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Biochemistry

1का अलगाव-परजीवी Protist Trypanosoma brucei से ATPase

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल Trypanosoma bruceiके कल्चरल कीट मंच से एफ1-ATPase की शुद्धि का वर्णन करता है । प्रक्रिया एक उच्च शुद्ध, सजातीय, और सक्रिय संरचनात्मक और एंजाइमी अध्ययन के लिए उपयुक्त जटिल पैदावार ।

Abstract

f1-ATPase एक झिल्ली है-बाह्य उत्प्रेरक उपपरिसर के एफ प्रकार एटीपी सिंथेस, एक एंजाइम है कि जैविक झिल्ली में प्रोटॉन मकसद बल का उपयोग करता है adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन । बरकरार एफ1के अलगाव-अपने मूल स्रोत से ATPase एक आवश्यक शर्त है एंजाइम प्रोटीन संरचना, काइनेटिक मापदंडों, और अवरोधकों के लिए संवेदनशीलता की विशेषता है । एक अत्यंत शुद्ध और सजातीय एफ1-ATPase संरचनात्मक अध्ययन है, जो एटीपी संश्लेषण और hydrolysis के आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह लेख एफ1की शुद्धि के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन- Trypanosoma brucei, अफ्रीकी trypanosomiases के प्रेरणा का एजेंट से ATPase । एफ1-ATPase mitochondrial बुलबुले, जो इन विट्रो में से hypotonic lysis द्वारा प्राप्त कर रहे है से पृथक है प्रसंस्कृत trypanosomes । बुलबुले यांत्रिक sonication द्वारा खंडित कर रहे हैं और F1-ATPase भीतरी mitochondrial झिल्ली से क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा जारी किया गया है । एंजाइमी परिसर आगे लगातार आयनों एक्सचेंज और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है । संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक से पता चला है कि शुद्ध परिसर वस्तुतः किसी भी प्रोटीन पदार्थों से रहित है और, इसलिए, एक्स-रे क्रि या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है । अलग एफ1-ATPase प्रदर्शन एटीपी hydrolytic गतिविधि है, जो पूरी तरह से सोडियम azide, एफ प्रकार एटीपी synthases के एक शक्तिशाली अवरोधक द्वारा बाधित किया जा सकता है । शुद्ध परिसर स्थिर रहता है और कमरे के तापमान पर कम से तीन दिनों के लिए सक्रिय है । अमोनियम सल्फेट द्वारा वर्षण लंबी अवधि के भंडारण के लिए प्रयोग किया जाता है । स्तनधारी और संयंत्र के ऊतकों, खमीर, या बैक्टीरिया से एफ1-ATPases की शुद्धि के लिए इसी तरह की प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया गया है । इस प्रकार, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एफ1के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकते है-ATPase अंय जीवों से अलगाव ।

Introduction

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एफ-प्रकार एटीपी synthases है झिल्ली बंधे घूर्णन multiprotein परिसरों कि जोड़े प्रोटॉन ऊर्जा भर में translocation-जीवाणुओं transducing झिल्ली, mitochondria, और एटीपी के गठन के साथ chloroplasts । एटीपी संश्लेषण के घूर्णन तंत्र के आणविक विवरण मुख्य रूप से शुद्ध बैक्टीरियल और mitochondrial एटीपी synthases और उनके उपपरिसरों के संरचनात्मक अध्ययन के कारण जाना जाता है1. एफ प्रकार एटीपी सिंथेस झिल्ली में आयोजित किया जाता है-आंतरिक और झिल्ली-बाह्य moieties । झिल्ली-बाह्य भाग, एफ1-ATPase के रूप में जाना जाता है, तीन उत्प्रेरक साइटों, जहां adenosine diphosphate के फास्फारिलीकरण (ADP) एटीपी या रिवर्स प्रतिक्रिया होती है होता है । एफ1-ATPase झिल्ली से प्रयोग जारी किया जा सकता है-आंतरिक moiety जबकि hydrolyze करने की क्षमता को बनाए रखने, लेकिन संश्लेषित नहीं, एटीपी । झिल्ली से बंधे क्षेत्र, एफकहा जाता है, प्रोटीन translocation, जो एंजाइम के मध्य भाग के रोटेशन ड्राइव मध्यस्थता । एफ1 और एफ सेक्टरों केंद्रीय और परिधीय डंठल से जुड़े हुए हैं ।

