Summary
Этот протокол описывает очищение F1-АТФазы из искусственного насекомых стадии Трипаносомы brucei. Процедура дает чистый, однородной и активный комплекс подходит для исследования структурных и ферментативные.
Abstract
F1-АТФазы является мембрана внешняя каталитического подкомплекса F-тип АТФ-синтазы, фермент, который использует Протон движущей силой через биологические мембраны для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Изоляции нетронутыми F1-АТФазы от его собственного источника является необходимым условием для характеризуют состав белков, кинетические параметры и чувствительность к ингибиторы фермента. Очень чистые и однородные F1-АТФазы может использоваться для структурных исследований, которые дают понимание молекулярных механизмов синтеза АТФ и гидролиз. Эта статья описывает процедуру для очистки F1-АТФазы от Trypanosoma brucei, возбудителя африканской trypanosomiases. F1-АТФазы изолирован от митохондриальной пузырьки, которые получаются путем гипотонический лизис из трипаносом в vitro культивировали. Везикулы механически фрагментированы, sonication и F1-АТФазы освобождается от внутренней митохондриальной мембраны экстракцией хлороформ. Энзимный комплекс является неразделимая подряд анион обмен и хроматография размер исключение. Чувствительных масс-спектрометрии методы показали, что очищенный комплекс лишена практически любых белковых загрязнений и, таким образом, представляет собой подходящий материал для определения структуры кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии. Изолированные F1-АТФазы экспонатов гидролитическая деятельность СПС, которая может быть полностью тормозится азид натрия, мощным ингибитором synthases F-типа СПС. Очищенный комплекс остается стабильным и активным в течение трех дней при комнатной температуре. Количество осадков в сульфат аммония используется для длительного хранения. Аналогичные процедуры используются для очистки F1- ATPases с тканями растений и млекопитающих, дрожди или бактерии. Таким образом, представленные протокол может служить в качестве ориентира для F1-АТФазы изоляции от других живых организмов.
Introduction
F-типа СПС synthases мембраны прыгните вращающихся multiprotein комплексов транслокации Протон что пара через преобразователя энергии мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов с образованием АТФ. Молекулярные вращательного механизма синтеза АТФ известно главным образом из-за структурных исследований очищенный бактериальных и митохондриальной synthases СПС и их Субкомплексы1. F-тип АТФ-синтазы организована в внутренние мембраны и мембраны внешняя постановление. Мембраны внешняя часть, известный как F1-АТФазы, содержит три катализатора сайты, где происходит фосфорилирование аденозиндифосфат (ADP) СПС или обратной реакции. F1-АТФазы могут быть освобождены экспериментально от мембраны неотъемлемой части молекулы при сохранении ее способность гидролизуют, но не синтезировать, СПС. Мембраны прыгните сектора, называется Fo, посредником транслокации белка, который управляет вращение центральной частью фермента. F1 и Fo секторов соединены Центральной и периферической стеблей.
Первые попытки очистить F1-АТФазы от начинающего дрожжей и бычьего сердца митохондрий Дата обратно в 1960-х. Эти протоколы, используемые извлечены митохондрий, которые были сорваны sonication, фракционированный высыпанием аммония или протамина сульфат, следуют необязательные хроматографии шаги и термической обработки2,3,4 ,5,6. Очистки была значительно улучшена и упрощена путем использования метилхлороформа, который легко выпускает F1-АТФазы от митохондриальной мембраны фрагменты7. Хлороформ добыча затем используется для извлечения F1- ATPases от различных животных, растений и бактерий источников (например, печени крыс8, кукуруза9, Арум maculatum10и Escherichia coli 11). Дальнейшей очистки хлороформ выпущена F1-АТФазы хромотографией сродства или размер исключение (SEC) принесли очень чистый белок комплекс, который подходит для определения структуры с высоким разрешением, рентгеноструктурного анализа, как документально подтверждено структур F1-АТФазы из сердца быка12,13 и14 Saccharomyces cerevisiae. F1-АТФазы структуры были определены также от организмов, которые трудны для того культивировать и, таким образом, сумма первоначального биологического материала было ограничено. В данном случае, F1-АТФазы подразделения были искусственно выразил смонтирован в комплекс в E. coli, и весь гетерологичных фермента был очищен, близость хроматографии через тегами субъединицы. Такой подход привел к определению F1-АТФазы структур из двух термофильных бактерий видов,15 Geobacillus stearothermophilusи Caldalkalibacillus thermarum16, 17. Однако эта методология довольно непригодна для eukaryotic F1- ATPases, поскольку он опирается на прокариот protheosynthetic аппарат, Посттрансляционная обработки и сложные Ассамблеи.
