Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolering av F-1-ATPase fra den parasittiske Protist Trypanosoma brucei

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58334
Automatic Translation
1, 1,2
1Biology Centre, Czech Academy of Science, Institute of Parasitology, 2Faculty of Science, University of South Bohemia

Summary

Denne protokollen beskriver rensing av F-1-ATPase kulturperler insekt scenen Trypanosoma brucei. Prosedyren gir en svært ren, homogen og aktive kompleks egnet for strukturelle og enzymatiske studier.

Abstract

F-1-ATPase er en membran-ytre katalytiske subcomplex av F-type ATP syntase, et enzym som bruker proton motiv kraft over biologiske membraner for å produsere adenosin trifosfat (ATP). Isolasjon av intakt F1-ATPase fra opprinnelige kilden er en viktig forutsetning som karakteriserer enzymets protein komposisjon, kinetisk parametere og følsomhet for hemmere. En svært ren og homogen F-1-ATPase kan brukes til strukturell studier som gir innsikt i molekylære mekanismer av ATP syntese og hydrolyse. Denne artikkelen beskriver en fremgangsmåte for rensing av F-1-ATPase fra Trypanosoma brucei, den utløsende agenten for afrikanske trypanosomiases. F-1-ATPase er isolert fra Mitokondrielt blemmer, som er fremstilt ved hypotonisk lysis fra i vitro kultivert trypanosomes. Blemmer er mekanisk fragmentert av sonication og F1-ATPase frigjøres fra indre mitokondrie membranen av kloroform utvinning. Enzymatisk komplekset er ytterligere renset ved påfølgende anion utveksling og størrelse-utestenging kromatografi. Følsom massespektrometri teknikker viste at renset komplekset er blottet for nesten alle protein forurensninger og representerer derfor egnet materiale for proteinstrukturer Røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskop. Den isolerte F-1-ATPase viser ATP hydrolytisk aktivitet, som kan bli hemmet fullt av Natriumazid, en potent inhibitor av F-type ATP synthases. Den rensede komplekset forblir stabil og aktiv i minst tre dager ved romtemperatur. Nedbør av ammonium sulfate brukes for langtidslagring. Lignende fremgangsmåter som har blitt brukt for rensing av F-1- ATPases fra pattedyr og plante vev, gjær eller bakterier. Dermed presentert protokollen kan tjene som en retningslinje for F1-ATPase isolert fra andre organismer.

Introduction

F-type ATP-synthases er membran-bundet roterende multiprotein komplekser som par proton translokasjon over energi-transducing membraner av bakterier og mitokondrier chloroplasts med dannelsen av ATP. Molekylær detaljer om roterende mekanisme ATP syntese er kjent hovedsakelig på grunn av strukturelle studier av renset bakteriell og mitokondrie ATP synthases og deres subcomplexes1. F-type ATP syntase er organisert i membran-egenverdi og membran-ytre moieties. Den membran-ytre delen, kjent som F-1-ATPase, inneholder tre katalytisk områder, der fosforylering av adenosindifosfat (ADP) ATP eller omvendt reaksjonen oppstår. F-1-ATPase kan frigis eksperimentelt fra membran-innebygde moiety samtidig som du beholder sin evne til å hydrolyze, men ikke syntetisere, ATP. Membran-bundet sektoren, kalt Fo, formidler protein translokasjon, som driver rotasjon av den sentrale delen av enzymet. Den F1 og Fo sektorer er forbundet med de sentrale og perifere stilkene.

Første forsøk på å rense F-1-ATPase fra spirende gjær og storfe hjertet mitokondrier dato tilbake til 1960. Disse protokollene brukes utdraget mitochondria, som ble forstyrret av sonication, fraksjonert av ammonium eller protamine sulfate nedbør, etterfulgt av valgfrie kromatografi trinn og varmebehandling2,3,4 ,5,6. Rensing var sterkt forbedret og forenklet ved bruk av kloroform, som lett utgivelser F-1-ATPase fra Mitokondrielt Membranen fragmenter7. Kloroform utvinning ble brukt til å trekke ut F1- ATPases fra forskjellige dyr, plante og bakteriell kilder (f.eks, rotte lever8, korn9, Arum maculatum10og Escherichia coli 11). Videre rensing av kloroform utgitt F1-ATPase ved affinity eller størrelse-utestenging kromatografi (SEC) gitt en svært ren protein kompleks som var egnet for høy oppløsning proteinstrukturer av Røntgenkrystallografi, som dokumentert av strukturer av F-1-ATPase fra storfe hjertet12,13 og Saccharomyces cerevisiae14. F-1-ATPase strukturer ble også bestemmes av organismer som er vanskelig å dyrke og dermed hvor mye det første biologisk materialet var begrenset. I dette tilfellet, F-1-ATPase underenheter var kunstig uttrykt og samlet inn i komplekset i E. coliog hele heterologous enzymet ble renset ved affinitet kromatografi via en merket delenhet. Slik tilnærming førte til fastsettelse av F-1-ATPase strukturer fra to varmekjære bakterie-art, Geobacillus stearothermophilus15 og Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denne metoden er imidlertid ganske uegnet for eukaryote F-1- ATPases siden den er avhengig av prokaryote protheosynthetic apparater, posttranslational behandling og komplekse samlingen.

