Summary
Этот протокол описывает имплантацию стеклянного окна на спинной мозг мыши для облегчения визуализации с помощью внутривитой микроскопии.
Abstract
Этот протокол описывает метод для ламинэктомии спинного мозга и имплантации стекла окна для in vivo изображения спинного мозга мыши. Интегрированный цифровой испаритель используется для достижения стабильной плоскости анестезии при низкой скорости потока изолюран. Удаляется один позвоночник позвонка, а на тонкой агарозной кровати накладывается коммерчески доступное крышка. 3D-печатной пластиковой задней панели затем крепится к соседним позвоночника моль с помощью ткани клея и зубного цемента. Платформа стабилизации используется для уменьшения артефакта движения от дыхания и сердцебиения. Этот быстрый и без зажимов хорошо подходит для острой мультифотоновой флуоресценции микроскопии. Репрезентативные данные включены для применения этого метода к двухфотонической микроскопии сосуды спинного мозга у трансгенных мышей, выражающих eGFP:Claudin-5 - плотный протеин соединения.
Introduction
Трансгенные модели животных, выражающие флуоресцентные белки, в сочетании с интравитальной микроскопией, обеспечивают мощную платформу для решения биологии и патофизиологии. Чтобы применить эти методы к спинному мозгу, специальные протоколы необходимы для подготовки спинного мозга для визуализации. Одной из таких стратегий является проведение имплантации ламинэктомии и окна спинного мозга. Ключевыми особенностями идеального протокола ламинэктомии для микроскопии являются сохранение структуры и функции родной ткани, стабильность поля изображения, быстрое время обработки и воспроизводимость результатов. Особая задача заключается в стабилизации поля изображения против движения, вызванного дыханием и сердцебиением. Несколько ex vivo и in vivo стратегии, как сообщается, для достижения этихцелей 1,2,3,4,5. Большинство методов in vivo включают зажим сторонпозвоночника2,4 и часто сопровождается имплантированием жесткого металлического аппарата3,4 для стабильности во время операции и приложения для визуализации ниже по течению. Зажим позвоночника может потенциально поставить под угрозу кровоток и вызвать гематоэнцефалический барьер (BBB) белка ремоделирования.
Цель этого метода состоит в том, чтобы сделать неповрежденный спинной мозг доступным для оптической визуализации в живой мыши, минимизируя инвазивность протокола и улучшая результаты. Мы описываем одну процедуру имплантации ламинэктомии и крышки стекла в паре с минимально инвазивной овальной пластиковой 3D-печатной задней панелью, которая все еще достигает надежной механической стабильности. Задняя панель непосредственно прилипает к передней и задней позвоночника с зубным цементом. Задняя панель оснащена боковыми удлинительными руками с винтовыми отверстиями, которые жестко прикрепляются к стадии микроскопа через металлическую руку. Это эффективно якоря нетронутыми переднего и заднего позвонка на стадии микроскопа, обеспечивая механическое сопротивление движения артефакт, который в противном случае были бы введены дыхание и сердцебиение. Метод был оптимизирован для ламинэктомии одного позвонка на грудном уровне 12, опуская зажимы, используемые в альтернативных стратегиях стабильности во время in vivo изображений. Процедура быстрая, принимая приблизительно 30 минут в мышь.
Этот протокол может быть использован для изучения механизмов заболевания BBB. BBB является динамической микрососудистой системы, состоящей из эндотелиальных клеток, сосудистой гладкой мышцы, перицитов и астроцитов ноги процессов, которые обеспечивают весьма селективную среду для центральной нервной системы (ЦНС). Представительные данные изображают применение этого протокола в трансгенных мышах, разработанных для выражения повышенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP):Claudin-5, плотный белок соединения BBB. Предоставленные файлы печати задней панели также могут быть настроены для альтернативных приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты следуют протоколам Комитета по институциональному уходу и использованию животных ВУЗа. Это терминальная процедура.