Добыча на основе хлороформ ранее использовался для изоляции F1- ATPases от digenetic одноклеточными паразитами Trypanosoma cruzi18 и т. brucei19, важные млекопитающих патогенов, вызывая Америки и Африканские trypanosomiases, соответственно и от Моногенные паразитов насекомых Crithidia fasciculata20. Эти очищения привело лишь к простой описание F1- ATPases, так как не нисходящие приложения были использованы в полной мере характеризуют состав, структура и ферментативные свойства комплекса. Эта статья описывает оптимизированный метод для F1-АТФазы очищение от стадии искусственного насекомого жизненного цикла т. brucei. Метод разработан на основании установленных протоколов для изоляции говядину и дрожжи F1- ATPases21,22. Процедура дает очень чистые и однородные фермента подходит для в vitro ферментативные и тормозящий анализов, подробные proteomic характеристика по масс-спектрометрии23и структуры определения24. Протокол очистки и знания о F1-АТФазы структуры на атомном уровне открывает возможность для разработки экранов для определения малых молекул ингибиторов и помощь в разработке новых лекарств против африканских trypanosomiases. Кроме того, этот протокол может быть адаптирована для очистки F1-АТФазы от других живых организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. буферов и решения
- Подготовка решения, перечисленные ниже. Дега все буферы для жидкостной хроматографии. Добавление ADP, benzamidine и ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
- Подготовка буфера A: 50 мм буфер Tris с соляной кислоты (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 М сахарозы, 5 мм benzamidine, 5 мм Аминокапроновая кислота (ACA) и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
- Подготовка буфера B: 50 мм трис-HCl рН 8,0, 0,25 М сахарозы, 4 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 5 мм benzamidine, 5 мм ACA, 1 ADP и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
- Подготовить Q-столбца буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 4 мм ЭДТА, 10 мм MgSO4, 5 мм benzamidine, 5 мм ACA и 1 мм ADP.
- Подготовить Q-колонки Элюирующий буфер: Q-столбца буфера с 1 M NaCl.
- Подготовить SEC буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 10 мм MgSO4, 100 мм NaCl, 1 ADP.
- Подготовьте хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5. Смесь хлороформ с 2 М трис-HCl рН 8,5 в соотношении примерно 1:1 в бутылке колпачок, встряхнуть, пусть органических и водной фазы отдельно, и измерения pH в верхней водный слой с полосы pH индикатор бумаги. Хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием встряхнуть снова и пусть отдельных фаз. Используйте нижний слой хлороформа.
Предупреждение: Хлороформ летучих и раздражает глаза и кожу. Работа в зонта. Используйте очки безопасности при встряхивании.
2. Подготовка суб митохондриальной частиц
- Ресуспензируйте митохондриальной везикулы (mitoplasts), изолированные гипотонический лизис25 от 1 х 1011 до 2 х 1011 клетки procyclic т. brucei в 5 мл ледяной буфер A. Держите образец охлажденным до шага 3.2.
- Определите концентрацию белка в подвеске, bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного26 согласно инструкциям производителя.
- Используйте серию разрежения бычьим сывороточным альбумином (БСА) в ультрачистая вода для построения калибровочной кривой. Разбавьте небольшим количеством образца 20 - 100 раз с ультрачистая вода вписываются в диапазоне BSA стандартов.
- Рассчитать сумму общего белка в образце и довести концентрацию белка до 16 мг/мл путем разбавления с дополнительного буфера а.
- Фрагмент mitoplasts в Перевернутый везикулы и мембраны штук, sonication подвески 7 x 15 s с общей энергии от 70 до 100 J за импульса с microtip с диаметром 3,9 мм. Если ультразвуковой гомогенизатор не отображает выход энергии, запустите оптимизацию на 50% максимальной мощности. Проинкубируйте образцы на льду для 30 s между импульсами. После sonication подвеска становится немного темнее.