पहली एफ1को शुद्ध करने का प्रयास-ATPase नवोदित खमीर और गोजातीय दिल mitochondria तारीख से 1960 के दशक के लिए वापस । इन प्रोटोकॉल उपयोग निकाले गए mitochondria, जो sonication द्वारा बाधित किए गए थे, अमोनियम या protamine सल्फेट वर्षण द्वारा fractionated, वैकल्पिक क्रोमैटोग्राफी कदम (ओं) और गर्मी उपचार2,3,4 द्वारा पीछा किया ,5,6. शुद्धि बहुत सुधार और क्लोरोफॉर्म, जो आसानी से एफ1-ATPase mitochondrial झिल्ली टुकड़े7से रिलीज के उपयोग से सरलीकृत किया गया । क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण तो विभिंन पशु, संयंत्र, और बैक्टीरियल स्रोतों से एफ1-ATPases निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था (जैसे, चूहा जिगर8, मकई9, एरम maculatum10, और ई कोलाई 11). क्लोरोफॉर्म-जारी एफ1के आगे शुद्धि-ATPase द्वारा अपनत्व या आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एक उच्च शुद्ध प्रोटीन जटिल है, जो उच्च संकल्प संरचना के लिए उपयुक्त था उपज द्वारा एक्स-रे क्रि, के रूप में एफ1की संरचनाओं द्वारा प्रलेखित-ATPase गोजातीय दिल से12,13 और Saccharomyces cerevisiae14। एफ1-ATPase संरचनाओं भी जीवों से निर्धारित किया गया है कि खेती करने के लिए मुश्किल है और, इस प्रकार, प्रारंभिक जैविक सामग्री की मात्रा सीमित थी । इस मामले में, एफ1-ATPase उपइकाइयों कृत्रिम रूप से व्यक्त किया और ई. कोलाईमें परिसर में इकट्ठे हुए थे, और पूरे heterologous एंजाइम एक टैग उपइकाई के माध्यम से अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था । इस तरह के दृष्टिकोण दो thermophilic बैक्टीरियल प्रजातियों, Geobacillus stearothermophilus15 और Caldalkalibacillus thermarum16से एफ1-ATPase संरचनाओं के निर्धारण के लिए नेतृत्व किया, 17. हालांकि, इस पद्धति के बजाय eukaryotic F1-ATPases के लिए अनुपयुक्त है क्योंकि यह prokaryotic protheosynthetic तंत्र, posttranslational प्रसंस्करण, और जटिल विधानसभा पर निर्भर करता है ।

क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण पहले एफ1-ATPases से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कोशिकीय digenetic परजीवी Trypanosomacruzi18 और brucei 19, महत्वपूर्ण स्तनधारी के कारण रोगजनकों अमेरिकी और अफ्रीकी trypanosomiases क्रमशः, और monogenic कीट परजीवी Crithidia fasciculata20से । इन शुद्धि केवल एफ1-ATPases का एक सरल वर्णन करने के लिए नेतृत्व किया, के बाद से कोई बहाव अनुप्रयोगों के लिए पूरी तरह से संरचना, संरचना, और परिसर के एंजाइमी गुण विशेषताएं थे । इस लेख एफ1के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन-ATPase bruceiके कल्चरल कीट जीवन चक्र चरण से शुद्धि । विधि गोजातीय और खमीर एफ1-ATPases21,22के अलगाव के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के आधार पर विकसित की है । प्रक्रिया अत्यधिक शुद्ध और सजातीय एंजाइमों में इन विट्रो एंजाइमी और निरोधात्मक परख के लिए उपयुक्त पैदावार, मास स्पेक्ट्रोमेट्री23द्वारा विस्तृत proteomic लक्षण वर्णन, और संरचना निर्धारण24। शुद्धि प्रोटोकॉल और एफ1के ज्ञान-परमाणु स्तर पर ATPase संरचना के लिए स्क्रीन डिजाइन करने के लिए एक संभावना को खोलता है छोटे अणु अवरोधकों की पहचान, और अफ्रीकी trypanosomiases के खिलाफ नई दवाओं के विकास में सहायता । इसके अलावा, प्रोटोकॉल अंय जीवों से एफ1-ATPase शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

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1. बफ़र्स और समाधान

  1. नीचे सूचीबद्ध समाधानों को तैयार करें । Degas सभी बफ़र्स के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी । ADP, benzamidine, और बस उपयोग करने से पहले अवरोधकों जोड़ें ।
    1. तैयार बफर एक: ५० mM Tris बफर हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ (Tris-HCl) पीएच ८.०, ०.२५ एम सुक्रोज, ५ एमएम benzamidine, ५ एमएम aminocaproic एसिड (ऐका), व छेड़ने वाले अवरोधकों (१० µ मी amastatin, ५० µ मीटर bestatin, ५० µ मीटर pepstatin, ५० µ मीटर leupeptin, तथा ५० µ एम diprotin ए).
    2. तैयार बफर बी: ५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.२५ मीटर सुक्रोज, 4 एमएम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 5 एमएम benzamidine, 5 एमएम ऐका, 1 एमएम ADP, और चिढ़ाना अवरोधकों (10 µ मीटर amastatin, ५० µ मीटर bestatin, ५० µ एम pepstatin, ५० µ एम leupeptin, और ५० µ एम diprotin ए) ।
    3. Q-स्तंभ बफ़र तैयार करें: 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, 4 मिमी EDTA, 10 मिमी MgSO4, 5 मिमी benzamidine, 5 मिमी ऐका, और 1 मिमी ADP.
    4. q-स्तंभ रेफरेंस बफ़र तैयार करें: 1 M NaCl के साथ q-स्तंभ बफ़र ।
    5. सेकंड बफर तैयार: 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, 10 मिमी MgSO4, १०० मिमी NaCl, 1 मिमी ADP.
    6. तैयार क्लोरोफॉर्म 2 एम Tris-एचसीएल पीएच ८.५ के साथ संतृप्त । एक पेंच कैप बोतल में लगभग 1:1 अनुपात में 2 मीटर Tris-एचसीएल पीएच ८.५ के साथ क्लोरोफॉर्म मिश्रण, शेक, जैविक और जलीय चरणों अलग चलो, और पीएच-संकेतक कागज की एक पट्टी के साथ ऊपरी जलीय परत में पीएच उपाय । कमरे के तापमान पर स्टोर । बस का उपयोग करने से पहले, फिर से हिला और दो चरणों को अलग । लोअर क्लोरोफॉर्म लेयर का इस्तेमाल करें ।
      चेतावनी: क्लोरोफॉर्म अस्थिर और आंखों और त्वचा के लिए परेशान है । एक धुएं डाकू में काम करते हैं । मिलाते समय सुरक्षा तमाशा का प्रयोग करें ।

2. उप mitochondrial कणों की तैयारी

  1. resuspend mitochondrial बुलबुले (mitoplasts) से पृथक hypotonic lysis25 से 1 x 1011 करने के लिए 2 x 1011 की कोशिकाओं में चक्रीय टी brucei की 5 मिलीलीटर बर्फ ठंड बफर A. नमूना रखें जब तक ३.२ कदम ठंडा ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख26 द्वारा निलंबन में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
    1. ultrapure पानी में एक गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) कमजोर पड़ने श्रृंखला का उपयोग करने के लिए मानक वक्र का निर्माण । BSA मानकों की सीमा में फिट करने के लिए ultrapure पानी के साथ 20-100 बार नमूना की एक छोटी राशि पतला ।
    2. नमूना में कुल प्रोटीन राशि की गणना और प्रोटीन एकाग्रता लाने के लिए 16 मिलीग्राम/एमएल के साथ कमजोर द्वारा यह अतिरिक्त बफर A ।
  3. mitoplasts के लिए निलंबन 7x के sonication द्वारा उल्टे बुलबुले और झिल्ली के टुकड़ों में टुकड़ा ७० ३.९ मिमी के व्यास के साथ एक microtip के साथ १०० के प्रति आवेग के लिए एक कुल ऊर्जा के साथ 15 एस । यदि अल्ट्रासोनिक homogenizer ऊर्जा उत्पादन प्रदर्शित नहीं करता है, अधिक से अधिक शक्ति का ५०% पर अनुकूलन शुरू करते हैं । आवेगों के बीच 30 एस के लिए बर्फ पर नमूना मशीन । sonication के बाद, निलंबन थोड़ा गहरा हो जाता है ।
  4. तलछट झिल्ली अंशों को ultracentrifugation द्वारा ५४,००० x g पर 16 ज के लिए या ९८,००० x g पर 5 ज के लिए 4 ° c पर । supernatant और क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ना, या फ्लैश-तरल नाइट्रोजन में तलछट फ्रीज और यह दुकान पर-८० ° c ।

3. एफ1के रिलीज-क्लोरोफॉर्म द्वारा झिल्ली से ATPase

  1. एक छोटे से Dounce homogenizer की सहायता से बफर बी में mitochondrial झिल्ली की गोली resuspend । बफ़र b की कुल मात्रा पर आधारित चरण २.१ और २.२ निंन सूत्र का उपयोग करते हुए बफ़र का वॉल्यूम परिकलित करें: खंड (बफ़र b) = वॉल्यूम (बफ़र A) x 12/21 । 15-या ५०-एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए निलंबन स्थानांतरण ।
  2. बर्फ से नमूना निकालें और, अब से, नमूना रखने के लिए और सभी समाधान कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
  3. 2 M Tris-HCl pH ८.५ के साथ संतृप्त क्लोरोफॉर्म जोड़ें; क्लोरोफॉर्म के वॉल्यूम को निलंबन के आधे वॉल्यूम के बराबर जोड़ दिया जाएगा । टोपी कसकर बंद करें । यह वास्तव में 20 एस के लिए जोरदार शेक यह ८,४०० x जी पर तुरंत कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  4. १.६-एमएल microtubes के लिए अपर बादल जलीय चरण स्थानांतरण । को छेड़ो अवरोधकों जोड़ें (10 µ एम amastatin, ५० µ एम bestatin, ५० µ एम pepstatin, ५० µ एम leupeptin, और ५० µ एम diprotin ए) क्लोरोफॉर्म उपचार द्वारा हटाए गए अवरोधकों की जगह । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १३,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । ताजा microtubes करने के लिए supernatant हस्तांतरण और किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए केंद्रापसारक दोहराने ।

4. आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी

  1. Equilibrate 5-एमएल आयनों एक्सचेंज (क्यू) स्तंभ के साथ एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के लिए संलग्न q-कॉलम बफर 5 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर २८० एनएम पर अवशोषित और चालकता स्थिर (लगभग ५० मिलीलीटर बफर) ।
  2. equilibrated स्तंभ पर चरण ३.३ से supernatant 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर लोड/२८० एनएम पर अवशोषक पृष्ठभूमि में स्थिर जब तक रुको । Q-स्तंभ रेफरेंस बफ़र की 25-मिलीलीटर रेखीय ग्रेडिएंट को 0% से १००% से ०.५ मिलीलीटर की प्रवाह दर पर लागू करें । 1-एमएल अंश लीजिए ।
  3. परख ८.० पीएच पर पुलमैन ATPase परख2 द्वारा एटीपी hydrolytic गतिविधि के लिए प्रमुख रेफरेंस पीक के लिए इसी व्यक्तिगत अंश । प्रतिक्रिया मिश्रण के 1 मिलीलीटर प्रति प्रत्येक अंश के 10 µ एल का उपयोग करें । पूल भागों है कि प्रदर्शन ATPase गतिविधि । वैकल्पिक रूप से, सोडियम dodecyl फॉस्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) पर प्रत्येक अंश के पृथक 10 µ एल और Coomassie ब्लू द्वारा जेल दाग व्यक्तिगत एफ1-ATPase उपइकाईओं और दूषित प्रोटीन कल्पना करने के लिए ।
  4. २००-५०० µ के लिए एक १००,००० MWCO पी इ एस फिल्टर के साथ एक स्पिन कॉलम का उपयोग कर झिल्ली ultrafiltration द्वारा परित नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए सेकंड के लिए आगे बढ़ना या कमरे के तापमान पर रात भर के नमूने की दुकान ।

5. आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी

  1. Equilibrate एक लिक्विड क्रोमैटोग्राफी सिस्टम से जुड़ी सेकंड कॉलम को सेकंड बफर के कम से ४८ मिलीलीटर (दो कॉलम वॉल्यूम्स) के साथ ०.५ मिलीलीटर की प्रवाह दर/
  2. स्तंभ पर नमूना लागू करें और ०.२५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर क्रोमैटोग्राफी चलाने/०.२५-एमएल अंशों लीजिए ।
  3. भाग के 10 µ एल भागो कि यूवी280nm अवशोषक एसडीएस पर ट्रेस-पृष्ठ की चोटियों के अनुरूप है और उंहें Coomassie नीले रंग से दाग । पहली बड़ी चोटी शामिल एफ1-ATPase । परख पुलमैन ATPase परख द्वारा एटीपी hydrolytic गतिविधि और azide संवेदनशीलता के लिए इस चोटी के लिए इसी अंश । बीसीए परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
  4. कमरे के तापमान पर शुद्ध एफ1-ATPase रखें और बहाव अनुप्रयोगों के लिए शुद्धि के बाद 3 डी के भीतर इसका इस्तेमाल करते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक १००,००० MWCO पी इ एस फ़िल्टर के साथ एक स्पिन कॉलम का उपयोग कर नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए > १.५ मिलीग्राम/एमएल, यह यह संतृप्त अमोनियम सल्फेट के साथ यह मिश्रण से तेज़ी से पीएच ८.० (1.2 x मात्रा) समायोजित, और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।

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Representative Results

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एक ठेठ शुद्धि (चित्रा 1) mitochondrial बुलबुले के साथ शुरू होता है (mitoplasts) hypotonically लीजड ड 1 एक्स 1011 से 2 x 1011 चक्रीय टी brucei कोशिकाओं25 मानक में संस्कृति के Percoll ढाल पर पृथक ग्लूकोज से भरपूर एसडीएम-७९ मध्यम27. mitoplasts sonication, काता द्वारा खंडित कर रहे हैं, और मैट्रिक्स युक्त supernatant छोड़ दिया है । F1-ATPase को रिलीज करने के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ Mitochondrial झिल्ली का इलाज किया जाता है । केंद्रापसारक के बाद, कार्बनिक चरण और उपजी चरण छोड़ दिया जाता है । जलीय चरण आयन द्वारा fractionated है-चतुर्धातुक अमोनियम पर विनिमय क्रोमैटोग्राफी, एक मजबूत आयनों एक्सचेंजर (चित्रा 2a) । भिंन है कि प्रमुख रेफरेंस पीक के अनुरूप है और एफ1-ATPase और परित केंद्रित कर रहे हैं । यह सामग्री सेकंड के लिए इनपुट के रूप में कार्य करता है, जो अवशिष्ट दोष समाप्त । प्रमुख contaminant dihydrolipoyl डिहाइड्रोजनेज, जो एक असतत चोटी के रूप में सेकंड कॉलम से elutes, चित्रा बीमें गहरे हरे रंग की पट्टी द्वारा चिह्नित है । एफ1-ATPase elutes पहले प्रमुख, मोटे तौर पर सममित चोटी (चित्रा 2बी) में ।