1. Подготовка реагента
- Подготовка искусственного спинного мозга (aCSF), чтобы содержать 125 мМ NaCl, 5 мм KCl, 10 мм глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl26H2O, 2 мМ CaCl22H2O в ddH2O. Стерильный фильтр и заморозить в индивидуальном использовании aliquots. Теплый aCSF в водяной бане до 39 градусов по Цельсию перед использованием.
- Теплая агароза с низкой температурой плавления (2%) в aCSF до полного растворения в водяной бане, установленной до 65 градусов по Цельсию. Во время ламинэктомии, охладить расплавленный агарозный аликот до 39 градусов по Цельсию в водяной бане, так что он может быть готов при близкой к физиологии температуры для шага 5.2.
Примечание: Раствор агарозы может храниться при -20 градусов по Цельсию в одноразовых aliquots. - Приготовьте стерильный 50 мг/мл карпрофена в бактериостатической воде. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
- Чистые крышки с 70% этанолом, три стира ddH2O, и хранить сухие в контейнере без пыли.
2. Задняя панель 3D-печати
- Использование программного обеспечения 3D CAD используется для создания модели для размеров, показанных на рисунке 1. Интерьер эллипс широкий на нижней поверхности по отношению к принтеру и вырезать с lofted вырезать на меньший эллипс формирования просвет на противоположной поверхности. Два проецирующих оружия с отверстиями для приема винтов простираются слажен, для крепления к вилке для удержания задней панели. Из этой 3D-структуры создайте триангуляционный 3D-файл сетки (. Файл STL).
Примечание: См. Рисунок 1Bqu2012D и дополнительные файлы 1 и 2. - Загрузите триангуляционный 3D-файл сетки на 3D-принтер.
- Печать задних пластин с использованием 0,4 мм горячего напла и высоты слоя 0,2 мм. Выберите температуру сопла 205 градусов по Цельсию, температуру кровати 45 градусов по Цельсию, и скорость печати 45 мм/с.
- Оцените резонирующую 3D-печатную заднюю панели визуально для структурной целостности(рисунок 1E); грубый структурный сбой (отсутствует просвет, рухнувщая стена) указывает на дефекты печати(рисунок 1F).
3. Хирургическая подготовка
- Разогреть грелку.
- Нагрузка isoflurane в доставку шприц во время работы в химическом капоте дыма. Прикрепите шприц доставки к изолюрану.
- Выберите мышь 8'u201212-недельной давности. Взвесьте животное. Индуцировать анестезию с использованием 2% изолюран в индукционной камере. Вводят карпрофен при подкожном колотике 5 мг/кг.
- Расположите носовой конус и доставьте изофлуран на 2% со скоростью потока 150 мл/мин для обслуживания хирургической плоскости анестезии(рисунок 2Aqu2012E). Оберните грелку с одноразовой абсорбцивент площадку для удобства очистки.
- Расположите животное на грелке на хирургической станции и установите носовой конус. Смазать термометр с вазелин и вставить его 5 мм в прямую кишку. Лента термометр зонд акбар для стабильности. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
- Для поддержания гидратации нанесите 200 лактационного раствора Ringer путем подкожной инъекции каждые 30 минут до окончания эксперимента.
- Спрей снизить синицу с 70% этанола, удалить мех с клиперами, и очистить сайт с повидон-йод.
4. Ламинэктомия
- Расположите животное между ушными прутьями; они поддерживают положение головы мыши по отношению к носу-конусу.
- Подтвердите, что животное глубоко обезглавлено, как оценивается отсутствием межцифрового рефлекса щепотки и устойчивой дыхательной паттерн.
- Сделайте 1,5 см рострал-каудальный разрез в средней линии над нижней грудной/верхней поясничной областью, используя #11 лезвие(рисунок 2). Разделите кожу, схватив ее тупыми зубчатыми щипками и/или перчатками. Используйте щиптем, чтобы отделить и очистить назад любые оставшиеся прозрачные соединительной ткани под кожей. Поверхностная мускулатура теперь должна быть разоблачена; вытеснить это с пеной хирургического копья.
