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Biochemistry

Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58334
Automatic Translation
1, 1,2
1Biology Centre, Czech Academy of Science, Institute of Parasitology, 2Faculty of Science, University of South Bohemia

Summary

Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell'insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.

Abstract

F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L'isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell'enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l'agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l'estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L'isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1- atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell'atpasi da altri organismi.

Introduction

I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell'adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F1-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell'intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato Fo, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell'enzima. La F1 e Fo settori sono collegati da steli centrali e periferici.

I primi tentativi di purificare la F1-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell'ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico2,3,4 ,5,6. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l'uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F1-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti7. L'estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F1- atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto8, mais9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F1-atpasi da cuore bovino12,13 e14di Saccharomyces cerevisiae. F1-strutture dell'atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F1-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l'enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F1-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus15 e thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F1- ATPasi dato che si basa sull'apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.

L'estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F1- atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata20. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F1- atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F1-purificazione dell'atpasi dalla fase del ciclo di vita dell'insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l'isolamento di bovini e lievito F1- ATPasi21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa23e struttura determinazione24. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F1-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F1-atpasi da altri organismi.

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Protocol

1. tamponi e soluzioni

  1. Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell'uso.
    1. Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
    2. Preparare di tampone b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M saccarosio, acido etilendiamminotetracetico 4mm (ed), 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP e inibitori della proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
    3. Preparare il tampone di Q-colonna: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO4, 5mm benzamidine, 5mm ACA e 1 mM ADP.
    4. Preparare il tampone di eluizione di Q-colonna: buffer di Q-colonna con NaCl di 1m.
    5. Preparare il tampone di SEC: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 10mm MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Preparare il cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5. Mescolare il cloroformio con 2 M Tris-HCl pH 8,5 in rapporto di circa 1:1 in una bottiglia con tappo a vite, agitare, let fasi organiche ed acquose separate e misurare il pH nello strato acquoso superiore con una striscia di carta indicatore di pH. Conservare a temperatura ambiente. Appena prima dell'uso, agitare nuovamente e lasciare che le fasi separate. Utilizzare lo strato inferiore di cloroformio.
      Attenzione: Il cloroformio è volatile ed irritante per gli occhi e la pelle. Lavorare in una cappa aspirante. Usare occhiali di sicurezza quando l'agitazione.

2. preparazione di particelle sub-mitocondriali

  1. Risospendere le vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate da Lisi ipotonica25 da 1 x 1011 a 2 x 1011 celle di prociclico T. brucei in 5 mL di tampone ghiacciata r. Keep il campione refrigerato fino al punto 3.2.
  2. Determinare la concentrazione di proteina nella sospensione di bicinconinico acido (BCA) proteine dosaggio26 secondo le istruzioni del produttore.
    1. Utilizzare una serie di diluizioni di albumina di siero bovino (BSA) in acqua ultrapura per costruire la curva standard. Diluire una piccola quantità di campione 20 - 100 volte con acqua ultrapura per adattarsi gli standard di gamma di BSA.
    2. Calcolare la quantità di proteine totali nel campione e portare la concentrazione nella proteina a 16 mg/mL diluendo con buffer aggiuntivo A.
  3. Frammento di mitoplasts in vescicole invertite e pezzi di membrana di sonicazione della sospensione 7 x per 15 s con un'energia totale di 70 a 100 J per impulso con un microtip con un diametro di 3,9 mm. Se l'omogeneizzatore ad ultrasuoni non Visualizza l'output di energia, avviare l'ottimizzazione al 50% della potenza massima. Incubare il campione in ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, la sospensione diventa leggermente più scura.
  4. Frammenti di sedimento la membrana dall'ultracentrifugazione a 54.000 x g per 16 h o a 98.000 x g per 5 ore a 4 ° C. Decantare il supernatante e procedere con l'estrazione di cloroformio, o flash-congelare il sedimento in azoto liquido e conservare a-80 ° C.

3. rilascio di F1-ATPasi dalla membrana di cloroformio

  1. Risospendere il pellet delle membrane mitocondriali nel buffer B con l'ausilio di un omogeneizzatore lisata piccolo. Calcolare il volume di tampone B basato sull'importo totale del buffer di un usato nella formula di punti 2.1 e 2.2, utilizzando il seguente: volume (tampone B) = volume (tampone A) x 12/21. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 o 50 mL.
  2. Rimuovere il campione dal ghiaccio e, da questo momento in poi, tenere il campione e tutte le soluzioni per essere utilizzato a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5; il volume di cloroformio da aggiungere è uguale a metà del volume della sospensione. Chiudere il tappo. Agitare vigorosamente per esattamente 20 s. e centrifugare immediatamente a 8.400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Trasferire la fase acquosa nuvolosa superiore a 1,6 mL microprovette. Aggiungere gli inibitori di proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A) per sostituire gli inibitori rimossi mediante il trattamento di cloroformio. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 30 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante per microprovette fresco e ripetere la centrifugazione per rimuovere qualsiasi materiale insolubile.

4. cromatografia di scambio anionico

  1. Equilibrare la colonna di scambio (Q) 5 mL anione collegata ad un sistema di cromatografia liquida fast-proteina con il buffer di Q-colonna ad un flusso di 5 mL/min fino a quando l'assorbanza a 280 nm e la conducibilità stabilizzare (circa 50 mL di tampone).
  2. Caricare il surnatante da passo 3.3 sulla colonna equilibrata ad un flusso di 1 mL/min aspettare fino a quando l'assorbanza a 280 nm si stabilizza a background. Applicare una sfumatura lineare di 25 mL di tampone di eluizione di Q-colonna da 0% a 100% a una portata di raccogliere frazioni di 1 mL 0,5 mL/min.
  3. Analisi di singole frazioni corrispondente al picco di eluizione principali per attività idrolitica di ATP dai Pullman ATPasi dosaggio2 pH 8.0. Utilizzare 10 µ l di ciascuna frazione per 1 mL di miscela di reazione. Piscina le frazioni che presentano l'attività dell'atpasi. Facoltativamente, separare 10 µ l di ciascuna frazione su elettroforesi di sodio dodecil fosfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e macchia il gel da Blue di Coomassie visualizzare singoli F1-subunità atpasi e proteine contaminanti.
  4. Concentrato il campione mediante ultrafiltrazione di membrana con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a 200-500 µ l. procedere al SEC o store il campione durante la notte a temperatura ambiente.

5. size exclusion Chromatography

  1. Equilibrare la colonna SEC collegata ad un sistema di cromatografia liquida con almeno 48 mL (due volumi di colonna) del buffer SEC ad una portata di 0,5 mL/min.
  2. Applicare il campione sulla colonna ed eseguire cromatografia ad una portata di 0,25 mL/min raccogliere 0.25 mL frazioni.
  3. Eseguire 10 µ l delle frazioni che corrispondono alle vette della traccia di assorbanza UV280nm su SDS-PAGE e li macchia di azzurro di Coomassie. Il primo picco principale contiene la F1-atpasi. Analisi delle frazioni corrispondenti a questo picco per la sensibilità di attività e azide idrolitica di ATP mediante il saggio dell'atpasi Pullman. Determinare la concentrazione di proteina dall'analisi di BCA.
  4. Mantenere la purificato F1-ATPasi a temperatura ambiente e utilizzarlo all'interno di 3 d dopo purificazione per applicazioni a valle. In alternativa, concentrare il campione con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a > 1,5 mg / mL, precipitato e mescolandolo con solfato di ammonio saturo regolata a pH 8.0 (1.2 x il volume) e conservare a 4 ° C.

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Representative Results

Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 1011 a 2 x 1011 prociclico di cellule di T. brucei 25 coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media27. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondriali sono trattate con cloroformio per rilasciare la F1-atpasi. Dopo la centrifugazione, la fase organica ed interfase precipitati vengono scartati. La fase acquosa è frazionata da cromatografia di scambio ionico su ammonio quaternario, uno scambiatore di anioni forti (Figura 2A). Le frazioni che corrispondono all'eluizione principale di picco e contenere la F1-ATPasi sono riuniti e concentrati. Questo materiale viene utilizzato come input per SEC, che elimina le impurità residue. I principali contaminanti sono diidrolipoil deidrogenasi, che eluisce dalla colonna SEC come un picco discreto, contrassegnato dalla barra verde scura nella Figura 2B. F1-ATPasi eluisce nel primo picco dominante, in gran parte simmetrico (Figura 2B).

L'avanzamento di purificazione è seguita dall'analisi della proteina BCA (o un altro comune analisi della proteina), SDS-PAGE e il monitoraggio dell'attività dell'atpasi. Il tasso di idrolisi dell'ATP è misurato dalla ATP Pullman rigenerante saggio2, basato sulla diminuzione dell'assorbanza del NADH nella reazione accoppiata. Azoturo di sodio, un inibitore stabilito di F1-atpasi, viene utilizzato ad una concentrazione di 2 mM per determinare la proporzione di F1-ATPasi-specifico idrolisi dell'ATP. In genere, il materiale in ingresso contiene all'incirca 150-300 mg di proteina mitocondriale, a seconda del numero di celle utilizzate come fonte di vescicole mitocondriale. La proporzione di azide-sensibile dell'attività dell'atpasi totale è di circa 30-40% in questa fase. Dopo l'estrazione di cloroformio, oltre il 90% di attività dell'atpasi nel campione è contribuito al F1-atpasi. Il purificato F1- atpasi è praticamente completamente sensibili al trattamento di azide (l'atpasi residua minima attività può essere attribuito all'autolisi sfondo ATP) e rappresenta circa 1% della massa proteica ingresso, con una resa approssimativa di 1 - 1,5 mg di F1-ATPasi a 1 x 1011 celle (tabella 1). Un modello tipico band dopo la separazione del purificato F1-ATPasi su gel di SDS-PAGE seguita da macchiatura blu di Coomassie sono illustrato nella Figura 2. Le proteine sono state identificate dalla massa del peptide fingerprinting e caratterizzata in particolare da vari approcci di spettrometria di massa23. Sporadici fasce deboli visibili sopra la banda di β-unità secondaria rappresentano subcomplexes di copricapo3α β3 (dimeri e oligomeri di subunità α e β) e sono privi di sostanze contaminanti rilevabili mediante tecniche di spettrometria di massa sensibile. La purificato F1-ATPasi possono essere conservato per diversi giorni nel buffer SEC a temperatura ambiente. In alternativa, la F1-ATPasi concentrato a ≥ 2 mg/mL possono essere precipitato da un uguale volume di solfato di ammonio saturo nel buffer SEC, con pH regolato a 8.0 e conservato a 4 ° C. Per almeno sei mesi dopo la precipitazione, l'enzima attivo senza evidente degrado di ogni subunità possa essere ottenuto con ridissoluzione del materiale precipitato nel buffer SEC o soluzione simile. Tuttavia, più di un mese di deposito non è adatto per cristallizzazione, come determinato empiricamente.

Figure 1
Figura 1 : Schema della procedura di purificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Purificazione in due fasi del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia liquida. (A) profilo di eluizione di cromatografia di scambio anionico (pannello superiore) e selezionate frazioni separate sul gel Tris-glicina SDS-PAGE 10-20% macchiato con colorante Coomassie Blue (pannello inferiore). Blu traccia: assorbanza UV a 280 nm; traccia rossa: concentrazione di NaCl nel buffer di eluizione; Ingresso: la F1-ATPasi rilasciato da cloroformio; FT: flusso continuo. (B) profilo di eluizione di SEC (pannello superiore) e selezionate frazioni separate sul gel SDS-PAGE macchiato con colorante Coomassie Blue (pannello inferiore). Ingresso: pool frazioni da cromatografia di scambio anionico contenenti F1-atpasi. Le barre di color-coded in pannelli A e B contrassegnano le frazioni nei profili eluizione che sono stati analizzati da SDS-PAGE e le corsie corrispondenti nel rispettivo gel. (C) identità delle singole proteine del isolato F1-ATPasi identificati mediante spettrometria di massa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione nella proteina (mg/mL) Proteine totali (mg) Percentuale di materiale in entrata (%) Attività
(ΜmolATP x mg-1 1x min-1)		 Sensibilità di azide (%)
Vescicole mitocondriale in tampone A 16,2 170 100 1.3 25-35
Membrane mitocondriali nel buffer B 18,6 97 57 2.4 35-45
Frazioni di cloroformio estratta 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F1-ATPasi dopo Q-colonna - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPasi dopo gel filtrazione - 1.6 0.93 48 93-98

Tabella 1: Un esempio del tipico progresso e del rendimento di F1-purificazione dell'atpasi dai mitocondri isolati da cellule di T. brucei di 1 x 1011 prociclici.

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Discussion

Il protocollo per F1-purificazione dell'atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l'isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla parte collegata alla membrana dell'enzima. In purificazioni da tutte le specie eucariotiche finora descritte, l'ossidrilasico rilasciato contenuto subunità α, β, γ, δ e ε in una stechiometria di 3:3:1:1:1. In T. brucei, F1-ATPasi contiene un tre copie aggiuntive della subunità p18, un romanzo componente limitato a euglenozoan protisti23. Inoltre, la subunità α euglenozoan proteoliticamente è diviso in due frammenti, sia stabilmente connesso con il complesso24,28,29. La subunità OSCP (proteina che conferisce oligomycin-sensibilità), che collega la F1-frazione alla periferica gambo30, è assente dal complesso rilasciato, che è d'accordo con F1-purificazioni dell'atpasi di cloroformio estrazione da altre specie13,14.

Il cloroformio-rilasciato F1-ATPasi viene ulteriormente purificato mediante cromatografia liquida. Nel caso la bovina F1-atpasi, passo solo una cromatografia, cromatografia di esclusione dimensionale, è sufficiente per ottenere un complesso altamente puro e attivo31. Tuttavia, il singolo piazzamento SEC era insufficiente per la purificazione di T. brucei F1-atpasi, come le frazioni arricchite per F1-ATPasi contenute contaminanti di altre proteine, principalmente delta-1-pyrroline-5-carbossilato deidrogenasi. Di conseguenza, cromatografia di scambio anionico è stato introdotto prima la SEC come il primo e importante passo purificante e la SEC serve come la successiva procedura di lucidatura. Per esperimenti di cristallizzazione, l'uso della colonna Superdex 200 aumentare è risultato per essere essenziale, poiché questa colonna fornita materiale che ha permesso la crescita di cristalli di buona qualità. È probabile che la risoluzione della colonna abilitata la separazione di una piccola percentuale dei complessi incomplete che interferivano con la cristallizzazione. Tuttavia, per applicazioni diverse dalla cristallizzazione, la separazione utilizzando la colonna di Superdex 200 è stato altrettanto soddisfacente.

Per proteggere la F1-ATPasi complesso da proteolisi parziale da sconosciuti protease(s) presente in mitocondriale lisato, i buffer iniziali A e B contenute una vasta gamma di inibitori della proteasi. L'impatto dei singoli inibitori sulla proteolisi di F1-subunità ATPasi non è stato testato e, molto probabilmente, la presenza di alcuni degli inibitori è ridondante. Per il passaggio di SEC, gli inibitori non vengono aggiunti piu ', come le proteasi contaminanti vengono rimossi dal F1-campione di ATPasi mediante l'estrazione di cloroformio o il primo passo di cromatografia.

Il protocollo multistep porta inevitabilmente a perdite parziali del F1-atpasi. La perdita più significativa (25% - 45% dell'importo totale) si verifica durante la fase di concentrazione mediante ultrafiltrazione a membrana su una colonna di selezione dopo la cromatografia di scambio anionico. F1-ATPasi probabile aderisce alla membrana della colonna spin. Così, per alcune applicazioni a valle che non richiedono un altamente puro e concentrato campione (ad es., saggi enzimatici e schermi inibitori), la F1-ATPasi possono essere utilizzato immediatamente dopo la cromatografia di scambio anionico (Vedi figura 2B, corsia di ingresso).

Sebbene la purificazione di F1-atpasi da organismi differenti variano in dettaglio, il flusso di lavoro generale rimane lo stesso. Pertanto, il presente protocollo può servire come linea guida per lo sviluppo del F1-protocollo di isolamento dell'atpasi di altre fonti abbondanti, come tessuti o cellule coltivabili su larga scala.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica numero 143 F1-atpasi Trypanosoma brucei mitocondriale ATP sintasi F-tipo atpasi cloroformio l'estrazione cromatografia liquida
Isolamento di F<sub>1</sub>-ATPasi dal Protista parassita <em>Trypanosoma brucei</em>
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Gahura, O., Zíková, A.… More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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