Summary
Det här protokollet beskriver rening av F1-ATPas från odlade insekt scenen av Trypanosoma brucei. Förfarandet ger en mycket ren, homogen och aktiva komplex som är lämplig för strukturella och enzymatisk studier.
Abstract
F1-ATPas är en membran-extrinsic katalytisk subcomplex av F-typ ATP-syntas, ett enzym som använder proton motiv kraft över biologiska membraner för att producera adenosintrifosfat (ATP). Isolering av intakt F1-ATPas från dess infödda källa är en nödvändig förutsättning att karakterisera enzymets protein sammansättning, kinetiska parametrar och känslighet för hämmare. En mycket ren och homogen F1-ATPas kan användas för strukturella studier, som ger insikt om molekylära mekanismer för ATP-syntes och hydrolys. Den här artikeln beskrivs ett förfarande för rening av F1-ATPas från Trypanosoma brucei, vilka smittämnen av afrikanska trypanosomiases. F1-ATPas är isolerad från mitokondriella blåsor, som erhålls genom hypoton Lys från in vitro- odlade innebörder. Blåsor är mekaniskt splittrade av ultraljudsbehandling och F1-ATPas frisätts från det inre mitokondriella membranet av kloroform utvinning. Enzymatisk anläggningen renas ytterligare av på varandra följande anjon exchange och storlek-utslagning kromatografi. Känsliga masspektrometri tekniker visade att renade komplexet saknar praktiskt taget alla protein föroreningar och därför utgör lämpligt material för strukturbestämning av röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi. Den isolerade F1-ATPas uppvisar ATP hydrolytiska aktivitet, vilket kan hämmas fullt av natriumazid, en potent hämmare av F-typ ATP syntaser. Renade komplexet förblir stabil och aktiv i minst tre dagar i rumstemperatur. Fällning av ammoniumsulfat används för långsiktig lagring. Liknande procedurer har använts för rening av F1- ATPases från däggdjur och växt vävnader, jäst eller bakterier. Därför presenteras protokollet kan fungera som riktlinje för F1-ATPas isolering från andra organismer.
Introduction
De F-typ ATP-syntaser är membran-bundna roterande multiprotein komplex som par proton flyttning över energi-transducing membran av bakterier, mitokondrier och kloroplaster med bildandet av ATP. Molekylära detaljer av roterande mekanismen för ATP-syntes är känd främst på grund av strukturella studier av renat bakterie- och mitokondriell ATP syntaser och deras subcomplexes1. F-typ ATP synthase är organiserad i membran-inneboende och membran-yttre beståndsdelarna. Den membran-yttre delen, känd som F1-ATPas, innehåller tre katalytisk platser, där fosforyleringen av adenosindifosfat (ADP) till ATP eller omvänd reaktion uppstår. F1-ATPas experimentellt kan bli befriad från den membran-inneboende biexponentiellt samtidigt behålla dess förmåga att hydrolysera, men inte syntetisera, ATP. Den membran-bundna sektorn, kallas Fo, förmedlar protein translokation, som driver rotation av den centrala delen av enzymet. Den F1 och Fo sektorn förbinds av centrala och perifera stjälkar.
Först försök att rena F1-ATPas från spirande jäst och bovin hjärtat mitokondrier datum tillbaka till 1960-talet. Dessa protokoll används extraherade mitokondrier, som besväras av ultraljudsbehandling, fraktionerade oljor av ammonium eller protamine sulfate nederbörd, följt av valfria kromatografi stegen och värmebehandling2,3,4 ,5,6. Reningen var kraftigt förbättras och förenklas genom användning av kloroform, som lätt släpper F1-ATPas från mitokondriella membranet fragment7. Kloroform utvinning användes sedan för att extrahera F1- ATPases från olika djur, växt och bakteriell källor (t.ex., råtta lever8, majs9, Arum maculatum10och Escherichia coli 11). Ytterligare rening av kloroform-släppt F1-ATPas genom affinitet eller storlek-utestängning kromatografi (SEC) gav ett mycket rent protein komplex, som var passande för högupplösta strukturbestämning av röntgenkristallografi, som dokumenteras av strukturerna för F1-ATPas från nötkreatur hjärtat12,13 och Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPas strukturer bestämdes också från organismer som är svårt att odla och, således, den inledande biologiskt material var begränsade. I detta fall, F1-ATPas subenheter var artificiellt uttryckt och monteras till anläggningen i E. coli, och hela heterologa enzymet renades av affinitet kromatografi via en taggad subenhet. Sådant tillvägagångssätt ledde till bestämning av F1-ATPas strukturer från två termofila bakteriearter, Geobacillus stearothermophilus15 och Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denna metod är dock ganska olämpligt för eukaryota F1- ATPases eftersom det bygger på den prokaryota protheosynthetic apparater, posttranslationell bearbetning och komplex sammansättning.