- Используйте пены хирургических копий (или кюретт), чтобы очистить от оставшихся, более глубокие мускулатуры целевого позвонка (торакальный 12). Чтобы создать место для задней панели, а также очистить мышцы от заднего аспекта грудной 11, и передний аспект грудной 13. Контролируйте любое кровотечение, применяя мягкое давление с помощью хирургического копья или используйте минимальный пульс с помощью каутери. Продолжайте удалять оставшиеся мышцы от сухожилий с помощью щипцы
- После того, как мышцы удаляются, тщательно отсоединить сухожилия, разрезая щипцы. Там должно быть много места для визуализации и манипулирования шнур, когда этот шаг будет завершен. Убедитесь, что дюра материи межпозвонкового пространства, полупрозрачной ламинар кости, центрального поверхностного кровеносных сосудов под костью, и передней излучающей артерии в настоящее время хорошо видны.
- Влажный регион с теплым aCSF. Используйте microdrill, чтобы повторно тонкие ламинар кости с помощью прямых ударов параллельно длинной оси спинного мозга(Рисунок 2, Рисунок 3). При желании используйте этап скольжения для вращения хирургической платформы для повышения эргономичного комфорта (например, оператор правой руки может вращать хирургическую платформу против часовой стрелки для этапа бурения).
Примечание: Используемый этап скольжения построен из верхней алюминиевой пластины, которая скользит 15 мм по отношению к фиксированной базовой пластине. - Аккуратно схватить поверхностный спинной процесс с щипками и поднять позвонок; кость должна легко отойти. Если есть сопротивление, повторить истончение костей с дрелью и при необходимости использовать ножницы радужной оболочки глаза, стараясь направить ножницы наконечники вверх, чтобы избежать повреждения ткани.
Примечание: Для того, чтобы сохранить dura нетронутыми, важно не буксир на кости. - Используйте #4 щипцы, чтобы очистить любые кости осколки. Используйте хирургическое копье, чтобы применить мягкое устойчивое давление, чтобы контролировать любое кровотечение. Промыть ткань теплым aCSF. Не допускайте высыхания тканей.
5. Имплантация крышки стекла
- Аккуратно нанесите 3 мм боросиликатного крышки на открытый шнур.
- Убедитесь, что агароуз охлаждается до 39 градусов по Цельсию. Используя небольшой шпатель, нанесите теплый 2% агарозы /ACSF к краю крышки стекла и позволяют капиллярного действия, чтобы привлечь его под поверхностью.
Примечание: При температурах ниже 39 градусов по Цельсию агарозможет начать геля. Если это происходит, разогреть с помощью водяной ванны или микроволновой печи. Некоторые операторы предпочитают сначала применить одну каплю агарозы и заложить крышку стекла на вершине. - Нанесите клей ткани к открытым костлявым суставным процессам нетронутого смежного позвонка на грудном уровне 11 позвоночной позвоночника и грудного уровня 13 позвоночной позвоночника. Нанесите дополнительный клей ткани в кольцо вокруг участка ламинэктомии, над соседним сухожилием и поперечным процессом.
Примечание: Ткань клей требуется для надлежащего присоединения зубного цемента в последующие шаги. Суставные процессы образуют естественное сиденье, на котором задняя панель может лежать(рисунок 3). Присоединение к суставным процессам будет образовывать сильные точки привязанности. - Смешайте зубной цемент с ускорителем в фарфоровом подносе для смешивания. Используйте небольшой шпатель для передачи зубного цемента на ткань клеевого слоя. Используйте зубной цемент, чтобы придерживаться задней панели к хирургическому полю, по центру над окном. Разрешить 10 минут для зубного цемента для лечения.