- Отложений мембраны отломков ultracentrifugation на 54000 x g для 16 h или 98 000 x g для 5 h при 4 ° C. Сцеживаться супернатант и продолжить извлечение хлороформ, или отложений флэш замораживание в жидком азоте и храните его при температуре-80 ° C.
3. выпуск F1-АТФазы от мембраны, хлороформе
- Ресуспензируйте Пелле митохондриальных мембран в буфере B с помощью небольшой гомогенизатор Dounce. Рассчитать объем буфера B на основе общее количество буфера используется в формуле 2.1 и 2.2, используя следующие шаги: объем (буфера B) = объем (буфер A) x 12/21. Передать подвеска 15 или 50 мл Конические трубки.
- Удалить образец из льда и теперь держать образца и все решения для использования при комнатной температуре.
- Добавить хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5; объем хлороформ добавляемый равняется половины объема подвески. Плотно закройте крышку. Встряхнуть ровно 20 s. Центрифуга сразу на 8400 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Передача верхней облачно водной фазе 1.6-мл пробирок. Добавление ингибиторов протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A), для замены ингибиторы, удалены, хлороформ лечения. Центрифугуйте образцы на 13 000 x г за 30 мин при комнатной температуре. Передать супернатант свежих пробирок и повторите центрифугирования для удаления любых нерастворимый материал.
4. Анионообменная хроматография
- Сбалансировать столбце обмен (Q) 5-мл анион, прилагается к системе быстро белка жидкостной хроматографии с Q-столбца буфера потока скоростью 5 мл/мин до поглощения в 280 Нм и проводимости стабилизации (примерно 50 мл буфера).
- Загрузить супернатант из шага 3.3 на столбце уравновешенной потока со скоростью 1 мл/мин ждать до поглощения в 280 Нм стабилизируется на фоне. Примените линейный градиент 25 мл Q-столбца буфера от 0% до 100% при скорости потока сбора фракций 1 мл 0,5 мл/мин.
- Анализа отдельных фракций, соответствующих основных элюции пик гидролитическая деятельности СПС Pullman АТФазы пробирного2 при pH 8.0. Использование 10 мкл каждой фракции на 1 мл реакционной смеси. Бильярд фракции, которые проявляют активность АТФ-азы. При необходимости, отделить 10 мкл каждой фракции на натрия Додециловый фосфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) и пятно гель по Кумасси синий для визуализации отдельных F1-АТФазы субъединиц и загрязняясь протеины.
- Концентрат, Объединенный образец ультрафильтрационные мембраны, с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр для 200-500 мкл. приступить к SEC или магазина образца на ночь при комнатной температуре.
5. размер-гель-проникающей хроматографии
- Сбалансировать SEC колонки, подключенные к системе жидкостной хроматографии с по крайней мере 48 мл (два столбца томов) SEC буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин.
- Применение образца на столбце и запуск хроматографии потока со скоростью 0,25 мл/мин сбор 0,25 мл фракций.
- Запуск 10 мкл фракций, которые соответствуют вершины трассировки поглощения УФ280nm на SDS-PAGE и выведение их путем Кумасси синим. Первый основной пик содержит F1-АТФазы. Пробирного фракций, соответствующий этот пик для ATP гидролитическая активности и азид чувствительности по Пробирной Pullman АТФазы. Определите концентрацию белка, BCA assay.
- Храните очищенную F1-АТФазы при комнатной температуре и использовать его в течение 3 d после очистки для нисходящие приложения. Кроме того концентрат образца с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр > 1,5 мг / мл, осадок его, смешивая его с насыщенным сульфат аммония скорректирована до pH 8.0 (1.2 x тома) и хранить при 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный очистки (рис. 1) начинается с митохондриальных везикулы (mitoplasts), изолированные на Percoll градиент от hypotonically лизированных 1 х 1011 11 procyclic 2 x 10 т. brucei клетки25 культивировали в стандарте Глюкоза богатые SDM-79 средних27. Mitoplasts являются разрозненными, sonication, развернулся, и матрицы содержащих супернатант отбрасывается. Митохондриальные мембраны обращаются с хлороформом освободить F1-АТФазы. После центрифугирования органические фазы и осажденный межфазной отбрасываются. Водной фазе фракционированный на ионообменной хроматографии на четвертичного аммония, сильный анионит (рис. 2A). Фракции, которые соответствуют основным элюции пик и содержат F1-АТФазы объединяются и сосредоточены. Этот материал служит в качестве входных данных для SEC, который устраняет остаточные примеси. Основным загрязнителем является dihydrolipoyl дегидрогеназа, которая elutes от SEC столбца как дискретные пик, отмечен темно-зеленой панели на рисунке 2B. F1-АТФазы elutes в первый пик доминирующей, основном симметричный (рис. 2B).
