Summary
Este protocolo descreve a purificação de F1-ATPase do palco inseto cultivado de Trypanosoma brucei. O procedimento produz um complexo altamente puro, homogêneo e ativo adequado para estudos estruturais e enzimáticos.
Abstract
F1-ATPase é uma membrana-extrínseco subcomplex catalítico de F-tipo ATP sintase, uma enzima que utiliza a força motriz protónica através das membranas biológicas para produzir adenosina trifosfato (ATP). O isolamento do intacta F1-ATPase da sua nascente nativo é um pré-requisito essencial para caracterizar a enzima composição de proteína, parâmetros cinéticos e sensibilidade aos inibidores. Um altamente pura e homogênea F1-ATPase pode ser usada para estudos estruturais, que fornecem a introspecção do mecanismo molecular da síntese de ATP e hidrólise. Este artigo descreve um procedimento para a purificação do F1-ATPase de Trypanosoma brucei, o agente causador da trypanosomiases africanos. A F-1-ATPase é isolada de vesículas mitocondriais, que são obtidas por lise hipotónica de tripanosomas em vitro cultivadas. As vesículas são mecanicamente fragmentadas por sonication e o F1-ATPase é liberada a partir da membrana mitocondrial interna pela extração de clorofórmio. O complexo enzimático é mais purificado por aniões consecutivos e cromatografia de exclusão de tamanho. Técnicas de espectrometria de massa sensível mostraram que o complexo purificado é desprovido de praticamente qualquer contaminantes de proteína e, portanto, representa o material adequado para a determinação de estrutura por cristalografia de raios x ou microscopia cryo-elétron. O isolado F1-ATPase apresenta atividade hidrolítica de ATP, que pode ser totalmente inibida por azida sódica, um inibidor potente do F-tipo ATP sintases. O complexo purificado permanece estável e ativo pelo menos três dias à temperatura ambiente. Precipitação de sulfato de amônio é usada para o armazenamento a longo prazo. Procedimentos semelhantes têm sido utilizados para a purificação de F1- ATPase de tecidos de mamíferos e vegetais, leveduras ou bactérias. Assim, o protocolo apresentado pode servir como uma diretriz para a F-1-isolamento de ATPase de outros organismos.
Introduction
Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes1. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F1-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F1-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado Fó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores deó de F e F1 são conectados pelos talos centrais e periféricos.
O primeiro tenta purificar o F1-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico2,3,4 ,5,6. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F1-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos7. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F1- ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos8, milho9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Mais purificação do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F1-ATPase de coração bovino12,13 e Saccharomyces cerevisiae14. F1-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-1-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F1-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus15 e Caldalkalibacillus thermarum16, 17. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F1- ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.
A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F1- ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata20. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F1- ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F1-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F1- ATPase21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa23e de determinação de estrutura24. O protocolo de purificação e o conhecimento da F1-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F1-ATPase de outros organismos.
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Protocol
1. buffers e soluções
- Prepare as soluções listadas abaixo. Desgaseifica todos os buffers para cromatografia líquida. Adicione inibidores da protease, Benzamidina e ADP imediatamente antes da utilização.
- Prepare o tampão de tampão a: 50 mM Tris com ácido clorídrico (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M de sacarose, Benzamidina de 5 mM, 5 mM aminocaproico ácido (ACA) e protease inibidores (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
- Prepare o tampão b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M de sacarose, ácido de 4mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), Benzamidina 5 mM, 5 mM ACA, 1mm ADP e ao inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
- Preparar o tampão de Q-coluna: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM de EDTA, 10 mM de MgSO4, 5mm benzamidina, 5mm ACA e 1 mM ADP.
- Preparar o tampão de eluição de Q-coluna: buffer de Q-coluna com 1 M de NaCl.
- Preparar o tampão do SEC: pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 10 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl, 1 mM ADP.
- Prepare o clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5. Misture o clorofórmio com 2 M Tris-HCl pH 8,5 em aproximadamente a proporção 1:1 em um frasco de tampa de rosca, agitar, deixar as fases orgânicas e aquosas separadas e medir o pH na camada aquosa superior com uma tira de papel indicador de pH. Armazenar em temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, agitar novamente e deixe as fases separadas. Use a camada inferior de clorofórmio.
Cuidado: Clorofórmio é volátil e irritante para os olhos e pele. Trabalho em uma coifa. Use óculos de segurança quando a tremer.
2. preparação de partículas submitocondrial
- Resuspenda vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas por lise hipotónica25 de 1 x 1011 a 2 x 1011 células de procyclic T. brucei em 5 mL de tampão gelada r. manter a amostra refrigerada até o passo 3.2.
- Determine a concentração de proteína na suspensão pelo bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio26 de acordo com as instruções do fabricante.
- Use uma série de diluições de albumina de soro bovino (BSA) em água ultrapura para construir a curva padrão. Dilua uma pequena quantidade de amostra 20 - 100 vezes com água ultrapura para encaixar nos padrões da gama de BSA.
- Calcular a quantidade de proteína total na amostra e trazer a concentração de proteína de 16 mg/mL, diluindo-lo com buffer adicionais A.
- Fragmentar mitoplasts em vesículas invertidas e pedaços de membrana por sonication da suspensão 7 x 15 s com uma energia total de 70 a 100 J por impulso com um microtip de 3,9 mm de diâmetro. Se o homogenizador Ultrassônico não exibir a saída de energia, comece a otimização em 50% da potência máxima. Incubar a amostra em gelo por 30 s entre impulsos. Após o sonication, a suspensão torna-se um pouco mais escura.
- Fragmentos de sedimentos da membrana por ultracentrifugação a 54.000 x g, durante 16 h ou a 98.000 x g, durante 5 h a 4 ° C. Decante o sobrenadante e prosseguir com a extração de clorofórmio, ou congelam o sedimento em nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C.
3. liberação de F1-ATPase de membrana por clorofórmio
- Resuspenda o pellet de membranas mitocondriais em buffer B com o auxílio de um pequena homogenizacao homogenizador. Calcular o volume de tampão B com base no montante total do buffer de um usado na fórmula de passos 2.1 e 2.2, usando o seguinte: volume (tampão B) = volume (tampão A) x 12/21. Transferi a suspensão para um tubo cônico de 15 ou 50 mL.
- Retire a amostra de gelo e, de agora em diante, manter a amostra e todas as soluções para ser usado em temperatura ambiente.
- Adicionar clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5; o volume de clorofórmio a ser adicionado é igual a metade do volume da suspensão. Feche a tampa firmemente. Agitá-lo vigorosamente para exatamente 20 s. centrifugá-lo imediatamente a 8.400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Transferi a fase aquosa superior nublada para microtubos de 1,6 mL. Adicione inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A) para substituir os inibidores removidos pelo tratamento clorofórmio. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para microtubos frescos e repetir a centrifugação para remover qualquer material insolúvel.
4. permutadora cromatografia
- Equilibrar a coluna de troca (Q) 5 mL ânion conectada a um sistema de cromatografia líquida de rápido-proteína com o buffer Q-coluna a uma taxa de fluxo de 5 mL/min até a absorbância em 280 nm e a condutividade estabilizar (aproximadamente 50 mL de tampão).
- Carregar o sobrenadante da etapa 3.3 na coluna equilibrada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. espere até a absorbância em 280 nm estabiliza em segundo plano. Aplica um gradiente linear de 25 mL do buffer Q-coluna eluição de 0% a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. coletar frações de 1 mL.
- Ensaio as frações individuais correspondente ao pico de eluição principais para a atividade hidrolítica de ATP pelo ensaio Pullman ATPase2 em pH 8.0. Use 10 µ l de cada fração por 1 mL da mistura de reação. As frações que apresentam atividade ATPase do pool. Opcionalmente, separe 10 µ l de cada fração em eletroforese em gel de poliacrilamida fosfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) e manchar o gel por Coomassie Blue Visualizar individual F1-subunidades ATPase e proteínas contaminantes.
- Concentre-se as amostras por ultrafiltração de membrana com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 de 200-500 µ l. proceder à SEC ou loja da amostra durante a noite em temperatura ambiente.
5. tamanho-exclusão cromatografia
- Equilibrar a coluna SEC conectada a um sistema de cromatografia líquida pelo menos 48 mL (dois volumes de coluna) do buffer SEC com um caudal de 0,5 mL/min.
- Aplique a amostra na coluna e executar cromatografia com um caudal de 0,25 mL/min. coletamos frações de 0,25 mL.
- Execute 10 µ l das frações que correspondem aos picos do rastreamento absorvância UV280nm em SDS-PAGE e manchá-las por Coomassie Blue. O primeiro pico principal contém o F1-ATPase. Ensaio as frações correspondentes a este pico para o ATP hidrolítica atividade e azida sensibilidade por ensaio de Pullman ATPase. Determine a concentração de proteína, o ensaio BCA.
- Manter o purificada F1-ATPase em temperatura ambiente e usá-lo dentro d 3 após a purificação para aplicações a jusante. Como alternativa, concentrar a amostra com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 > 1,5 mg / ml, precipitado, misturando-o com sulfato de amônio saturado ajustou a pH 8.0 (1.2 x volume) e armazená-lo em 4 ° C.
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Representative Results
Uma purificação típica (Figura 1) começa com vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas do gradiente de Percoll de hypotonically lisados 1 x 1011 para 2 x 1011 procyclic T. brucei células25 cultivadas no padrão rico em glicose SDM-79 médio27. Os mitoplasts são fragmentados por sonication, fiado, e o matriz contendo sobrenadante é Descartado. As membranas mitocondriais são tratadas com clorofórmio para liberar o F1-ATPase. Após a centrifugação, a fase orgânica e precipitado interfase são descartadas. A fase aquosa é fracionada por cromatografia de troca iônica em quaternário de amônio, um trocador de ânion forte (Figura 2A). As frações que correspondem a eluição maior pico e conter o F1-ATPase são agrupados e concentrada. Este material serve como a entrada para a SEC, que elimina as impurezas residuais. O principal contaminante é dihydrolipoyl desidrogenase, que elutes da coluna SEC como um pico discreto, marcado pela barra verde escura na Figura 2B. A F-1-ATPase elutes no primeiro pico dominante, em grande parte simétrico (Figura 2B).
O progresso da purificação é seguido o ensaio da proteína BCA (ou outro ensaio comum de proteína), SDS-PAGE e o acompanhamento da atividade ATPásica. A taxa de hidrólise de ATP é medida pelo ATP de Pullman regenerando ensaio2, baseada o decréscimo de absorbância do NADH na reação de acoplamento. Azida sódica, um inibidor estabelecido de F1-ATPase, é usado em uma concentração de 2 mM para determinar a proporção do F1-ATPase-específico hidrólise de ATP. Normalmente, o material de entrada contém cerca de 150-300 mg de proteína mitocondrial, dependendo do número de células utilizadas como fonte de vesículas mitocondriais. A proporção de azida sensíveis da atividade ATPásica total é cerca de 30% a 40% nesta fase. Após a extração de clorofórmio, mais de 90% da atividade da ATPase na amostra contribuiu para a F-1-ATPase. A purificada F1- ATPase é virtualmente completamente sensível para o tratamento de azida sódica (a ATPase residual mínima atividade pode ser atribuída à autólise fundo ATP) e representa cerca de 1% da massa entrada, com um rendimento aproximado de 1 - 1,5 mg de F-1-ATPase por 1 x 1011 células (tabela 1). Um padrão típico de banda após a separação do purificada F1-ATPase em gel de SDS-PAGE seguido de coloração de azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. As proteínas foram identificadas pela massa do peptide recolha de impressões digitais e caracterizado em detalhe por várias abordagens de espectrometria de massa23. Esporádicas fracas bandas visíveis acima da faixa de subunidade beta representam subcomplexes do α3β3 capacete (dímeros e oligómeros de subunidades α e β) e são desprovidas de quaisquer contaminantes detectáveis por técnicas de espectrometria de massa sensível. A purificada F1-ATPase pode ser armazenada por até vários dias no buffer SEC à temperatura ambiente. Alternativamente, o F1-ATPase concentrado para ≥2 mg/mL pode ser precipitado por um volume igual de sulfato de amônio saturado no buffer SEC, com pH ajustado para 8,0 e armazenado a 4 ° C. Pelo menos seis meses após a precipitação, a enzima activa com nenhuma degradação óbvia de qualquer subunidade pode ser obtida por redissolving o material precipitado no SEC buffer ou solução semelhante. No entanto, mais de um mês de armazenamento não é adequado para cristalização, conforme determinado empiricamente.
Figura 1 : Esquema do processo de purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Purificação de duas etapas do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia líquida de. (A) perfil de eluição da cromatografia de troca aniónica (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 10% - 20% corado com o corante azul de Coomassie (painel inferior). Azul de rastreamento: absorção UV em 280 nm; traço vermelho: concentração de NaCl no buffer de eluição; Entrada: a F1-ATPase lançado pelo clorofórmio; FT: de passagem. (B) perfil de eluição da SEC (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE, corado com tintura de azul de Coomassie (painel inferior). Entrada: pool frações da cromatografia de troca aniónica contendo F1-ATPase. As barras de código de cores em painéis A e B marcam as frações nos perfis de eluição que foram analisadas por SDS-PAGE e as vias correspondentes no gel respectivo. (C) as identidades das proteínas individuais do isolado F1-ATPase identificados por espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Concentração de proteínas (mg/mL) | Proteína total (mg) | Proporção de material de entrada (%) | Atividade (ΜmolATP x mg-1 x min-1) |
Sensibilidade de azida sódica (%) | |
| Mitocondriais vesículas em tampão A | 16.2 | 170 | 100 | 1.3 | 25-35 |
| Membranas mitocondriais no buffer B | 18,6 | 97 | 57 | 2.4 | 35-45 |
| Fracções de clorofórmio extraído | 2.5 | 7,9 | 4.7 | 12 | 91-95 |
| F1-ATPase depois Q-coluna | - | 2.2 | 1.3 | 23 | 92-96 |
| F1-ATPase após filtração de gel | - | 1.6 | 0.93 | 48 | 93-98 |
Tabela 1: Exemplo do progresso típico e rendimento do F1-purificação da ATPase de mitocôndrias isoladas de 1 x 1011 procyclic pilhas de T. brucei .
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Discussion
O protocolo para F1-purificação da ATPase de T. brucei foi desenvolvido com base em métodos publicados anteriormente para o isolamento de F1-complexos de ATPase de outras espécies de13,14. O método não requer qualquer modificação genética (por exemplo, marcação) e produz um complexo totalmente ativo com subunidades de todos os presentes. A etapa crucial é o lançamento de clorofórmio-facilitada do F1-ATPase da membrana-anexado parte da enzima. Em purificações de todas as espécies eucarióticas descritas até agora, o subcomplex lançado contido subunidades α, β, γ, δ e ε em uma estequiometria da 3:3:1:1:1. Em T. brucei, o F-1-ATPase contém um adicional de três cópias da subunidade p18, um romance componente restrito a euglenozoan protistas23. Além disso, o euglenozoan α-subunit proteoliticamente é dividido em dois fragmentos, ambos estàvel associada com o complexo24,28,29. A subunidade OSCP (oligomicina-sensibilidade-conferindo proteína), que liga o F1-agrupamento para o talo periférica30, está ausente do complexo lançado, que está de acordo com a F-1-purificações ATPase pelo clorofórmio extração de outras espécies de13,14.
O clorofórmio-lançado F1-ATPase é mais purificada por cromatografia líquida. No caso de bovinos F1-ATPase, apenas uma cromatografia, cromatografia de exclusão de tamanho, é suficiente para obter um complexo altamente puro e ativo31. No entanto, o único set-up SEC foi insuficiente para a purificação do T. brucei F1-ATPase, como as frações enriquecidas por F1-ATPase contidos contaminantes adicionais de proteína, principalmente delta-1-pyrroline-5-carboxilato desidrogenase. Portanto, cromatografia de troca aniónica foi introduzida antes da SEC, como o primeiro e grande passo purificante e a SEC serve como o processo de polimento subsequente. Para experimentos de cristalização, o uso da coluna Superdex 200 aumentar provou para ser essencial, desde que esta coluna fornecida material que permitiu o crescimento de cristais de boa qualidade. É provável que a resolução da coluna habilitado a separação de uma pequena proporção de complexos incompletas que interferiu com a cristalização. No entanto, para aplicativos que não sejam a cristalização, a separação usando a coluna de 200 Superdex foi igualmente satisfatória.
Para proteger o F1-ATPase complexo de proteólise parcial pelo desconhecido protease(s) presente no mitocondrial lisado, buffers de inicial A e B continham uma vasta gama de inibidores de protease. O impacto dos inibidores individuais sobre a proteólise de F1-subunidades ATPase não foi testado e, provavelmente, a presença de alguns dos inibidores é redundante. Para a etapa da SEC, os inibidores não são adicionados mais, como as proteases contaminantes são removidas do F1-amostra de ATPase a extração de clorofórmio ou a primeira análise cromatográfica.
O protocolo de várias etapas, inevitavelmente, leva a perdas parciais da F1-ATPase. A perda mais significativa (25% - 45% do montante total) ocorre durante a etapa de concentração por ultrafiltração de membrana em uma coluna de centrifugação após a cromatografia de troca aniónica. A F-1-ATPase provável adere à membrana da coluna de rotação. Assim, para algumas aplicações a jusante que não exigem uma altamente pura e concentrada amostra (por exemplo, ensaios enzimáticos e telas inibitórias), o F1-ATPase pode ser usada imediatamente após a cromatografia de troca aniónica (veja a figura de 2B, pista de entrada).
Embora a purificação de F1-ATPase de diferentes organismos varia em detalhes, o fluxo de trabalho geral permanece o mesmo. Portanto, este protocolo pode servir como uma diretriz para o desenvolvimento do F1-protocolo de isolamento ATPase de outras fontes abundantes, tais como tecidos ou células cultivável em grande escala.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da educação ERC CZ conceder LL1205, o grant Grant agência de República Checa 18-17529S e pelo FEDER/FSE projeto centro de investigação de patogenicidade e virulência de parasitas (n. º CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406--47------N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. , The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