Kloroform-baserade utvinning användes tidigare för att isolera F1- ATPases från encelliga digenetic parasiter Trypanosoma cruzi18 och T. brucei19, viktigt däggdjur patogener som orsakar Amerikan och Afrikanska trypanosomiases, respektive, och från monogena insekt parasit Crithidia fasciculata20. Dessa reningar ledde endast till en enkel beskrivning av F1- ATPases, eftersom inga nedströms program användes att fullständigt karakterisera den sammansättning, struktur och enzymatisk boenden i komplexet. Denna artikel beskriver en optimerad metod för F1-ATPas rening från odlade insekt livscykelstadiet av T. brucei. Metoden är utvecklad utifrån etablerade protokollen för isolering av nötkreatur och jäst F1- ATPases21,22. Förfarandet ger mycket ren och homogen enzym passar in vitro- enzymatisk och hämmande analyser, detaljerad proteomiska karakterisering av masspektrometri23och struktur bestämning24. Protokollet rening och kunskapen om F1-ATPas struktur på atomnivå öppnar en möjlighet för att designa skärmar att identifiera småmolekylär hämmare och stöd i utvecklingen av nya läkemedel mot afrikanska trypanosomiases. Dessutom protokollet kan anpassas till rena F1-ATPas från andra organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffertar och lösningar
- Förbereda de lösningar som anges nedan. Degas alla buffertar för vätskekromatografi. Lägg till ADP, benzamidinen och proteas hämmare strax före användning.
- Förbereda buffert A: 50 mM Tris buffert med saltsyra (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M sackaros, 5 mM benzamidinen, 5 mM aminokapronsyra syra (ACA) och proteas hämmare (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin och 50 µM diprotin A).
- Bered buffert B: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,25 M sackaros, 4 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), 5 mM benzamidinen, 5 mM ACA, 1 mM ADP och proteashämmare (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin och 50 µM diprotin A).
- Förbereda Q-kolumn buffert: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM benzamidinen, 5 mM ACA och 1 mM ADP.
- Förbereda Q-kolumn eluering buffert: Q-kolumn buffert med 1 M NaCl.
- Förbereda SEC buffert: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
- Förbereda kloroform mättad med 2 M Tris-HCl pH 8.5. Blanda kloroform med 2 M Tris-HCl pH 8.5 i ungefärligt förhållandet 1:1 i en-skruvlock flaska, skaka, låt de organiska och vattenaktig faserna separat och mät pH i övre vattenskiktet med en remsa av pH-indikatorpapper. Förvara i rumstemperatur. Precis innan användning, skaka igen och låt de separata faserna. Använd lägre kloroformskiktet.
Varning: Kloroform är flyktiga och irriterande för ögon och hud. Arbeta i dragskåp. Använda säkerhet glasögon när du skakar.
2. beredning av sub-mitokondriell partiklar
- Återsuspendera mitokondriell blåsor (mitoplasts) isolerat av hypoton lysis25 från 1 x 1011 till 2 x 1011 celler av procykliskt T. brucei i 5 mL iskallt buffert A. Behåll provet kylt tills steg 3,2.
- Bestämma proteinkoncentration i avstängning av bicinchoninic syra (BCA) protein assay26 enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd en bovint serumalbumin (BSA) spädningsserien i ultrarent vatten för att konstruera standardkurvan. Späd ut en liten mängd prov 20 - 100 gånger med ultrarent vatten att passa in i spänna av BSA normerna.
- Beräkna totalt protein i urvalet och att protein-koncentrationen till 16 mg/mL genom att späda ut det med ytterligare buffert A.
- Fragmentera mitoplasts i inverterad blåsor och membran bitar av ultraljudsbehandling av suspensionen 7 x 15 s med en total energi från 70 till 100 J per impuls med en microtip med en diameter på 3,9 mm. Om den ultraljud homogenisatorn inte visar den energi som produceras, starta optimering på 50% av maximal kraft. Inkubera provet på is för 30 s mellan impulser. Efter ultraljudsbehandling blir fjädringen något mörkare.
- Sediment membranet fragment av ultracentrifugering vid 54 000 x g i 16 h eller vid 98.000 x g i 5 h vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och fortsätta med kloroform utvinning, eller flash-frysa sediment i flytande kväve och förvara den vid-80 ° C.
3. utsläpp av F1-ATPas från membran av kloroform
- Återsuspendera pelleten i mitokondriell membran i buffert B med hjälp av en liten Dounce Homogenisatorer. Beräkna volymen av buffert B baserat på den totala mängden buffert en begagnad i steg 2.1 och 2.2 använder följande formel: volym (buffert B) = volym (buffert A) x 12/21. Överför till en 15 - eller 50-mL koniska rör.
- Ta bort provet från isen och från nu på, hålla provet och alla lösningar ska användas vid rumstemperatur.
- Lägg till kloroform mättad med 2 M Tris-HCl pH 8.5; volymen av kloroform läggas lika med halva volymen av suspensionen. Stäng locket ordentligt. Skaka den kraftigt för exakt 20 s. Centrifugera det omedelbart 8,400 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Överföra övre grumlig vattenfasen till 1,6 mL mikrorör. Lägg till proteashämmare (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin och 50 µM diprotin A) att ersätta de hämmare bort av kloroform behandling. Centrifugera proverna vid 13 000 x g i 30 min i rumstemperatur. Överför supernatanten till färska mikrorör och upprepa centrifugeringen för att avlägsna olösligt material.
4. anjon-exchange kromatografi
- Temperera den 5 mL anjonbytare (Q) Jonbytarkolonnen bifogas en snabb-protein Vätskekromatografisystem med Q-kolumn bufferten med en flödeshastighet av 5 mL/min tills absorbansen vid 280 nm och ledningsförmåga stabilisera (cirka 50 mL buffert).
- Ladda supernatanten från steg 3.3 på skakad kolonnen med en flödeshastighet av 1 mL/min. vänta tills absorbansen vid 280 nm stabiliserar på bakgrunden. Applicera en 25 mL linjär gradient av Q-kolumn eluering bufferten från 0% till 100% med en flödeshastighet av 0,5 mL/min. samla 1 mL fraktioner.
- Assay de enskilda fraktionerna som motsvarar den stora eluering toppen för ATP hydrolytiska aktivitet av Pullman ATPas assay2 vid pH 8,0. Använd 10 µL av varje fraktion per 1 mL reaktionsblandningen. Poolen de fraktioner som uppvisar ATPas aktivitet. Alternativt separat 10 µL av varje fraktion på sodium dodecyl fosfat polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och fläcken gelen av Coomassie blå att visualisera enskilda F1-ATPas-subenheter och kontaminerande proteiner.
- Koncentrat av samlingsprov av membran ultrafiltrering med en spin kolumn med en 100.000 MWCO PES-filter till 200-500 µL. Fortsätt till SEC eller store provet över natten i rumstemperatur.
5. storlek-uteslutande kromatografi
- Temperera kolumnen SEC bifogas en Vätskekromatografisystem med minst 48 mL (två kolumn volymer) på SEC bufferten med en flödeshastighet på 0,5 mL/min.
- Applicera provet på kolumnen och kör kromatografi med en flödeshastighet av 0,25 mL/min. samla 0,25 mL fraktioner.
- Kör 10 µL av de fraktioner som motsvarar topparna av UV280nm absorbansen tracen på SDS-PAGE och färga dem av Coomassie blå. Den första stora toppen innehåller F1-ATPas. Assay de fraktioner som motsvarar denna topp för ATP hydrolytiska aktivitet och natriumazid känsligheten av Pullman ATPas analysen. Bestämma proteinkoncentration enligt BCA-analysen.
- Hålla den renade F1-ATPas i rumstemperatur och Använd den inom 3 d efter rening för nedströms tillämpningar. Alternativt kan koncentrera provet med en spin kolumn med en 100.000 MWCO PES-filter > 1,5 mg / ml, förhastade det genom blandning med mättade ammoniumsulfat justerad till pH 8,0 (1,2 x volymen) och förvara den vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk rening (figur 1) börjar med mitokondriell blåsor (mitoplasts) isolerade på Percoll övertoningen från hypotonically lyserat 1 x 1011 till 2 x 1011 procykliskt T. brucei celler25 odlade i standard glukos-rika SDM-79 medium27. Mitoplasts är splittrade av ultraljudsbehandling, snurrade, och matrix-innehållande supernatanten ignoreras. Mitokondriell membran behandlas med kloroform att släppa F1-ATPas. Efter centrifugering kastas den organiska fasen och utfällda interphase. Vattenfasen är fractionated genom jonbyteskromatografi på kvaternära ammoniumsalter, en stark anjonbytaren (figur 2A). De fraktioner som motsvarar den stora elueringen topp och innehåller F1-ATPas är poolade och koncentrerad. Detta material fungerar som indata till SEC, vilket eliminerar kvarstående föroreningar. Den stora föroreningar är dihydrolipoyl-dehydrogenas, som eluerar från kolumnen SEK som en diskret topp, präglad av den mörka gröna stapeln i figur 2B. F1-ATPas eluerar i den första dominerande, till stor del symmetriska toppen (figur 2B).
Utvecklingen av rening följs av BCA protein analysen (eller en annan gemensam protein assay), SDS-PAGE, och övervakningen av ATPas aktivitet. ATP hydrolys är mätt av Pullman ATP regenererande assay2, baserat på minskningen av absorbansen av NADH i kopplat reaktionen. Natriumazid, etablerade hämmare av F1-ATPas, används vid en koncentration av 2 mM för att bestämma andelen F1-ATPas-specifika ATP hydrolys. Ingående materialet innehåller normalt ungefär 150-300 mg av mitokondriell protein, beroende på antalet celler som används som källa för mitokondriell blåsor. Natriumazid-känsliga andel av den totala ATPas aktiviteten är cirka 30% till 40% i detta skede. Efter kloroform utvinning, mer än 90% av ATPas aktivitet i provet är bidrog till F1-ATPas. Den renade F1- ATPas är praktiskt taget helt känslig för natriumazid behandling (den minimal residual ATPas aktivitet kan tillskrivas den bakgrunden ATP autolys) och utgör cirka 1% av ingående protein massan, med en ungefärlig avkastning på 1 - 1,5 mg F1-ATPas per 1 x 1011 celler (tabell 1). Ett typiskt band mönster efter avskiljandet av renat F1-ATPas på SDS-PAGE gel följt av Coomassie blå färgning visas i figur 2 c. Proteinerna identifierades av peptid massan fingeravtryck och i detalj karaktäriserat av olika masspektrometri metoder23. Sporadiska svaga band syns ovan β-subunit bandet representerar subcomplexes av den α3β3 pannsmycke (dimerer och oligomerer av α - och β-subenheter) och saknar några föroreningar upptäckas av känsliga masspektrometri tekniker. Den renade F1-ATPas kan förvaras i upp till flera dagar i SEC bufferten vid rumstemperatur. Alternativt, F1-ATPas koncentrerad ≥2 mg/ml kan utlösas av en lika stor mängd mättade ammoniumsulfat i SEC buffert, med pH justerat till 8,0 och lagras vid 4 ° C. Under minst sex månader efter nederbörden, kan aktiva enzymet med inga uppenbara nedbrytning av varje subenhet erhållas genom redissolving det utfällda materialet i SEC buffert eller liknande lösning. Förvaring längre än en månad är dock inte lämplig för kristallisering, som bestäms empiriskt.
Figur 1 : Systematiken i förfarandet rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Två steg rening av kloroform-släppt F1-ATPas genom vätskekromatografi. (A) eluering profil av anjon-exchange kromatografi (övre panelen) och valda fraktioner separerade på 10-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel fläckade Coomassie blått färgämne (nedre panelen). Blått spår: UV absorbansen vid 280 nm. rött spår: koncentrationen av NaCl i eluering bufferten; Ingång: F1-ATPas släpptes av kloroform; FT: genomflöde. (B) eluering profil av SEC (övre panelen) och valda fraktioner separerade på SDS-PAGE gel fläckade Coomassie blått färgämne (nedre panelen). Ingång: poolade fraktioner från anjon-exchange kromatografi innehållande F1-ATPas. De färgkodade barerna i paneler A och B mark fraktioner i eluering profiler som analyserades av SDS-PAGE och de motsvarande köer i respektive gel. (C) identiteter av enskilda proteiner av isolerade F1-ATPas som identifierats av masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Proteinkoncentration (mg/mL) | Totalt protein (mg) | Andel av insatsmaterial (%) | Verksamhet (ΜmolATP x mg-1 x min-1) |
Natriumazid känslighet (%) | |
| Mitokondriell blåsor i buffert A | 16.2 | 170 | 100 | 1.3 | 25-35 |
| Mitokondriell membran i buffert B | 18,6 | 97 | 57 | 2.4 | 35-45 |
| Kloroform extraherade fraktioner | 2.5 | 7,9 | 4.7 | 12 | 91-95 |
| F1-ATPas efter Q-kolumn | - | 2.2 | 1.3 | 23 | 92-96 |
| F1-ATPas efter gelfiltrering | - | 1.6 | 0,93 | 48 | 93-98 |
Tabell 1: Exempel på typiska framsteg och avkastning av F1-ATPas rening från mitokondrier isolerade från 1 x 1011 procykliskt T. brucei celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet för F1-ATPas rening från T. brucei utvecklades utifrån tidigare publicerade metoder för isolering av F1-ATPas komplex från andra arter13,14. Metoden kräver inte någon genetisk modifiering (t.ex., taggning) och ger en fullt aktiv komplex med alla subenheter närvarande. Det avgörande steget är kloroform-underlättat frisläppandet av F1-ATPas från den membran-anslutna delen av enzymet. Reningar från alla eukaryota arter beskrivits hittills, innehöll den utsläppt subcomplex subenheter α, β, γ, δ och ε i en stökiometri av 3:3:1:1:1. I T. brucei, F1-ATPas innehåller en ytterligare tre kopior av den subenhet p18, en ny komponent som begränsas till euglenozoan protister23. Dessutom är den euglenozoan α-subenheten proteolytically uppdelad i två fragment, både stabilt förknippas med den komplexa24,28,29. Subuniten OSCP (oligomycin-känslighet-ger protein), som förbinder F1-delen till perifera stjälk30, är frånvarande från släppta komplexet, som är överens med F1-ATPas reningar av kloroform utvinning från andra arter13,14.
Kloroform-släppt F1-ATPas renas ytterligare genom vätskekromatografi. När det gäller bovin F1-ATPas, endast en kromatografi steg, storlek-utslagning kromatografi, räcker för att få en mycket ren och aktiv komplexa31. Den enda SEC set-up var dock otillräcklig för rening av T. brucei F1-ATPas, som de fraktioner som berikat för F1-ATPas innehöll ytterligare protein föroreningar, främst delta-1-Pyrrolin-5-bildas dehydrogenas. Därför anjon-exchange kromatografi infördes före SEC som första och stora renande steg och SEC fungerar som det efterföljande polering förfarandet. För kristallisering experiment, användning av kolumnen Superdex 200 öka visat sig avgörande, eftersom denna kolumn som tillhandahålls material som tillåts växa kristaller av god kvalitet. Det är troligt att resolutionen i kolumnen aktiverad separation av en liten del av ofullständig komplex som störde kristallisering. Men för andra program än kristallisering var separationen med hjälp av kolumnen Superdex 200 lika tillfredsställande.
Att skydda F1-ATPas komplexa från partiell proteolys av okänd protease(s) närvarande i det mitokondriella lysate, inledande buffertar A och B innehöll ett brett utbud av proteashämmare. Effekterna av enskilda hämmare på proteolys av F1-ATPas subenheter har inte testats och, troligen, förekomsten av några av hämmare är överflödig. För SEC steg, hämmare läggs inte längre, när de kontaminerande proteaser tas bort från F1-ATPas prov av kloroform utvinning eller det första steget i kromatografi.
Utgångsämnet protokollet oundvikligen leder till partiell förlust av F1-ATPas. Den mest betydande förlusten (25% - 45% av det totala beloppet) inträffar under koncentration steg av membran ultrafiltrering på en spin kolumn efter anjon-exchange kromatografi. F1-ATPas sannolikt följer membranet i kolumnen spin. Således, för vissa nedströms program som inte kräver en mycket ren och koncentrerad prov (t.ex., enzymatisk analyser och hämmande skärmar), F1-ATPas kan användas omedelbart efter anjon-exchange kromatografi (se figur 2b, ingång lane).
Även om rening av F1-ATPas från olika organismer varierar i detalj, det allmänna arbetsflödet förblir densamma. Därför detta protokoll kan tjäna som riktlinje för utvecklingen av F1-ATPas isolering protokoll av andra rikliga källor, såsom vävnader eller celler som är odlingsbara i stor skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ministeriet för utbildning ERC CZ bevilja LL1205, Grant byrån i Tjeckien bidraget 18-17529S, och genom ERUF/ESF projektet centrum för forskning av patogenicitet och virulens av parasiter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406--47------N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. , The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