Процесс очистки следуют BCA assay протеина (или другой общей assay протеина), SDS-PAGE и мониторинг деятельности АТФазы. Pullman АТФ, восстанавливающий проба2, основанный на уменьшение поглощения НАДН в сочетании реакции измеряется скорость гидролиза АТФ. Азид натрия, установленным ингибитор F1-АТФазы, используется в концентрации 2-мм для определения доли F1-АТФазы-конкретные гидролиза АТФ. Как правило шихтовый материал содержит примерно 150-300 мг митохондриальных белок, в зависимости от количество ячеек, которые используются как источник митохондриальной везикулы. Азид чувствительных доля общей активности АТФазы составляет около 30% до 40% на данном этапе. После извлечения хлороформ, более 90% активность АТФ-азы в образце способствовала F1-АТФазы. Очищенный F1- АТФазы практически полностью чувствителен к азид лечения (минимальной остаточной АТФазы активности можно объяснить Автолиз фон АТФ) и составляет около 1% от массы ввода белка, с приблизительную мощность 1 - 1.5 мг1F-АТФазы за 1 х 1011 клетки (Таблица 1). Типичная группа шаблон после разделения очищенного F1-АТФазы на следуют Кумасси синим Пятнать геля SDS-PAGE показан на рисунке 2 c. Белки были определены пептид массовой дактилоскопии и подробно характеризуются подходы различных масс-спектрометрии23. Спорадические слабых полос видны выше группа β-субъединица представляют Субкомплексы α3β3 головной убор (димеры и олигомеров α - и β-субъединиц) и лишены любых загрязнений, обнаруживаемые методами чувствительных масс-спектрометрии. Очищенный F1-АТФазы может храниться до нескольких дней в буфере SEC при комнатной температуре. Кроме того, F1-АТФазы, сосредоточены ≥2 мг/мл может осаждают равное количество насыщенных сульфат аммония в буфере SEC, с рН скорректирована до 8.0 и хранить при 4 ° C. По крайней мере шесть месяцев после высыпания активный фермент с без очевидных деградации любого подразделения можно получить путем redissolving осажденного материала в SEC буфер или аналогичного решения. Однако хранения дольше одного месяца не подходит для кристаллизации, как определяется эмпирически.
Рисунок 1 : Схема процедуры очищения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Очистки двухступенчатый хлороформ выпущена F1-АТФазы, жидкостная хроматография. (A) профиль элюции Анионообменная хроматографии (Верхняя панель) и отдельных фракций разделены на 10% - 20% гель трис глицин SDS-PAGE, окрашенных с Кумасси синий краситель (Нижняя панель). Синий след: УФ поглощения в 280 Нм; красный след: концентрация NaCl в Элюирующий буфер; Вход: F1-АТФазы, выпущенное хлороформе; FT: проточные. (B) профиль элюции сек (Верхняя панель) и отдельных фракций разделены на геля SDS-PAGE, окрашенных с Кумасси синий краситель (Нижняя панель). Вход: объединение фракций от Анионообменная хроматографии, содержащие F1-АТФазы. Цветных баров в панели A и B Марк фракций в элюции профили, которые были проанализированы SDS-PAGE и соответствующие полосы в соответствующих гель. (C) тождества отдельных белков изолированных F1-АТФазы, определенных по масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Концентрация белка (мг/мл) | Общий белок (мг) | Доля входного материала (%) | Деятельность (МкмольСПС x-1 мг x мин-1) |
Азид чувствительность (%) | |
| Митохондриальной везикулы в буфере A | 16.2 | 170 | 100 | 1.3 | 25-35 |
| Митохондриальные мембраны в буфере B | 18.6 | 97 | 57 | 2.4 | 35-45 |
| Хлороформ извлеченные фракций | 2.5 | 7.9 | 4.7 | 12 | 91-95 |
| F1-АТФазы после Q-столбец | - | 2.2 | 1.3 | 23 | 92-96 |
| F1-АТФазы после фильтрации геля | - | 1.6 | 0.93 | 48 | 93-98 |
Таблица 1: Пример типичного прогресса и доходность F1-АТФазы очистки из митохондрий изолированных от 1 x 1011 procyclic т. brucei клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол для F1-АТФазы очистки от т. brucei был разработан на основе опубликованных ранее методы для изоляции F1-АТФазы комплексы от других видов13,14. Метод не требует каких-либо генетические модификации (например, маркировка) и дает полностью активный комплекс с всех субблоков настоящего. Важный шаг — хлороформ способствовали выпуск F1-АТФазы от мембрана подключенных частью фермента. В очищения от всех эукариотических видов описаны до сих выпущенные подкомплекса содержал субблоков α, β, γ, δ и ε в стехиометрии 3:3:1:1:1. В т. brucei, F1-АТФазы содержит дополнительные три копии Субблок p18, Роман компонента ограничивается euglenozoan простейших23. Кроме того euglenozoan α-субъединица proteolytically делится на два фрагмента, оба стабильно связанного с комплекса24,,2829. Субблок OSCP (oligomycin чувствительность вручение белка), который связывает F1-общие периферийные стебель30, отсутствует от выпущенных комплекса, который согласуется с F1-АТФазы очищения, хлороформе Извлечение из других видов13,14.
Хлороформ выпущена F1-АТФазы далее очищенная методом жидкостной хроматографии. В случае крупного рогатого скота F1-АТФазы, хроматографии только один шаг, размер-гель-проникающей хроматографии, достаточно получить очень чистой и активный комплекс31. Однако, один set-up SEC было недостаточно для очистки1 т. brucei F-АТФазы, как дроби, обогащенные для F1-АТФазы содержатся дополнительные белковых загрязнений, главным образом Дельта-1-пирролин-5-карбоксилатных дегидрогеназы. Таким образом Анионообменная хроматографии была введена до SEC как первый и основной очистки шаг, и SEC служит процедуре последующей полировки. Для кристаллизации экспериментов использование Superdex 200 увеличить колонки оказалось необходимым, поскольку этот столбец содержится материал, который позволил выращивания кристаллов хорошего качества. Вполне вероятно, что разрешение столбце включено разделение небольшая часть неполной комплексов которые мешали кристаллизации. Однако для приложений, отличных от кристаллизации, разделение с помощью столбца Superdex 200 был не менее удовлетворительным.
Для защиты F1-АТФазы комплекс от частичной протеолиза, неизвестные protease(s) присутствует в митохондриальной lysate, первоначальный буферов A и B содержится широкий спектр ингибиторов протеазы. Влияние индивидуальных ингибиторов на протеолиза F1-АТФазы подразделения не были протестированы, и, скорее всего, присутствие некоторых ингибиторов является излишним. Для SEC шага, ингибиторы не добавляются больше как загрязняющие протеаз, удаляются из F1-АТФазы пример извлечения хлороформ или первый шаг хроматографии.
Многоступенчатое протокола неизбежно приводит к частичной потери F1-АТФазы. Наиболее значительные потери (25-45% от общей суммы) происходит на этапе концентрации, ультрафильтрационные мембраны на столбце спина после Анионообменная хроматографии. F1-АТФазы вероятно придерживается мембраны столбце спина. Таким образом, для некоторых нисходящие приложения, которые не требуют очень чистой и концентрированного образца (например, ферментные анализы и тормозящий экраны), F1-АТФазы может использоваться сразу же после Анионообменная хроматографии (см. Рисунок 2b, Лейн ввода).
Хотя очистки F1-АТФазы из разных организмов варьируется в деталях, общего рабочего процесса остается неизменной. Таким образом, этот протокол может служить в качестве ориентира для разработки F1-АТФазы Протокол изоляции других обильные источников, таких как ткани или клетки cultivatable в крупных масштабах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась министерством образования КЧП CZ Грант LL1205, Грант Грант агентства Чешской Республики 18-17529S и ЕФРР/ПФ проекта центр исследований патогенности и вирулентности паразитов (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406--47------N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. , The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