Примечание: Твердая прижатка задней панели к передней и задней суставных процессам обеспечивает фундаментальную структурную стабильность имплантата. - Используйте дополнительный зубной цемент для заполнения внутренней базы задней панели, и нижней части задней панели : ткань интерфейса.
Примечание: Дополнительное применение зубного цемента улучшает присоединение и снижает риск утечки микроскопа объективного погружения жидкости (солин) из нижней части задней панели. - Предварительно раздвитом держателя задней панели в соответствующее положение над окном. Закрепите заднюю панель в держатель задней панели с винтами.
Примечание: В этом протоколе использовался пользовательский держатель задней панели(Рисунок 2Gnou2012H). - Применить солин на задней панели для проверки на утечку. Если какая-либо жидкость протекает, высушите область и нанесите больше зубного цемента.
6. Подготовка изображений
- Перенесите животное на хирургическую платформу на оптический стол.
Примечание: Наша хирургическая платформа, держатель задней панели, и изофларан нос-конус держатель может быть транспортирован между хирургическими и двух-фотонных станций визуализации, как один блок, при применении непрерывной изолюранской анестезии (Рисунок 2D,H). Аналогичные единицы могут быть собраны из холдинга вилки, балки, и вспомогательные столба должности, полученные из коммерческих источников(например. ThorLabs). Для интравитальной микроскопии, должно быть по крайней мере 11 дюймов зазора между целью микроскопа и оптическим столом для приспособления высоты хирургической платформы. - Прикрепите хирургическую платформу к оптическому столу с помощью монтажного столба из нержавеющей стали и контрскучной зажимной вилки.
- Нанесите свежий сосуд в колодец задней панели. Опустите в колодец объектив погружения.
- Используйте передаваемый или эпифлуоресценционный свет для определения области интереса и фокусировки. Переключитесь на режим лазерного сканирования и выполняйте виво-изображение в соответствии с соответствующими двухфотонными лазерными волничными волновыми длинами, дихроками и фильтрами пласта для флюорофоров, присутствующих в ткани6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Имплантированные стеклянные окна и интравитальная двухфотонная микроскопия являются полезным инструментом для оценки динамических изменений белков ЦНС. На функциональную целостность BBB влияет экспрессия, субклеточная локализация и скорость текучести плотных соединений7. Предыдущие исследования показали, что плотные белки соединения проходят быструю и динамичную ремоделирование при стабильном состоянии8. В настоящее время описано ламинэктомии и стеклянные окна препарат был использован в трансгенных eGFP:Claudin-5 мышей9, которые несут флуоресцентные плотные белки соединения, для оценки BBB жесткой перекресток ремоделирования в экспериментальной аутоиммунных энцефаломиелит (ЕАЕ) модель рассеянного склероза10. В репрезентативных данных, изображение eGFP:Claudin-5 было достигнуто с двухфотонным микроскопом с 920 нм возбуждением, инфракрасной целью 40 "(0,8 NA) и зеленым флуоресценцией излучения фильтра (Рисунок 4). Оптические стеки были отобраны на 2 мкм осевых шагов до 100 мкм под поверхностью dural. Данные изображают визуализацию флуоресцентно обозначенных соединений по всему сосудистому сплетению. Единые оптические срезы иизображения с проекцией на цп. Четкое разграничение плотных структур соединения в проекции(рисунок 4B) указывает на то, что минимальное смещение изображения X-Y производится после успешного ламинэктомии, размещения окон и имплантации задней панели.
Рисунок 1. Пользовательские печатные задней панели стабилизации устройства. A) Ортогональные виды на заднюю панель. B-D) Триангуляционные сетчатые модели спинных и брюшных поверхностей задней панели. E) Правильно напечатанная задняя панель. F) Неправильно напечатана задняя панель. Смотрите Дополнительные файлы 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Хирургические шаги для ламинэктомии. A) Изофлюранская система доставки анестезии с использованием интегрированного цифрового испарителя, включая (i) сенсорный дисплей экрана для управления анестезией, (ii) контрольные циферблаты, (iii) входы для дополнительных модулей физиологии дополнения, (iv) концентрация анестезии регулировка ручка, (v) шприц насос толкатель блока, (vi) шприц с изофлуран, (vii) интегрированный цифровой испаритель, (viii) вдохновение трубки, (ix) вдохновение трубки для индукционной камеры, (x) индукционной камеры, (xi) вдохновение трубки для нос-конус, (xii) истечение медля тюбинг для носового конуса, (xiii) трубки истечения для индукционной камеры. B) Инструменты, используемые в ламинэктомии включают (i) обратная связь контролируемый нагревательный блок, (ii) K-связанный ректальный термометр зонд, (iii) гибкая силиконовая грелка, (iv) #11 лезвие, (v) #5 щипчины, (vi) зубчатые щипчинки титана, (vii) титановая радужка ножницы, (viii) кости microdrill, (ix) cautery пистолет, (x) 3D печатных backplate, (xi) абсорбирующая пена хирургические копья, (xii) керамические смешивания лоток для акриловой смолы, (xiii) акриловой смолы и акселерации, (xiii) ткани клей, (xiv) офтальмоденсивская смазка, крышка стекла. C) Стереомикроскоп и хирургическая платформа. Во время операции хирургическая платформа находится на стадии скольжения (серебряная и черная круглая основа на стадии микроскопа). D) Мышь расположена на пользовательской хирургической платформе с подогревом кровати, после поверхностного разреза средней линии. Держатель изофруран носекона регулируется в Y- и осей для размещения малых и больших мышей. Ухо баров стабилизировать голову по отношению к nosecone. Ректальный термозонд измеряет температуру ядра. E) Хирургическое поле на этапе удаления мышц. F) Хирургическое поле после удаления мышц. G) Хирургическое поле во время истончения позвоночной кости. H) Хирургическое поле после удаления позвоночной кости. I) Хирургическое поле во время размещения подобия. J) Хирургическое поле после размещения подкрытия. K) Хирургическое поле при первичном покрытии акрилом. L) Хирургическое поле после завершения задней импланации. М-Н) Мышь расположена в хирургической станции после завершения ламинэктомии. Латунной вилкой регулируется в X-, Y-, и осей для позиционирования над участками ламинэктомии спинного мозга. Вилка механически закреплена на хирургической платформе, чтобы обеспечить оптимальную стабилизацию поля изображения во время операции и вниз по течению приложений, включая двухфотонную интравитальной микроскопии. Во время операции хирургическая платформа устанавливается на планерную стадию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Схематическое изображение анатомического размещения окна спинного мозга. A) Схематическое изображение превосходного вида нижнего грудного позвоночного тела, спинномозгового процесса и спинного мозга (sc) сегмента. Пунктирный круг изображает место суставного процесса, основной опорной точки для сцепленности стыковки. B) Схематическое изображение превосходного вида окна спинного мозга. Целевой позвоночник позвонка (здесь, T12) был удален. Тонкий слой агарозы накладывает спинной мозг. Крышка лежит на верхней части агарозы. Ткань клей наносится на поперечные процессы (и, не показано здесь, на подвергаются суставной процесс смежных, нетронутыми позвоночника). Зубной цемент накладывает ткань на клей. Задняя панель прилипает к тканевому цементу, опираясь на поперечные процессы (показано) и суставной процесс смежных, нетронутых позвоночников позвонков (не показанный в этой панели). Дополнительный тонкий слой зубного цемента наносится на внутреннюю часть обода задней панели. Задняя панель изображена в вырезе зрения, чтобы визуализировать крышку стекла. C) Схематическое изображение бокового вида окна спинного мозга. Целевой позвоночник позвонка (здесь, T12) был удален. Тонкий слой агарозы накладывает спинной мозг. Крышка стекла лежит на верхней части агарозы. Ткань клей применяется на подвергаются суставной процесс смежных, нетронутыми T11 и T13 позвоночника позвонков. Зубной цемент накладывает ткань на клей. Задняя панель прилипает к тканевому цементу, опираясь на поперечные процессы и суставной процесс смежных, нетронутых позвоночников позвоночника (показано). Задняя панель изображена в вырезом зрения; в истинном боковом виде агарозия и крышка-стекло будут скрыты боковой стеной задней панели. Анатомические структуры основаны на детальной магнитно-резонансной томографии позвоночника C57Bl/6, проведенной Харрисоном и его коллегами 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Плотная микроструктура соединения, визуализированная eGFP:Claudin-5 в спинном мозге мыши с помощью интражизненной двухфотонной микроскопии. A) Одиночный оптический раздел, взятый на 30 мкм под поверхностью dural в здоровой мыши eGFP:Claudin-5. Красная стрелка изображает eGFP:Claudin-5 плотный сегмент соединения, простирающийся перпендикулярно продольной плотной оси соединения. Шкала бар представляет 5 мкм. Всет: шкала бар представляет 10 мкм. B) - проекция сосудистой сети, простирающаяся на 100 мкм под поверхностью дюральной части здорового спинного мозга мыши. Оптический стек был отобран при 2 мкм осевого размера шага и включает в себя ломтик из панели А. Выравнивание изображения не выполнено. Резкое разграничение соединений в проекции на й демонстрирует минимальное смещение изображения между последовательными кадрами. C) Представитель подмножество оптических ломтиков, взятых с интервалом 10 мкм от резцирующего стека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет стабильно сделать визуализацию спинного мозга у мышей через стеклянное окно. Этот метод был применен для оценки BBB ремоделирования в трансгенных eGFP: Claudin5 /- мышей, которые выражают флуоресцентный BBB плотный белок соединения, но он может быть применен одинаково хорошо для исследований любых флуоресцентных белков или клеток в спинном мозге.
Разработано несколько методов ламинэктомии и стабилизации спинного мозга. Все протоколы касаются стабилизации спинного мозга во время визуализации и внедрения окон для визуального доступа к структуре интереса. Количество удаленных позвонков и степень инвазивности имеющихся протоколов варьируются(например, компоненты, приклеенные на поверхностную кость, как в настоящем протоколе, по сравнению со встроенными более глубоко). Давалос и Акассоглу2 разработали метод ламинэктомии с использованием съемных зажимов с каждой стороны позвоночника и одного зажима у основания хвоста мыши для стабилизации спинного мозга. Эта инновационная стратегия, чтобы приостановить животное освобождены некоторые из грудной смещения, вызванного движением легких расширения против хирургического стола. Чтобы создать колодец для содержания жидкости для погружения в микроскопическую линзу, обода желатина тюленя (например, гелил) было сделано вокруг спинного мозга и заполнено aCSF. Обод печать может быть нарушена во время визуализации, но также может быть легко уничтожены в конце сессии, чтобы включить замыкание раны и последующее повторное изображение. Этот метод был широко принят12,13. Другие группы разработали альтернативные методы стабилизации. Генрих и др. 4 подготовленные вручную модифицированные скрепки как способ обезопасить позвоночник. Эти модифицированные скрепки были закреплены в боковых позвоночных pedicles с cyanoacrylate клей и поддерживается в качестве постоянно имплантированных ручки для съемной внешней клип и внешней вилкой для отличной стабильности движения. Купидо и его коллеги представили вариации на вышеупомянутые методы с включением агарозы, наложенной на шнур2,4,12. Фаррар и Шаффер3 разработали четырехсторонний металлический стабилизатор, который мог бы позволить для реализации стеклянного окна на три позвонка, а не только один. Этот метод также позволил спинного мозга, которые будут прикреплены с винтами к большему стабилизатормоста моста во время визуализации, чтобы уменьшить потенциальное движение. Миниатюрный однофотонный микроскоп, имплантированный непосредственно в камеру визуализации ламинэктомии, также был разработан для записи in vivo у свободно движущихся мышей на уровне одного фотона, но еще не доступен большинству лабораторий13 . В другом подходе, Weinger и др. 1 расчленил весь спинной мозг и встроил его в агарозу для визуализации ex vivo, что обеспечивает непревзойденную стабильность движения и доступ к брюшному спинному мозгу, но аннулирует кровоток. Некоторые ограничения этих разработок включают длительные хирургическое время4, возможное нарушение желатина печать обода2, необходимость настроить крышку стекла размеры, чтобы соответствовать желаемой области спинного мозга4, руководство модификация скрепки4,12, относительно инвазивных хирургических методов12,14,и пузырьки воздуха формирования при использовании кремния эластомер3,4.
Мы разработали альтернативный метод, который предлагает несколько преимуществ. Этот протокол был оптимизирован, чтобы уменьшить количество времени, затрачиваемого во время операции. В то время как некоторые хирургические протоколы требуют более длительного времени процедуры от полутора часовдо часа3; после освоения, этот метод ламинэктомии может быть выполнен примерно за 30 мин. Уменьшение времени, проведенного в хирургии может уменьшить физиологические нагрузки на мышь, и облегчить более высокую пропускную работу экспериментов. Этот протокол удаляет один позвонок, и включает в себя поверхностные сливки стабилизационного устройства, что делает его менее инвазивным, чем некоторые сопоставимые протоколы4,5,12,14. Как метод Figley et al. ,используя пластиковый имплантат, этот протокол предлагает совместимость с акустической визуализацией5.
Чтобы избежать рассеяния света (во время интравитальной микроскопии), которые могут быть вызваны различиями между рефракционными показателями воздуха, воды и тканей, большинство протоколов накладывают оптически прозрачный субстрат на открытый спинной мозг. Общие субстраты включают высокую чистоту, низкоплавленную температуру агарозы10,12 или силиконовых полимеров3,4,5. Agarose предлагает преимущество простоты использования, с минимальным образованием пузырьков, и подходит для острых сеансов визуализации. Для защиты ткани от теплового повреждения, это удобно для нагрева агарозы за пределами точки плавления, а затем дать ему остыть до 39 градусов по Цельсию в водяной бане во время ламинэктомии, так что он может быть готов в соответствующее время для применения в открытых спинного мозга. При хронической визуализации силиконовые полимеры более устойчивы к обезвоживанию. Пилотные испытания при разработке текущего протокола опустили либо слой агарозы, либо надлежащую крышку-стекло, и обнаружили, что последующее рассеяние света уменьшило доступную глубину изображения.
Дифференивная особенность этого протокола заключается в включении 3D-печатной задней панели и поддерживающего держателя вилки. После ламинэктомии и имплантации окон препарат стабилизируется добавлением 3D-печатной овальной задней панели, которая фиксируется на месте зубным цементом. Задняя панель выполняет две функции: во-первых, она обеспечивает структурную поддержку и стабилизацию спинного мозга, а во-вторых, она создает губу для хранения жидкости для целей погружения для микроскопии. В прототипах этой установки использовались коммерчески доступные столбы, адаптеры и вилки для хранения; недавно мы перешли на пользовательские детали, как показано здесь. В любом случае, важной особенностью является обеспечение структурной строгости для стабилизации поля изображения против возмущений в пространстве и времени, вызванных сердцебиением и дыханием. Несмотря на то, что тело животного свободно отдыхает на грелке, спинной мозг и его поле изображения слегка подвешены к вилке, что также уменьшает перемещение дыхательных путей. Пластиковый субстрат предлагает небольшую гибкость для размещения напряженности от завинчивания в держатель пластины. Черный пластиковый цвет, используемый для печати, отражает минимальный свет в поле флуоресценции. С помощью этих методов мы успешно генерируем стеки изображений, которые могут быть использованы без специальной корректировки выравнивания. Кроме того, 3D backplate описано здесь недорого производить, стоимостью всего в копейки в материале для каждого печати, как только принтер покупается. Кроме того, в последние годы снизились расходы на 3D-принтеры. 3D печатные задней панели структурных файлов (см. Дополнительные файлы 1 и 2), опубликованные с этим протоколом могут быть легко изменены для удовлетворения индивидуальных потребностей лаборатории. Мы разработали длинное измерение задней панели для размещения межпозвонкового пространства, созданного путем удаления грудной 12 позвоночника позвонка, который перекрывает поясничного 2/3 сегментов спинного мозга11. Чтобы применить этот метод к другому разделу позвонков, сопровождающие CAD файлы могут быть изменены.
В этом протоколе используется коммерчески доступная система анестезии с низким потоком, которая развертывает цифровой интегрированный испаритель прямого впрыска в качестве альтернативы традиционному пассивному испарителю. Главной особенностью низкоточного блока является снижение воздействия изофрураном оператора, что является существенным преимуществом для здоровья. Низкоточный аппарат анестезии также обеспечивает экономию средств за счет снижения потребления изофруран и использования комнатного воздуха вместо сжатого газа. В настоящем исследовании 2% изофлуран, поставляемый интегрированным цифровым испарителем на 150 мл/мин, вместе с тепловой поддержкой, управляемой обратной связью, достигли стабильной плоскости анестезии и надлежащего поддержания температуры основного тела. В соответствии с этим, опубликованные сравнения цифровых интегрированных испарителей и традиционных испарителей также пришли к выводу, что цифровой интегрированный испаритель дает стабильную плоскость анестезии и хорошее сохранение температуры тела, частота сердечных заключенией, дыхательной частоты, и восстановление при использовании менее изолюран15,16.
Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), такие как карпрофен может быть введен предварительно в качестве дополнительного анальгетика. В течение нескольких часов НПВП подавляют воспалительные транскрипции цитокинов и интерстициальный отек; многодневное введение смягчает тяжесть нейровоспалительных заболеваний, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, животная модель рассеянного склероза17,18. В частности, при изучении нейровоспалительных заболеваний, благотворное воздействие карпрофена анальгезии должны быть тщательно взвешены против болезни изменения эффектов при определении обезболивания и анестезии для эксперимента в тесной координации с соответствующих регулирующих советов.
Ограничение этого метода заключается в том, что он не поддается повторным сеансам визуализации в течение нескольких дней. Основная причина заключается в том, что задняя структура слишком велика, чтобы закрыть кожу. Таким образом, существует риск того, что мышь выдвинет заднюю панель после пробуждения от анестезии. Если повторная визуализация была необходима, Есть несколько стратегий, которые могут быть развернуты, в том числе уменьшение размера задней панели, или изменение крепления. Как и в любой хирургической процедуре, есть кривая обучения для операторов. Необходима тесная координация с учреждениями по уходу за животными и наблюдательными советами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
S.E. Lutz поддерживается Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения под руководством Гранта KL2TR002002 и начального медицинского фонда Чикагского медицинского колледжа. Саймона Алфорда поддерживает RO1 MH084874. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH. Авторы благодарят Дритан Agalliu в кафедре неврологии в Колумбийском университете медицинский центр для Tg eGFP: Claudin-5 мышей, научных дискуссий, а также понимание развития хирургического протокола и изображений приложений. Авторы благодарят Сунила. Ганди на кафедре нейробиологии и поведения Калифорнийского университета в Ирвине за разработку первого прототипа стереотаксического аппарата и контроллера температуры животных, обсуждение хирургического протокола и обучение двухфотонной микроскопии. Авторы также благодарят Стива Пикенса (W. Nuhsbaum, Inc.) за помощь в настройке хирургического стереомикроскопа и Рона Липински (Производство китов) за обработку стереотактических деталей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
