piastra posteriore. Le strutture anatomiche si basano sulla risonanza magnetica dettagliata della colonna vertebrale C57Bl/6 condotta da Harrison e colleghi 11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Microstruttura rigida giunzione visualizzata da eGFP:Claudin-5 nel midollo spinale del topo mediante microscopia intravitale a due fotoni. A) Sezione ottica singola presa a 30 m sotto la superficie durale in un topo sano eGFP:Claudin-5. Freccia rossa raffigura un segmento di giunzione stretto eGFP:Claudin-5 che si estende perpendicolare all'asse di giunzione allungale stretto. La barra della scala rappresenta un'insetto di 5 m: la barra della scala rappresenta 10 m. B) la proiezione della rete vascolare che si estende 100 m sotto la superficie dura del midollo spinale del topo sano. La pila ottica è stata campionata a 2 gradino assiale m e include la fetta del pannello A. Non è stato eseguito alcun allineamento dell'immagine. La delineazione nitida delle strutture giunzionali nella proiezione z mostra uno spostamento minimo dell'immagine tra fotogrammi consecutivi. C) Sottoinsieme rappresentativo di fette ottiche scattate a intervalli di 10 m dalla pila z risultante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo qui descritto consente l'imaging stabile del midollo spinale nei topi attraverso una finestra di vetro. Questo metodo è stato applicato per valutare il rimodellamento BBB in topi transgenici eGFP:Claudin5/- che esprimono una proteina di giunzione bBB fluorescente, ma potrebbe essere applicato altrettanto bene per gli studi su eventuali proteine fluorescenti o cellule nel midollo spinale.
Sono stati sviluppati diversi metodi per laminectomia e stabilizzazione del midollo spinale. Tutti i protocolli affrontano la stabilizzazione del midollo spinale durante l'imaging e l'implementazione della finestra per l'accesso visivo alla struttura di interesse. Il numero di vertebre rimosse e il grado di invasività dei protocolli disponibili variano(ad esempio, i componenti incollati sulla superficie dell'osso superficiale, come nel protocollo attuale, rispetto agli incorporati più profondamente). Davalos e Akassoglou2 hanno sviluppato un metodo di laminectomia utilizzando morsetti rimovibili su ciascun lato della colonna vertebrale e un morsetto alla base della coda del topo per stabilizzare il midollo spinale. Questa strategia innovativa per sospendere l'animale ha alleviato parte dello spostamento toracico causato dal movimento dei polmoni che si espande contro il tavolo chirurgico. Per creare un pozzo per contenere il fluido di immersione per una lente microscopica ad immersione dell'acqua, un bordo di guarnizione di gelatina(ad esempio Gelseal) è stato realizzato intorno al midollo spinale e riempito con aCSF. Il bordo della guarnito potrebbe essere interrotto durante l'imaging, ma potrebbe anche essere facilmente spazzato via alla fine della sessione per consentire la chiusura delle ferite e il successivo reimaging. Questo metodo è stato ampiamente adottato12,13. Altri gruppi hanno sviluppato metodi alternativi di stabilizzazione. Fenrich et al. 4 graffette di carta modificate preparate a mano per proteggere la colonna vertebrale. Queste graffette modificate sono state fissate nei pedicoli vertebrali laterali con colla cianoacrilata e mantenute come maniglie impiantate in modo permanente per una clip esterna rimovibile e una forcella esterna per un'eccellente stabilità del movimento. Cupido e colleghi hanno presentato variazioni sui metodi di cui sopra con incorporazione di agarose sovrapposti al cordone2,4,12. Farrar e Schaffer3 svilupparono uno stabilizzatore metallico quadrilatero che poteva consentire l'implementazione di una finestra di vetro su tre vertebre piuttosto che una sola. Questo metodo ha anche permesso al midollo spinale di essere collegato con viti a uno stabilizzatore di ponte più grande durante l'imaging per ridurre il potenziale movimento. È stato inoltre sviluppato un microscopio miniaturizzato monofotonico impiantato direttamente sulla camera di imaging della laminectomia in fotocamere in topi in movimento libero a livello di un fotone, ma non è ancora prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori13 . In un approccio diverso, Weinger et al. Ho sezionato un intero midollo spinale e lo ha incorporato in agarose per l'imaging ex vivo, che consente una stabilità del movimento insuperabile e l'accesso al midollo spinale ventrale, ma aboria il flusso sanguigno. Alcune limitazioni di questi sviluppi includono lungo tempo chirurgico4, possibile interruzione della gelatina sigillo cerchio2, la necessità di personalizzare le dimensioni di vetro di copertura per adattarsi all'area desiderata del midollo spinale4, manuale modifica di clip di carta4,12, tecniche chirurgiche relativamente invasive12,14, e bolle d'aria che si formano quando si utilizza l'elastomero di silicio3,4.
Abbiamo sviluppato un metodo alternativo che offre diversi vantaggi. Questo protocollo è stato ottimizzato per ridurre la quantità di tempo trascorso durante l'intervento chirurgico. considerando che alcuni protocolli chirurgici richiedono tempi di routine più lunghi che vanno da un'ora e mezza4 a un'ora3; una volta padroneggiato, questo metodo di laminectomia può essere eseguito in circa 30 min. Ridurre il tempo trascorso in chirurgia può diminuire lo stress fisiologico al mouse e facilitare la sperimentazione ad alta produttività. Questo protocollo rimuove una singola vertebra e incorpora l'adesione superficiale del dispositivo di stabilizzazione rendendolo meno invasivo di alcuni protocolli comparabili4,5,12,14. Come il metodo di Figley et al., utilizzando un impianto di plastica questo protocollo offre compatibilità con l'imaging acustico5.
Per evitare la dispersione della luce (durante la microscopia intravitale) che potrebbe essere causata dalle differenze tra gli indici di rifrazione di aria, acqua e tessuto, la maggior parte dei protocolli sovrappone un substrato otticamente trasparente sul midollo spinale esposto. I substrati comuni includono alta purezza, agarose agarose a bassa temperatura di fusione10,12 o polimeri di silicone3,4,5. Agarose offre il vantaggio di facilità d'uso, con una formazione minima di bolle, ed è appropriato per le sessioni di imaging acuto. Per proteggere il tessuto da danni da calore, è conveniente riscaldare l'agarose al di là del punto di fusione e poi lasciarlo raffreddare a 39 gradi centigradi in un bagno d'acqua durante la laminectomia, in modo che possa essere pronto al momento opportuno per l'applicazione al midollo spinale esposto. Per l'imaging cronico, i polimeri in silicone sono più resistenti alla disidratazione. Le prove pilota durante lo sviluppo dell'attuale protocollo hanno omesso lo strato di agarose o il vetro coperto sovrastante, e hanno scoperto che la conseguente dispersione luminosa ha ridotto la profondità disponibile di imaging.
Una caratteristica differenziante di questo protocollo è l'incorporazione di una piastra posteriore stampata in 3D e di un supporto porta piastra posteriore. Dopo la laminectomia e l'impianto della finestra, la preparazione viene stabilizzata dall'aggiunta di un lastra ovale stampato in 3D che viene fissata in posizione con cemento dentale. La piastra posteriore svolge due funzioni: in primo luogo, fornisce supporto strutturale e stabilizzazione del midollo spinale, e in secondo luogo, crea un labbro per contenere il fluido per obiettivi di immersione per la microscopia. Nei prototipi di questa configurazione, sono stati utilizzati montani disponibili in commercio, adattatori e forchette per la tenuta; siamo recentemente passati a parti lavorate personalizzate come raffigurato qui. In entrambi i casi, la caratteristica essenziale è quella di fornire rigore strutturale per stabilizzare il campo di imaging contro le perturbazioni nello spazio e nel tempo indotti dal battito cardiaco e dalla respirazione. Anche se il corpo dell'animale sta riposando liberamente sul pad di riscaldamento, il midollo spinale e il suo campo di imaging sono leggermente sospesi dalla forcella di tenuta, che diminuisce anche lo spostamento respiratorio. Il substrato di plastica offre una leggera flessibilità per adattare la tensione dall'avvitare nel supporto della piastra. Il colore in plastica nera utilizzato per la stampa riflette una luce minima nel campo della fluorescenza. Attraverso questi metodi, viene generato con successo stack di immagini che possono essere utilizzati senza regolazione di allineamento post hoc. Inoltre, la piastra posteriore 3D qui descritta è poco costosa da produrre, costando solo pochi centesimi di materiale per ogni stampa, una volta acquistata la stampante. Inoltre, i costi delle stampanti 3D sono diminuiti negli ultimi anni. I file strutturali di backplate stampati in 3D (vedere File supplementari 1 e 2) pubblicati con questo protocollo possono essere facilmente modificati per soddisfare le singole esigenze di laboratorio. Abbiamo progettato la lunga dimensione della piastra posteriore per ospitare lo spazio intervertebrale creato dalla rimozione della colonna vertebrale toracica 12, che sovrasta i segmenti del midollo spinale 2/3 lombo11. Per applicare questa tecnica a una sezione vertebrale diversa, è possibile modificare i file CAD che li accompagnano.
Questo protocollo utilizza un sistema di anestesia a basso flusso disponibile in commercio che distribuisce un vaporizzatore a iniezione diretta integrato digitale come alternativa al vaporizzatore passivo tradizionale. La caratteristica principale dell'unità a basso flusso è la ridotta esposizione dell'operatore all'isoflurane, un notevole vantaggio per la salute. L'unità di anestesia a basso flusso offre anche risparmi sui costi grazie al ridotto consumo di isoflurane e all'utilizzo dell'aria ambiente invece del gas compresso. Nel presente studio, il 2% di isoflurane consegnato da vaporizzatore digitale integrato a 150 mL/min, insieme a un supporto termico controllato dal feedback, ha ottenuto un piano stabile di anestesia e un'adeguata manutenzione della temperatura corporea del nucleo. Coerentemente con questo, i confronti pubblicati di vaporizzatori digitali integrati e vaporizzatori tradizionali hanno anche concluso che il vaporizzatore integrato digitale produce un piano stabile di anestesia e buona conservazione della temperatura corporea del nucleo, della frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, e il recupero utilizzando meno isoflurane15,16.
Un farmaco antinfiammatorio non steroideo (NSAID) come carprofen può essere somministrato pre-operatorio come analgesico supplementare. Nel corso di poche ore, i FANS inibiscono la trascrizione infiammatoria delle citochine e l'edema interstiziale; la somministrazione di più giorni attenua la gravità delle malattie neuroinfiammatorie tra cui l'encefalomite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla17,18. In particolare nello studio della malattia neuroinfiammatoria, gli effetti benefici dell'analgesia del carprofene devono essere attentamente ponderati contro gli effetti che modificano la malattia quando si determina l'analgesia e l'anestesia per un esperimento di stretta coordinazione con consigli di regolamentazione appropriati.
Una limitazione di questo metodo è che non è facilmente suscettibile di sessioni di imaging ripetute in più giorni. La ragione principale è che la struttura della piastra posteriore è troppo grande per chiudere la pelle sopra. Pertanto, c'è il rischio che un topo slovasa la piastra posteriore al risveglio dall'anestesia. Se l'imaging ripetuto fosse essenziale, ci sono diverse strategie che potrebbero essere implementate, tra cui la riduzione delle dimensioni della piastra posteriore o la modifica del supporto. Come con qualsiasi procedura chirurgica, c'è una curva di apprendimento per gli operatori. È necessario uno stretto coordinamento con gli uffici istituzionali di cura degli animali e con i comitati di revisione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
S.E. Lutz è supportato dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, sotto Grant KL2TR002002 e dai fondi di start-up dell'Università dell'Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford è supportato da RO1 MH084874. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali della NIH. Gli autori ringraziano Dritan Agalliu nel Dipartimento di Neurologia del Columbia University Medical Center per i topi Tg eGFP:Claudin-5, discussioni scientifiche e approfondimenti sullo sviluppo del protocollo chirurgico e delle applicazioni di imaging. Gli autori ringraziano Sunil P. Gandhi del Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento dell'Università della California, Irvine per aver progettato il primo prototipo dell'apparato stereotassico e del controllore della temperatura animale, la discussione del protocollo chirurgico e formazione in microscopia a due fotoni. Gli autori ringraziano anche Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) per l'assistenza nella personalizzazione dello stereomicroscopio chirurgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) per la lavorazione delle parti stereotassiche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