शुद्धिकरण की प्रगति बीसीए प्रोटीन परख (या एक अंय आम प्रोटीन परख), एसडीएस-पृष्ठ, और ATPase गतिविधि की निगरानी के बाद है । एटीपी hydrolysis की दर को पुलमैन एटीपी पुनर्सृजन परखद्वारा मापा जाता है, जो युग्मक अभिक्रिया में नध के अवशोषण की कमी के आधार पर करता है. सोडियम azide, एफ1के एक स्थापित अवरोधक-ATPase, एफ1-ATPase-विशिष्ट एटीपी hydrolysis के अनुपात का निर्धारण करने के लिए एक 2-mM एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है । आमतौर पर, इनपुट सामग्री लगभग १५०-३०० मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन, mitochondrial बुलबुले के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या के आधार पर शामिल हैं । कुल ATPase गतिविधि का azide-संवेदी अनुपात इस स्तर पर 30% से ४०% के आसपास है । क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बाद, नमूना में ATPase गतिविधि के ९०% से अधिक एफ1-ATPase करने के लिए योगदान दिया है । शुद्ध एफ1-ATPase वस्तुतः पूरी तरह से azide उपचार के प्रति संवेदनशील है (ंयूनतम अवशिष्ट ATPase गतिविधि पृष्ठभूमि एटीपी autolysis के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है) और इनपुट प्रोटीन द्रव्यमान का 1% के आसपास का प्रतिनिधित्व करता है, 1 की अनुमानित उपज के साथ- एफ1-ATPase प्रति 1 x 1011 कोशिकाओं (तालिका 1) के १.५ मिलीग्राम । शुद्ध एफ1की जुदाई के बाद एक ठेठ बैंड पैटर्न-ATPase एसडीएस-पृष्ठ जेल पर Coomassie नीले दाग के बाद चित्रा 2cमें दिखाया गया है । प्रोटीन पेप्टाइड मास फिंगरप्रिंटिंग द्वारा पहचाने गए थे और विस्तार में विभिन्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री23के दृष्टिकोण से विशेषता. छिटपुट कमजोर बैंड β-उपइकाई बैंड के ऊपर दिखाई α3β3 बुद्धि के उपपरिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं (dimers और oligomers के α-और β-उप यूनिटों) और संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों द्वारा पता लगाने के लिए किसी भी संदूषणों से रहित हैं. शुद्ध एफ1-ATPase कमरे के तापमान पर सेकंड बफर में कई दिनों तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एफ1-ATPase ≥ करने के लिए ध्यान केंद्रित 2 मिलीग्राम/एमएल सेकंड बफर में संतृप्त अमोनियम सल्फेट की एक बराबर मात्रा से उपजी जा सकता है, ८.० के लिए समायोजित पीएच के साथ, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । वर्षण के बाद कम से छह महीने के लिए, किसी भी उपइकाई की कोई स्पष्ट गिरावट के साथ सक्रिय एंजाइम सेकंड बफर या इसी तरह के समाधान में उपजी सामग्री redissolving द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, एक महीने से अधिक समय तक भंडारण क्रिस्टलीकरण के लिए उपयुक्त नहीं है, के रूप में निर्धारित empirically ।

Figure 1
चित्रा 1 : शुद्धिकरण प्रक्रिया की योजना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : क्लोरोफॉर्म की दो-चरणीय शुद्धि-जारी F1-ATPase द्वारा तरल क्रोमैटोग्राफी. () आयनों का रेफरेंस प्रोफाइल-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (ऊपरी पैनल) और चुनिंदा अंशों पर पृथक से १०%-२०% Tris-glycine एसडीएस-पृष्ठ जेल सना हुआ Coomassie ब्लू डाई (लोअर पैनल) के साथ. ब्लू ट्रेस: २८० एनएम पर यूवी अवशोषक; लाल ट्रेस: NaCl के रेफरेंस बफर में एकाग्रता; इनपुट: एफ1-क्लोरोफॉर्म द्वारा जारी ATPase; FT: प्रवाह के माध्यम से । () एसईसी के रेफरेंस प्रोफाइल (ऊपरी पैनल) और चयनित अंशों को एसडीएस-PAGE gel पर अलग कर दिया Coomassie ब्लू डाई (लोअर पैनल) के साथ सना हुआ । इनपुट: आयनों से परित भिंन-विनिमय एफ1-ATPase युक्त क्रोमैटोग्राफी । रंग-पैनलों में कोडित सलाखों के एक और बी निशान रेफरेंस प्रोफाइल है कि एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया में भिंन-पृष्ठ और संबंधित जेल में इसी गलियों । () पृथक च-ATPase के व्यक्तिगत प्रोटीनों की पहचान जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचानी गई है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटीन एकाग्रता (mg/ कुल प्रोटीन (mg) इनपुट सामग्री का अनुपात (%) गतिविधि
(μmolएटीपी एक्स मिलीग्राम-1 एक्स मिन-1)
Azide संवेदनशीलता (%)
बफर में Mitochondrial बुलबुले एक १६.२ १७० १०० १.३ 25-35
बफर बी में Mitochondrial झिल्ली १८.६ ९७ ५७ २.४ 35-45
क्लोरोफॉर्म निकाले गए अंश २.५ ७.९ ४.७ 12 91-95
1-ATPase के बाद क्ष-स्तम्भ - २.२ १.३ 23 92-96
एफ1-जेल निस्पंदन के बाद ATPase - १.६ ०.९३ ४८ 93-98

तालिका 1: ठेठ प्रगति और एफ1के उपज का एक उदाहरण-ATPase शुद्धीकरण से mitochondria से पृथक 1 x 1011 चक्रीय टी brucei कोशिकाओं ।

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Discussion

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एफ1के लिए प्रोटोकॉल-ATPase brucei से शुद्धीकरण एफ1के अलगाव के लिए पहले प्रकाशित तरीकों के आधार पर विकसित किया गया था-ATPase अंय प्रजातियों13,14से परिसरों । विधि किसी भी आनुवंशिक संशोधन (उदा, टैगिंग) की आवश्यकता नहीं है और सभी उपइकाइयों के साथ मौजूद एक पूरी तरह से सक्रिय परिसर पैदावार । महत्वपूर्ण कदम क्लोरोफॉर्म-एफ1के रिलीज की सुविधा-झिल्ली से ATPase-एंजाइम का हिस्सा संलग्न है । अब तक वर्णित सभी eukaryotic प्रजातियों में से शुद्धिकरण में, जारी उपपरिसरों में α, β, γ, δ, और ε के एक stoichiometry में 3:3:1:1:1 शामिल हैं । टी bruceiमें, एफ1-ATPase उपइकाई p18, एक उपंयास घटक euglenozoan प्रोटिस्टा23तक ही सीमित की एक अतिरिक्त तीन प्रतियां शामिल हैं । इसके अलावा, euglenozoan α-उपइकाई दो टुकड़ों में विभाजित proteolytically है, दोनों छुरा जटिल24,28,29के साथ जुड़े । उपइकाई OSCP (oligomycin-संवेदनशीलता-प्रदान प्रोटीन), जो परिधीय डंठल के लिए एफ1-moiety लिंक, जारी परिसर सेअनुपस्थित है, जो एफ1के साथ समझौते में है-ATPase क्लोरोफॉर्म द्वारा शुद्धीकरण अन्य प्रजातियों में से निष्कर्षण13,14.

क्लोरोफॉर्म-जारी एफ1-ATPase आगे तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है । गोजातीय एफ1-ATPase के मामले में, केवल एक क्रोमैटोग्राफी कदम, आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, एक अत्यधिक शुद्ध और सक्रिय जटिल31प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । हालांकि, एकल सेकंड सेट अप brucei f1-ATPase की शुद्धि के लिए अपर्याप्त था, के रूप में एफ1के लिए समृद्ध अंशों-ATPase अतिरिक्त प्रोटीन संदूषणों निहित, मुख्य रूप से डेल्टा-1-pyrroline-5-carboxylate डिहाइड्रोजनेज. इसलिए, आयनों-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी पहले और प्रमुख शुद्ध कदम के रूप में सेकंड के पहले पेश किया गया था, और सेकंड बाद चमकाने प्रक्रिया के रूप में कार्य करता है । क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए, Superdex २०० वृद्धि कॉलम के उपयोग के लिए आवश्यक साबित हो, क्योंकि इस कॉलम सामग्री है कि अच्छी गुणवत्ता के क्रिस्टल बढ़ती अनुमति प्रदान की है । यह संभावना है कि स्तंभ के समाधान अपूर्ण जटिल है कि क्रिस्टलीकरण के साथ हस्तक्षेप के एक छोटे से अनुपात की जुदाई सक्षम होना चाहिए । हालांकि, क्रिस्टलीकरण के अलावा अंय अनुप्रयोगों के लिए, Superdex २०० कॉलम का उपयोग कर जुदाई समान रूप से संतोषजनक था ।

F1-ATPase जटिल आंशिक प्रोटियोलिसिस से mitochondrial lysate, प्रारंभिक बफ़र्स में वर्तमान को सुरक्षित करने के लिए एक और बी को छेड़ने वाले अवरोधकों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है । एफ1-ATPase उपइकाइयों के प्रोटियोलिसिस पर व्यक्तिगत अवरोधकों के प्रभाव का परीक्षण नहीं किया गया है और, सबसे अधिक संभावना है, कुछ अवरोधकों की उपस्थिति बेमानी है । सेकंड कदम के लिए, अवरोधकों अब और नहीं जोड़ रहे हैं, के रूप में दूषित टीज़ क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या पहले क्रोमैटोग्राफी कदम से एफ1-ATPase नमूना से हटा रहे हैं ।

multistep प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से एफ1-ATPase के आंशिक नुकसान की ओर जाता है । सबसे महत्वपूर्ण नुकसान (25%-४५% कुल राशि का) एकाग्रता चरण के दौरान एक स्पिन कॉलम पर झिल्ली ultrafiltration आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के बाद होता है । F1-ATPase की संभावना स्पिन कॉलम की झिल्ली का पालन करती है । इस प्रकार, कुछ बहाव अनुप्रयोगों है कि एक उच्च शुद्ध और केंद्रित नमूना (जैसे, एंजाइमी परख और निरोधात्मक स्क्रीन) की मांग नहीं है के लिए, एफ1-ATPase तुरंत आयनों के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है-विनिमय क्रोमैटोग्राफी ( चित्रा देखें बी. ए., इनपुट लेन) ।

यद्यपि विभिन्न जीवों से F1-ATPase की शुद्धि विस्तार से बदलती रहती है, लेकिन सामान्य कार्यप्रवाह एक समान रहता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकते है F1-ATPase आइसोलेशन प्रोटोकॉल अंय प्रचुर मात्रा में स्रोतों, जैसे ऊतकों या एक बड़े पैमाने पर खेती की कोशिकाओं के रूप में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम शिक्षा मंत्रालय ईआरसी CZ अनुदान LL1205, चेक गणराज्य अनुदान 18-17529S की अनुदान एजेंसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और ERDF/ESF परियोजना केंद्र द्वारा pathogenicity और परजीवी के डाह के अनुसंधान के लिए (सं. CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

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References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
च<sub>1</sub>का अलगाव-परजीवी Protist <em>Trypanosoma brucei</em> से ATPase
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Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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