Kloroform-baserte utvinning ble tidligere brukt til å isolere F1- ATPases fra encellede digenetic parasitter Trypanosoma cruzi18 og T. brucei19, viktig pattedyr patogener forårsaker amerikanske og Afrikansk trypanosomiases, henholdsvis, og fra monogenic insekt parasitten Crithidia fasciculata20. Disse rene førte bare til en enkel beskrivelse av F-1- ATPases, siden ingen nedstrøms programmer ble brukt for fullt karakterisere komposisjon, strukturen og enzymatiske egenskaper av komplekset. Denne artikkelen beskriver en optimalisert metode for F-1-ATPase rensing fra kulturperler insekt livssyklus scenen av T. brucei. Metoden er utviklet basert på etablerte protokoller for isolering av storfe og gjær F1- ATPases21,22. Prosedyren gir svært rent og homogen enzym egnet for i vitro enzymatisk og inhibitory analyser, detaljert proteomic karakteristikk av massespektrometri23og struktur besluttsomhet24. Protokollen for rensing og kunnskap om F-1-ATPase strukturen på Atom-nivå åpnes mulighet til å utforme skjermer å identifisere små molekyl hemmere, og hjelpe til utvikling av nye legemidler mot afrikanske trypanosomiases. Videre protokollen kan tilpasses å rense F1-ATPase fra andre organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. buffere og løsninger

  1. Forberede løsningene nedenfor. Degas alle buffere for flytende kromatografi. Legge til ADP, benzamidine og protease hemmere like før bruk.
    1. Forberede buffer A: 50 mM Tris buffer med saltsyre (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M sukrose, 5 mM benzamidine, 5 mM aminocaproic syre (ACA) og protease hemmere (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).
    2. Forberede buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M sukrose, 4 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 5 mM benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP, og proteasehemmere (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).
    3. Forberede Q-kolonne buffer: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM benzamidine, 5 mM ACA og 1 mM ADP.
    4. Forberede Q-kolonne elueringsbufferen: Q-kolonne buffer med 1 M NaCl.
    5. Forberede SEC buffer: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Forberede kloroform mettet med 2 M Tris-HCl pH 8.5. Bland kloroform med 2 M Tris-HCl pH 8.5 i ca 1:1 ratio i en skrue-cap flaske, riste, la organisk og vandig fasene separat og måle pH vandig topplaget med en papirstrimmel pH-indikator. Lagre ved romtemperatur. Like før bruk, rister igjen og la fasene separat. Bruke lavere kloroform laget.
      FORSIKTIG: Kloroform er flyktig og irriterende for øyne og hud. Arbeid i avtrekksvifte. Bruk sikkerhet briller når risting.

2. forberedelse av sub-Mitokondrielt partikler

  1. Resuspend mitokondrie blemmer (mitoplasts) isolert av hypotonisk lyse25 fra 1 x 1011 -2 x 1011 cellene i procyclic T. brucei i 5 mL iskald bufferen A. holde prøven kjølt til trinn 3.2.
  2. Bestemme protein konsentrasjonen i suspensjon av bicinchoninic acid (BCA) protein analysen26 i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Bruke en storfe serum albumin (BSA) fortynning serie i ultrapure vann for å konstruere standardkurven. Fortynne en liten mengde prøve 20 - 100 ganger med ultrapure vann å passe inn i området av BSA standarder.
    2. Beregne totale protein beløpet i utvalget og bringe protein konsentrasjonen til 16 mg/mL fortynne den med ekstra buffer A.
  3. Fragment mitoplasts invertert blemmer og membran stykker av sonication av suspensjon 7 x 15 s med en total energi på 70 til 100 J per impuls med en microtip med en diameter på 3,9 mm. Hvis den ultrasoniske homogenizer ikke vises i energiforbruk, start optimalisering på 50% av maksimal kraft. Inkuber prøven på is 30 s mellom impulser. Etter sonication blir suspensjon litt mørkere.
  4. Sediment Membranen fragmenter av ultracentrifugation 54.000 x g 16 h eller 98 000 x g 5 h på 4 ° C. Dekanter nedbryting og fortsette med kloroform utvinning, eller flash-fryse sediment i flytende nitrogen og lagre det på-80 ° C.

3. utgivelsen av F-1-ATPase fra membran av kloroform

  1. Resuspend pellets av mitokondrie membraner i buffer B ved hjelp av en liten Dounce homogenizer. Beregne volumet av buffer B basert på den totale mengden buffer en brukt i trinn 2.1 og 2.2 ved hjelp av følgende formel: volum (buffer B) = volum (buffer A) x 12/21. Overføre suspensjon slik konisk 15 eller 50 mL.
  2. Fjerne prøven fra isen, og nå holde prøven og alle løsninger som skal brukes ved romtemperatur.
  3. Legge til kloroform mettet med 2 M Tris-HCl pH 8.5; volumet av kloroform legges tilsvarer halve volumet av suspensjon. Lukk lokket tett. Rist den kraftig for nøyaktig 20 s. sentrifuge det umiddelbart 8 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Overføre den øvre skyet vandige fasen til 1.6-mL microtubes. Legg proteasehemmere (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A) for å erstatte det hemmere fjernet av kloroform behandling. Sentrifuge prøvene 13.000 x g i 30 min ved romtemperatur. Overføre nedbryting til frisk microtubes gjenta sentrifugering å fjerne uløselig materiale.

4. anion exchange kromatografi

  1. Equilibrate 5-mL anion exchange (Q) kolonnen knyttet til en rask-protein flytende kromatografi system med Q-kolonne bufferen på en flow rate på 5 mL/min til absorbansen på 280 nm og ledningsevne stabilisere (ca 50 mL av buffer).
  2. Last nedbryting fra trinn 3.3 equilibrated kolonnen på en strømningshastighet på 1 mL/min. vente til absorbansen ved 280 nm stabiliserer på bakgrunnen. Bruke en 25-mL lineær gradient Q-kolonnen elueringsbufferen fra 0% til 100% på en strømningshastighet på 0,5 mL/min. samle 1-mL fraksjoner.
  3. Analysen personlige fraksjoner tilsvarer store elueringsrør toppen ATP hydrolytisk aktivitet av Pullman ATPase analysen2 ved pH 8.0. Bruk 10 µL av hver fraksjon per 1 mL av reaksjonsblandingen. Basseng fraksjoner som viser ATPase aktivitet. Eventuelt skille 10 µL av hver fraksjon på natrium dodecyl fosfat polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) og flekken gel Coomassie Blue visualisere personlige F-1-ATPase underenheter og skadelige proteiner.
  4. Konsentrat gruppert utvalget av membran ultrafiltrasjon bruker en spin-kolonne med en 100.000 MWCO PES filter til 200-500 µL. videre til SEC eller store utvalget over natten i romtemperatur.

5. størrelse-utestenging kromatografi

  1. Equilibrate kolonnen SEC knyttet til en flytende kromatografi system med minst 48 mL (to kolonnen volumer) av SEC bufferen på en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
  2. Bruke fargeprøven på kolonnen og kjøre Ture på en strømningshastighet på 0,25 mL/min. samle 0,25-mL fraksjoner.
  3. Kjør 10 µL av fraksjoner som tilsvarer toppene av UV280nm absorbans spor på SDS-side og stain dem Coomassie Blue. Den første store toppen inneholder F-1-ATPase. Analysen fraksjoner tilsvarer denne toppen for ATP hydrolytisk aktivitet og azide sensitiviteten av Pullman ATPase analysen. Bestemme protein konsentrasjonen av BCA analysen.
  4. Holde det rensede F-1-ATPase ved romtemperatur og bruke det innenfor 3 d etter rensing for nedstrøms programmer. Alternativt konsentrere prøven med en spin-kolonne med et 100.000 MWCO PES filter > 1.5 mg / mL, bunnfall det ved å blande den med mettet ammonium sulfate justert til pH 8.0 (1.2 x volumet), og lagre den på 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En typisk rensing (figur 1) starter med mitokondrie blemmer (mitoplasts) isolert på Percoll gradient fra hypotonically lysed 1 x 1011 til 2 x 1011 procyclic T. brucei celler25 kultivert i standard glukose-rik SDM-79 middels27. Mitoplasts er fragmentert av sonication, spunnet, og matrise inneholder nedbryting forkastes. Mitokondrielt membraner behandles med kloroform å slippe F-1-ATPase. Etter sentrifugering, er organisk fase og utfelt interphase forkastet. Den vandige fasen er fraksjonert av ion-exchange Ture på kvartær ammonium, en sterk anion exchanger (figur 2A). Fraksjoner som tilsvarer store tilsettes topp og inneholder F-1-ATPase er samlet og konsentrert. Dette materialet fungerer som inndataene for SEC, som eliminerer gjenværende urenheter. Store miljøgifter er dihydrolipoyl dehydrogenase, som elutes fra kolonnen SEC som en diskret topp, preget av den mørke grønne linjen i figur 2B. F-1-ATPase elutes i den første dominerende, hovedsakelig symmetrisk toppen (figur 2B).

Fremdriften av rensing etterfølges av BCA protein analysen (eller en annen vanlig protein analysen), SDS-siden, og overvåking av ATPase aktivitet. ATP hydrolyse målt ved Pullman ATP regenererende analysen2, basert på reduksjon av absorbansen av NADH i kombinert reaksjonen. Natriumazid, en etablert inhibitor av F-1-ATPase, brukes i en 2 mM konsentrasjon til å anslå andelen av F-1-ATPase-spesifikke ATP hydrolyse. Vanligvis inneholder input materialet omtrent 150-300 mg mitokondrie protein, hvor mange celler som brukes som kilde til mitokondrie blemmer. Azide-sensitive andelen av den totale ATPase aktiviteten er rundt 30% til 40% på dette stadiet. Etter at kloroform utvinning, mer enn 90% av ATPase aktivitet i utvalget er bidratt av F-1-ATPase. Den rensede F-1- ATPase er nesten helt følsom for azide behandling (den minimale gjenværende ATPase aktivitet kan tilskrives bakgrunn ATP autolyse) og representerer rundt 1% av input protein, med en forventet avkastning på 1 - 1.5 mg av F-1-ATPase per 1 x 1011 celler (tabell 1). Et typisk bandet mønster etter separasjonen av renset F1-ATPase på SDS side gel etterfulgt av Coomassie blå flekker er vist i figur 2C. Proteiner ble identifisert av peptid masse fingeravtrykk og preget i detalj av ulike massespektrometri tilnærminger23. Sporadiske svak band synlig over β-delenhet bandet representerer subcomplexes av α3β3 headpiece (dimers og oligomers av α - og β-underenheter) og er blottet for eventuelle forurensninger detectable av sensitive massespektrometri teknikker. Den rensede F-1-ATPase kan lagres i opptil flere dager i SEC bufferen ved romtemperatur. Alternativt, F-1-ATPase konsentrert til ≥2 mg/mL kan være påskyndet av en lik mengde mettet ammonium sulfate i SEC buffer, med pH tilpasset 8.0, og lagret på 4 ° C. I minst seks måneder etter nedbør, kan aktive enzymet med ingen åpenbare nedbrytning av noen delenhet fås ved redissolving utfelt materialet i SEC buffer eller lignende løsning. Imidlertid er lagring lengere enn en måned ikke egnet for krystallisering, som bestemmes empirisk.

Figure 1
Figur 1 : Av den rensing prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Totrinns rensing av kloroform utgitt F1-ATPase av flytende kromatografi. (A) elueringsrør profil av anion exchange kromatografi (øvre panel) og valgte fraksjoner atskilt på 10% - 20% Tris-glycine SDS side gel med Coomassie blått fargestoff (nedre panel). Blå spor: UV absorbans ved 280 nm; rød spor: konsentrasjonen av NaCl i elueringsbufferen; Styremekanismer: F1-ATPase utgitt av kloroform; FT: gjennomflytsenhet. (B) elueringsrør profil av SEC (øvre panel) og valgte fraksjoner atskilt på SDS side gel med Coomassie blått fargestoff (nedre panel). Styremekanismer: samlet fraksjoner anion exchange kromatografi inneholder F1-ATPase. De fargekodede søyler i paneler A og B merke fraksjoner i elueringsrørets profiler som ble analysert av SDS side og de tilhørende banene i respektive gel. (C) identiteten til personlige proteiner av isolerte F1-ATPase som er identifisert av massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protein konsentrasjon (mg/mL) Totalt protein (mg) Andelen input materiale (%) Aktivitet
(ΜmolATP x mg-1 x min-1)		 Azide følsomhet (%)
Mitokondrielt blemmer i buffer A 16.2 170 100 1.3 25-35
Mitokondrielt membraner i buffer B 18.6 97 57 2.4 35-45
Kloroform utdraget brøker 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F-1-ATPase etter Q-kolonne - 2.2 1.3 23 92-96
F-1-ATPase etter gel filtrering - 1.6 0.93 48 93-98

Tabell 1: Et eksempel på typiske fremdrift og ytelse av F-1-ATPase rensing fra mitokondrier isolert fra 1 x 1011 procyclic T. brucei celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen for F-1-ATPase rensing fra T. brucei ble utviklet basert på tidligere publiserte metoder for isolering av F-1-ATPase komplekser fra andre arter13,14. Metoden krever ikke noen genmodifisering (f.eksmerking) og gir et fullt aktive kompleks med alle underenheter stede. Det avgjørende skrittet er kloroform-tilrettelagt utgivelsen av F-1-ATPase fra membran-vedlagt del av enzymet. I rene fra alle eukaryotic arter beskrevet så langt, den utgitt subcomplex inneholdt underenheter α, β, γ, ses og ε i en støkiometri av 3:3:1:1:1. I T. brucei, F-1-ATPase inneholder en ytterligere tre kopier av delenhet p18, en ny komponent begrenset til euglenozoan protister23. Euglenozoan α-delenhet deles videre proteolytically i to fragmenter, både stabilt forbundet med komplekse24,28,29. Delenhet OSCP (oligomycin-følsomhet-overdragelse protein), som forbinder F-1-moiety til eksterne stilken30, er fraværende fra utgitt komplekset, som er i samsvar med F-1-ATPase renselser av kloroform utvinning fra andre arter13,14.

Den kloroform utgitt F-1-ATPase er videre renset ved flytende kromatografi. Ved den bovine F-1-ATPase, eneste kromatografi trinn, størrelse-utestenging Ture, nok for å få en svært ren og aktive komplekse31. Men enkelt SEC oppsettet var utilstrekkelig for rensing av T. brucei F1-ATPase, som fraksjoner beriket for F-1-ATPase finnes ekstra protein forurensning, hovedsakelig delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase. Derfor anion exchange kromatografi ble introdusert før SEC som det første og viktigste rensing skrittet og SEC serverer som etterfølgende polering. For krystallisering eksperimenter, bruk av kolonnen Superdex 200 øke viste seg for å være viktig, siden denne kolonnen gitt materiale som tillot økende crystals av god kvalitet. Det er sannsynlig at oppløsningen for kolonnen aktivert separasjon av en liten andel av ufullstendig komplekser som forstyrret krystallisering. Men for andre programmer enn krystallisering var separasjon med kolonnen Superdex 200 like tilfredsstillende.

Å beskytte F-1-ATPase komplekse fra delvis proteolyse av ukjent protease(s) i den mitokondrie lysate, første bufferne A og B finnes en rekke proteasehemmere. Virkningen av personlige hemmere på proteolyse av F-1-ATPase underenheter har ikke blitt testet og, mest sannsynlig tilstedeværelsen av noen av hemmere er overflødig. For SEC trinn, hemmere legges ikke lenger, så forurensende proteaser fjernes fra F-1-ATPase eksempel kloroform utvinning eller kromatografi steg.

Må protokollen uunngåelig fører til delvis tap av F-1-ATPase. Mest betydelige tap (25% - 45% av totalbeløpet) oppstår under den konsentrasjon trinnvise membran ultrafiltrasjon i en spinn kolonne etter anion exchange kromatografi. F-1-ATPase sannsynlig overholder membran av kolonnen spinn. Derfor, for noen nedstrøms programmer som ikke krever en meget ren og konsentrert utvalg (f.eksenzymatisk analyser og hemmende skjermer), F-1-ATPase kan brukes umiddelbart etter anion exchange kromatografi (se figur 2b, Input lane).

Selv om rensing av F-1-ATPase fra ulike organismer varierer i detalj, den generelle arbeidsflyten forblir den samme. Derfor denne protokollen kan fungere som en retningslinje for utvikling av F-1-ATPase isolasjon protokollen rikelig databaser vev eller celler cultivatable i stor skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av departementet for utdanning ERC CZ gi LL1205, Grant Agency of Tsjekkia stipendet 18-17529S, og av ERDF/ESF prosjekt senter for forskning av virusets og virulens av parasitter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. , The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).

Tags

Biokjemi problemet 143 F1-ATPase Trypanosoma brucei mitokondrie ATP syntase F-type ATPase kloroform utvinning flytende kromatografi
Isolering av F-<sub>1</sub>-ATPase fra den parasittiske Protist <em>Trypanosoma brucei</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A.… More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter