Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Isolering af F1-ATPase fra parasitære Protist Trypanosoma brucei

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

Denne protokol beskriver rensning af F1-ATPase fra den kulturperle insekt fase af Trypanosoma brucei. Proceduren, der giver en meget ren, ensartet og aktive kompleks egnet til strukturelle og enzymatiske undersøgelser.

Abstract

F1-ATPase er en membran-extrinsic katalytiske subcomplex af F-typen ATPsyntase, et enzym, der bruger proton drivkraft over biologiske membraner til fremstilling adenosin trifosfat (ATP). Isolering af de intakte F1-ATPase fra dens oprindelige kilde er en væsentlig forudsætning at karakterisere enzymet protein sammensætning, kinetiske parametre og følsomhed over for hæmmere. En meget ren og homogen F1-ATPase kan bruges til strukturelle studier, der giver indsigt i molekylære mekanismer i ATPsyntesen og hydrolyse. I denne artikel beskrives en procedure til rensning af F1-ATPase fra Trypanosoma brucei, det agens af afrikanske trypanosomiases. F1-ATPase er isoleret fra mitokondrie blærer, som er fremstillet af hypotonic lysis fra in vitro- kulturperler trypanosomes. Vesikler er mekanisk opsplittet af sonikering og F1-ATPase er frigivet fra den indre mitokondrielle membran af chloroform udvinding. Enzymatisk komplekset er yderligere renset af på hinanden følgende anion exchange og størrelse-udelukkelse kromatografi. Følsomme massespektrometri teknikker viste at renset komplekset er blottet for næsten alle protein forurenende stoffer, og derfor repræsenterer egnet materiale til struktur bestemmelse af røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi. Den isolerede F1-ATPase udstiller ATP hydrolytisk aktivitet, som kan hæmmes fuldt af natriumazid, en potent hæmmer af F-typen ATP synthases. Renset komplekset forbliver stabil og aktive i mindst tre dage ved stuetemperatur. Udfældning af ammonium sulfat bruges til langtidsopbevaring. Lignende procedurer er blevet brugt til rensning af F1- ATPases fra pattedyr og plante væv, gær eller bakterier. Således præsenteret protokollen kan tjene som retningslinje for F1-ATPase isolation fra andre organismer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

F-type ATP synthases er membran-bundet roterende multiprotein komplekser at par proton translokation over energi-transducing membraner af bakterier, mitokondrier og kloroplaster med dannelsen af ATP. Molekylær detaljer af den roterende mekanisme for ATPsyntesen er kendt primært på grund af strukturelle undersøgelser af renset bakteriel og mitokondriel ATP synthases og deres subcomplexes1. F-type ATPsyntase er organiseret i membran-iboende og membran-ydre fraspaltning. Den membran-ydre del, kendt som F1-ATPase, indeholder tre katalytiske steder, hvor fosforylering af adenosin ud (ADP) til ATP eller den modsatte reaktion opstår. F1-ATPase eksperimentelt kan frigøres fra den membran-iboende gruppe samtidig bevare sin evne til at hydrolysere, men ikke syntetisere, ATP. Membran-bundet sektor, kaldet Fo, medierer protein translokation, som drev rotation af den centrale del af enzymet. F1 og Fo sektorer er forbundet med de centrale og perifere stilke.

Først forsøg på at rense F1-ATPase fra spirende gær og kvæg hjerte mitokondrier dato tilbage til i 1960 ' erne. Disse protokoller bruges udvundet mitokondrier, som blev afbrudt ved hjælp af sonikering, fraktioneret af ammonium eller protamine sulfat nedbør, efterfulgt af valgfri kromatografi trin og varmebehandling2,3,4 ,5,6. Rensning blev stærkt forbedret og forenklet ved brug af chloroform, som let frigiver F1-ATPase fra den mitokondrielle membran fragmenter7. Chloroform udvinding blev derefter brugt til at udtrække F1- ATPases fra forskellige dyr, plante og bakteriel kilder (f.eks., rotte lever8, majs9, Arum maculatum10og Escherichia coli 11). Yderligere rensning af chloroform-udgivet F1-ATPase ved affinitet eller størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) givet en meget ren protein kompleks, som var egnet til høj opløsning struktur bestemmelse af røntgenkrystallografi, som dokumenteret af strukturer af F1-ATPase fra kvæg hjerte12,13 og Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPase strukturer blev også bestemt ud fra organismer, der er vanskelige at dyrke, og mængden af den oprindelige biologiske materiale var således begrænset. I dette tilfælde, F1-ATPase underenheder blev kunstigt udtrykt og samles til kompleks i E. coli, og hele heterolog enzymet blev renset af affinitet kromatografi via en mærket underenhed. Sådan tilgang har ført til bestemmelse af F1-ATPase strukturer fra to termofile bakteriearter, Geobacillus stearothermophilus15 og Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denne metode er dog temmelig uegnede til eukaryote F1- ATPases da det afhængig af prokaryote protheosynthetic apparater, posttranslationelle forarbejdning og komplekse forsamling.

Chloroform-baseret udvinding blev tidligere brugt til at isolere F1- ATPases fra encellede digenetic parasitter Trypanosoma cruzi18 og T. brucei19, vigtige pattedyr patogener forårsager amerikanske og Afrikanske trypanosomiases, henholdsvis, og fra monogene insekt parasit Crithidia fasciculata20. Disse purifications førte kun til en simpel beskrivelse af F1- ATPases, da ingen downstream programmer blev anvendt til fuldt ud at beskrive sammensætning, struktur og enzymatiske egenskaber af komplekset. Denne artikel beskriver en optimeret metode til F1-ATPase rensning fra stadiet kulturperler insekt livscyklus af T. brucei. Metoden er udviklet baseret på de fastlagte protokoller til isolation af kvæg og gær F1- ATPases21,22. Proceduren, der giver meget rene og homogen enzym velegnet til in vitro- enzymatisk og hæmmende assays, detaljerede proteom karakterisering af massespektrometri23og struktur bestemmelse24. Rensning-protokollen og kendskab til F1-ATPase strukturen på det atomare niveau åbner mulighed for at designe skærme til at identificere små-molekyle hæmmere, og støtte i udviklingen af nye lægemidler mod afrikanske trypanosomiases. Derudover protokollen kan tilpasses til at rense F1-ATPase fra andre organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. buffere og løsninger

  1. Forberede de løsninger, der er anført nedenfor. Degas alle buffere for væskekromatografi. Tilføje ADP, benzamidine og protease-hæmmere lige før brug.
    1. Forberede buffer A: 50 mM Tris buffer med saltsyre (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M saccharose, 5 mM benzamidine, 5 mM aminokapronsyre syre (ACA) og protease-hæmmere (10 µM amastatin 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).
    2. Forberede buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M saccharose, 4 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 5 mM benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP, og proteasehæmmere (10 µM amastatin 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).
    3. Forberede Q-kolonne buffer: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM benzamidine, 5 mM ACA og 1 mM ADP.
    4. Forberede Q-kolonne eluering buffer: Q-kolonne buffer med 1 M NaCl.
    5. Forberede sek buffer: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Forberede chloroform mættet med 2 M Tris-HCl pH 8,5. Bland chloroform med 2 M Tris-HCl pH 8,5 i ca 1:1 ratio i et skruelåg flaske, ryste, lad de økologisk og vandig faser separat, og måle pH i det øverste vandige lag med en stribe af pH-indikator papir. Opbevares ved stuetemperatur. Lige før brug, Ryst igen og lad de separate faser. Brug den nederste chloroform lag.
      Forsigtig: Chloroform er flygtige og irriterende på øjne og hud. Arbejde i et stinkskab. Bruge sikkerhed briller når ryster.

2. fremstilling af sub-mitokondrie partikler

  1. Resuspend mitokondrie vesikler (mitoplasts) isoleret af hypotonic lysis25 fra 1 x 1011 til 2 x 1011 celler af procyklisk T. brucei i 5 mL iskold buffer A. holde prøven kølet indtil trin 3.2.
  2. Bestemme koncentrationen af protein i suspension af den bicinchoninic syre (BCA) protein assay26 ifølge producentens anvisninger.
    1. Bruge en bovint serumalbumin (BSA) fortyndingsrække i ultrarent vand til at konstruere standardkurven. Fortynde en lille mængde af prøven 20 - 100 gange med ultrarent vand til at passe ind i de vifte af BSA standarder.
    2. Beregne den samlede proteinindhold i stikprøven og bringe proteinkoncentration til 16 mg/mL ved at fortynde det med ekstra buffer A.
  3. Fragmentere mitoplasts i omvendt vesikler og membran stykker ved hjælp af sonikering af suspension 7 x 15 s med en samlet energi på 70 til 100 J pr. impuls med en microtip med en diameter på 3,9 mm. Hvis den ultrasonic homogeniseringsapparat ikke viser energiproduktion, starte optimering på 50% af maksimal kraft. Inkuber prøve på ice til 30 s mellem impulser. Efter ultralydbehandling bliver suspension lidt mørkere.
  4. Sediment membranen fragmenter af ultracentrifugering ved 54.000 x g i 16 h eller ved 98.000 x g for 5 h ved 4 ° C. Den dekanteres og fortsætte med chloroform udvinding, eller flash-freeze sedimentet i flydende nitrogen og opbevar den ved-80 ° C.

3. frigivelse af F1-ATPase fra membran af Chloroform

  1. Resuspenderes mitokondrie membraner i buffer B ved hjælp af en lille Dounce homogeniseringsapparat. Beregne omfanget af buffer B baseret på det samlede beløb af buffer en brugt i trin 2.1 og 2.2 ved hjælp af følgende formel: volumen (buffer B) = volumen (buffer A) x 12/21. Overføre suspension til en 15 eller 50 mL konisk slange.
  2. Fjern prøven fra isen, og fra nu af holde prøven og alle løsninger der skal anvendes ved stuetemperatur.
  3. Tilføje chloroform mættet med 2 M Tris-HCl pH 8,5; mængden af chloroform tilføjes er lig med halv mængde af suspensionen. Luk hætten stramt. Ryst det kraftigt for præcis 20 s. centrifugeres det straks ved 8400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  4. Overføre den øverste overskyede vandig fase til 1,6-mL microtubes. Tilføje proteasehæmmere (10 µM amastatin 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A) til at erstatte hæmmere fjernet af chloroform behandling. Der centrifugeres prøver på 13.000 x g i 30 min. ved stuetemperatur. Overføre supernatanten til friske microtubes og gentage centrifugering for at fjerne uopløselige materiale.

4. anion-exchange kromatografi

  1. Blandingen henstår kolonnen 5 mL anion exchange (Q) knyttet til en fast-protein Væskekromatografisk system med Q-kolonne buffer med en væskehastighed på 5 mL/min. indtil absorbans ved 280 nm og ledningsevne stabilisere (ca. 50 mL buffer).
  2. Indlæse supernatanten fra trin 3.3 på afbalancerede kolonnen med en væskehastighed på 1 mL/min. vent indtil absorbansen på 280 nm stabiliserer på baggrunden. Anvende en 25-mL lineær gradient af Q-kolonne eluering bufferen fra 0% til 100% med en væskehastighed på 0,5 mL/min. indsamle 1 mL fraktioner.
  3. Analysen de enkelte fraktioner svarende til den store eluering peak for ATP hydrolytisk aktivitet af Pullman ATPase assay2 ved pH 8,0. Anvendes 10 µL af hver fraktion per 1 mL af reaktionsblandingen. Samle de fraktioner, der udviser ATPase aktivitet. Valgfrit, adskille 10 µL af hver fraktion på sodium dodecyl fosfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og plette gel ved Coomassie Blue at visualisere individuelle F1-ATPase underenheder og kontaminerende proteiner.
  4. Koncentrat poolet prøve af membran ultrafiltrering ved hjælp af en spin kolonne med 100.000 MWCO PES filter til 200-500 µL. Fortsæt til sek eller store prøve natten over ved stuetemperatur.

5. størrelse-udelukkelse kromatografi

  1. Blandingen henstår kolonnen sekund attacheret en Væskekromatografisk system med mindst 48 mL (to kolonne diskenheder) SEK buffer med en væskehastighed på 0,5 mL/min.
  2. Anvende prøven på kolonnen og køre kromatografi med en væskehastighed på 0,25 mL/min. indsamle 0,25-mL fraktioner.
  3. Køre 10 µL af de fraktioner, der svarer til toppene af UV280nm absorbans spor på SDS-PAGE og bejdse dem ved Coomassie Blue. Den første store højdepunkt indeholder F1-ATPase. Analysen i fraktioner, svarende til dette højdepunkt for ATP hydrolytisk aktivitet og indeholder følsomhed af Pullman ATPase assay. Bestemme proteinkoncentration af BCA assay.
  4. Holde den renset F1-ATPase ved stuetemperatur og bruge det i 3 d efter rensning for efterfølgende ansøgninger. Alternativt, koncentrere sig prøven ved hjælp af en spin kolonne med 100.000 MWCO PES filter > 1,5 mg / ml, bundfald det ved at blande det med mættede ammonium sulfat justeres til pH 8,0 (1,2 x volumen), og opbevar den ved 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En typisk rensning (figur 1) starter med mitokondrie vesikler (mitoplasts) isoleret på Percoll forløbet fra hypotonically mængden 1 x 1011 til 2 x 1011 procyklisk T. brucei celler25 kulturperler i standard glukose-rige SDM-79 medium27. Mitoplasts er fragmenterede ved hjælp af sonikering, spundet, og matrix-holdige supernatanten er kasseret. Mitokondrie membraner er behandlet med chloroform at frigive F1-ATPase. Efter centrifugering, er den organiske fase og udfældet interphase kasseret. Den vandige fase er fraktioneret ved ionbytning kromatografi på kvaternære ammonium, en stærk anionbytter (figur 2A). De fraktioner, der svarer til den store eluering toppe og indeholder F1-ATPase er samlet og koncentreret. Dette materiale fungerer som input for SEC, som fjerner resterende urenheder. Det store forurenende stof er dihydrolipoyl dehydrogenase, som eluerer fra kolonnen sek som en diskret peak, præget af den mørke grønne linje i figur 2B. F1-ATPase eluerer i den første dominerende, i vid udstrækning symmetrisk peak (figur 2B).

Forløbet af rensning er efterfulgt af BCA protein assay (eller en anden fælles protein assay), SDS-PAGE og overvågning af ATPase aktivitet. Sats for ATP hydrolyse måles af Pullman ATP regenererende assay2, baseret på nedsættelse af absorbansen af NADH i den koblede reaktion. Natriumazid, en etableret hæmmer af F1-ATPase, bruges i en koncentration på 2-mM til at bestemme andelen af F1-ATPase-specifikke ATP hydrolyse. Det input materiale indeholder typisk cirka 150-300 mg af mitokondrielle proteiner, afhængigt af antallet af celler, der bruges som kilde til mitokondrie vesikler. Den indeholder-følsomme andel af den samlede ATPase aktivitet er omkring 30-40% på dette stadium. Efter chloroform udvinding, mere end 90% af ATPase aktivitet i stikprøven er bidraget til F1-ATPase. Den renset F1- ATPase er næsten helt følsomme indeholder behandling (den minimal residual ATPase aktivitet kan tilskrives baggrund ATP autolysis) og udgør ca. 1% masse input protein med en omtrentlig udbytte af 1 - 1,5 mg F1-ATPase pr. 1 x 1011 celler (tabel 1). En typisk band mønster efter adskillelsen af de oprensede F1-ATPase på SDS-PAGE gel efterfulgt af Coomassie blå farvning er vist i figur 2 c. Proteinerne, der blev identificeret af peptid masse fingeraftryk og karakteriseret i detaljer ved forskellige massespektrometri tilgange23. Sporadiske svage bands synlig over β-underenhed bandet repræsenterer subcomplexes af α3β3 medaljon (dimere og oligomerer af α - og β-underenheder) og er blottet for alle forurenende stoffer kan påvises ved følsomme massespektrometri teknikker. Den renset F1-ATPase kan opbevares i op til flere dage i SEK bufferen ved stuetemperatur. Alternativt, F1-ATPase koncentreret til ≥2 mg/mL kan blive fremskyndet af et lige saa stort volumen af mættede ammonium sulfat i SEK-buffer med pH justeret til 8,0, og opbevares ved 4 ° C. I mindst seks måneder efter nedbøren, kan det aktive enzym med ingen åbenlyse forringelse af enhver subunit fås ved redissolving det udfældede materiale i SEK buffer eller lignende løsning. Men oplagring længere end en måned er ikke egnet til krystallisering, som bestemt empirisk.

Figure 1
Figur 1 : Ordningen af proceduren rensning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : To-trins rensning af chloroform-udgivet F1-ATPase ved væskekromatografi. (A) eluering profil af anion-exchange kromatografi (øverste panel) og udvalgte fraktioner adskilt på 10-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel farves med Coomassie blå farvestof (nederste panel). Blå spor: UV absorbans ved 280 nm; røde spor: koncentration af NaCl i eluering buffer; Input: F1-ATPase udgivet af chloroform; FT: flow-through. (B) eluering profil af SEC (øverste panel) og udvalgte fraktioner adskilt på SDS-PAGE gel farves med Coomassie blå farvestof (nederste panel). Input: samlet fraktioner fra anion-exchange kromatografi indeholdende F1-ATPase. De farvekodede bjælker i paneler A og B mark fraktioner i eluering profiler, der blev analyseret af SDS-PAGE og de tilsvarende baner i den respektive gel. (C) identiteten af individuelle proteiner af isolerede F1-ATPase som identificeret af massespektrometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Proteinkoncentration (mg/mL) Total protein (mg) Andelen af råmateriale (%) Aktivitet
(ΜmolATP x mg-1 x min-1)
Indeholder følsomhed (%)
Mitokondrie vesikler i buffer A 16.2 170 100 1.3 25-35
Mitokondrie membraner i buffer B 18.6 97 57 2.4 35-45
Chloroform udvundet fraktioner 2.5 7,9 4.7 12 91-95
F1-ATPase efter Q-kolonne - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase efter gel filtrering - 1,6 0,93 48 93-98

Tabel 1: Et eksempel på den typiske fremskridt og udbytte af F1-ATPase rensning fra mitokondrierne isoleret fra 1 x 1011 procyklisk T. brucei celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokol for F1-ATPase rensning fra T. brucei blev udviklet baseret på tidligere udgivne metoder til isolering af F1-ATPase komplekser fra andre arter13,14. Metoden kræver ikke nogen genetisk modifikation (f.eks.kodning) og giver et fuldt aktivt kompleks med alle underenheder stede. Det afgørende skridt er chloroform-faciliteret udgivelsen af F1-ATPase fra den membran-attached del af enzymet. Den frigivne subcomplex indeholdt i purifications fra alle eukaryote arter beskrevet hidtil, underenheder α, β, γ, δ og ε i en støkiometrisk af 3:3:1:1:1. I T. brucei, F1-ATPase indeholder en yderligere tre kopier af subunit p18, en roman komponent er begrænset til euglenozoan protister23. Derudover er euglenozoan α-subunit proteolytically opdelt i to fragmenter, både stabilt forbundet med komplekse24,28,29. Subunit OSCP (oligomycinets-følsomhed-tildeling protein), der forbinder F1-gruppe til den perifere stilk30, er fraværende fra den frigivne kompleks, som er i overensstemmelse med F1-ATPase purifications af chloroform udtræk fra andre arter13,14.

Chloroform-udgivet F1-ATPase er yderligere renset af væskekromatografi. I forbindelse med den bovine F1-ATPase, kun én kromatografi skridt, størrelse-udelukkelse kromatografi, er tilstrækkeligt for at opnå en meget ren og aktiv komplekse31. De enkelt sek set-up var imidlertid utilstrækkelige til rensning af T. brucei F1-ATPase, som brøker beriget til F1-ATPase indeholdt ekstra protein forureninger, hovedsagelig delta-1-pyrroline-5-carboxylat dehydrogenase. Derfor, anion-exchange kromatografi var indført før sek som den første og største rensende skridt, og SEC fungerer som den efterfølgende polering procedure. For krystallisering eksperimenter, anvendelse af kolonnen Superdex 200 øge viste sig for at være væsentlige, da denne kolonne, forudsat at materiale, der tillod voksende krystaller af god kvalitet. Det er sandsynligt, at løsningen af kolonnen aktiveret adskillelse af en lille del af ufuldstændige komplekser, der blandede sig med krystallisering. Men for andre programmer end krystallisering, adskillelse ved hjælp af kolonnen Superdex 200 var lige så tilfredsstillende.

At beskytte F1-ATPase komplekse fra delvis proteolyse af ukendt protease(s) stede i den mitokondrielle lysate, de oprindelige buffere A og B findes en bred vifte af proteasehæmmere. Virkningen af individuelle hæmmere på proteolyse af F1-ATPase underenheder er ikke blevet testet og, mest sandsynligt, tilstedeværelsen af nogle af hæmmere er overflødige. For trinnet sek hæmmere føjes ikke længere, da de kontaminerende proteaser fjernes fra F1-ATPase stikprøve af chloroform udvinding eller de første skridt i kromatografi.

Omstændelig protokollen fører uundgåeligt til delvis tab af F1-ATPase. Den mest betydelige tab (25-45% af det samlede beløb) opstår under trinnet koncentration af membran ultrafiltrering på et spin kolonne efter anion-exchange-chromatografi. F1-ATPase sandsynligvis klæber til membranen af kolonnen spin. Således, for nogle downstream programmer, som ikke kræver en meget ren og koncentreret prøve (fxenzymatiske assays og hæmmende skærme), F1-ATPase kan anvendes umiddelbart efter anion-exchange-chromatografi (Se figur 2b, Input lane).

Selv om rensning af F1-ATPase fra forskellige organismer varierer i detaljerne, den generelle arbejdsgang forbliver den samme. Derfor, denne protokol kan tjene som en rettesnor for udviklingen af F1-ATPase isolation protokollen over andre rigelige kilder, såsom væv eller celler planteafgrøderne på en stor skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for uddannelse ERC CZ give LL1205, Grant agenturet af Tjekkiet grant 18-17529S, og ved EFRU/ESF projekt Centre for forskning af patogenicitet og virulens af parasitter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
Isolering af F<sub>1</sub>-ATPase fra parasitære Protist <em>Trypanosoma brucei</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter