Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

يتم وصف أسلوب التصوير القائم التي يمكن استخدامها لتحديد المرحلة S وتحليل ديناميات دورة الخلية في germline خنثي C. ايليجانس استخدام thymidine في إيدو التناظرية. هذا الأسلوب يتطلب لا المتسلسلات ومتوافق مع صبغة إيمونوفلوريسسينت.

Abstract

وكثيراً ما يستخدم تحليل دورة الخلية في حقيقيات النوى مورفولوجيا كروموسوم والتعبير و/أو الترجمة من منتجات الجينات المطلوبة لمختلف مراحل دورة الخلية، أو الإدماج من النظير نوكليوزيد. خلال المرحلة S، دمج بولمرس الحمض النووي النظير thymidine مثل إيدو أو بردو الصبغية الحمض النووي، وتمييز الخلايا لتحليلها. C. ايليجانس، نوكليوزيد إيدو التناظرية يتغذى على الديدان خلال الثقافة العادية ومتوافق مع تقنيات إيمونوفلوريسسينت. الفعل من C. ايليجانس نظام نموذج قوي للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية لأنها شفافة وسهلة وراثيا، وهو الطور الأول والتمايز الخلوي/الجاميطات التي تحدث في خطي الجمعية مثل الأزياء. هذه الميزات تجعل إيدو أداة عظيمة لدراسة الجوانب الحيوية للخلايا ركوب ميتوتيكالي والتنمية germline. هذا البروتوكول توضح كيفية إعداد البكتيريا إيدو بنجاح، وإطعامهم إلى البرية من نوع C. ايليجانس المنحرفين، تشريح الغدد التناسلية خنثي، ووصمة عار لإدماج إيدو في الحمض النووي، وصمة عار مع الأجسام المضادة للكشف عن مختلف دورة الخلية و صورة الغدد التناسلية علامات التنموية، وتحليل النتائج. البروتوكول توضح الاختلافات في الأسلوب والتحليل لقياس S-المرحلة مؤشر م-المرحلة الفهرس G2 المدة، مدة دورة الخلية، ومعدل الدخول هو، ومعدل تطور الطور الأول هو. هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع دراسة دورة الخلية أو التاريخ الخلية في الأنسجة ومراحل والخلفيات الوراثية والظروف الفسيولوجية الأخرى.

Introduction

في مجال التنمية الحيوانية، ملزمون بمئات الآلاف، والملايين، المليارات أو حتى تريليونات من انقسامات الخلية شكل الكائن الحي الكبار. دورة الخلية، تتكون مجموعة الأحداث الخلوية من G1 (الفجوة)، S (توليف)، G2 (الفجوة)، وتعريف M (الانقسام) السلسلة من الأحداث التي يتم تنفيذها كل انقسام الخلية. دورة الخلية من دينامية وتقدير أفضل في الوقت الحقيقي، الذي يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية. تسمح التقنيات المعروضة في هذا البروتوكول بإجراء قياسات المراحل وتوقيت دورة الخلية من الصور لا تزال.

وضع العلامات مع النظير نوكليوزيد مثل 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-برومو-2'--ديوكسيوريديني (بردو) هو معيار الذهب لتحديد مرحلة ثانية في الدراسات المتعلقة بديناميات دورة الخلية في الكبار ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) خنثي germline1،2،3،،من45. إيدو وبردو يمكن استخدامها في أي ما يقرب من الخلفية الوراثية، كما أنها لا تعتمد على أي التركيب الوراثي. تصور بردو يتطلب المعالجة الكيميائية قاسية للكشف عن المستضد لجسم بردو مكافحة تلطيخ، الذي غالباً ما يكون غير متوافق مع تقييم علامات خلوية أخرى تصور تلطيخ يشترك مع الأجسام المضادة إضافية. على النقيض من ذلك، تصور إيدو يحدث عن طريق الكيمياء فوق تحت ظروف معتدلة وهكذا متوافق مع جسم تلطيخ شارك6،7.

خصوصية التسمية من الواضح منذ فقط دمج نويات النظير (5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني) thymidine في الحمض النووي خلال المرحلة S. التصور يأخذ مكان في الأنسجة الثابتة. التسمية إيدو غير مرئي بنفسها حتى صبغة المحتوية على أزيد أو fluorophore يتفاعل تساهمي مع ألكاين في إيدو التي حفزت النحاس فوق الكيمياء8. وسم إيدو يمكن توفير المعلومات الفورية التي نواة في المرحلة S، استخدام نبضة قصيرة من وضع العلامات. إيدو يمكن أيضا تقديم معلومات حيوية، استخدام نبض--تشيس أو وسم المستمر؛ على سبيل المثال، في تجربة نبض--تشيس، التسمية هو المخفف في كل انقسام الخلية أو نشر نونديفيدينج كما تقدم الخلايا عن طريق التنمية.

Germline خنثي C. ايليجانس نظام نموذجي قوية للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية. Germline الكبار خط تجميع استقطاب مع الخلايا الجذعية التي وجدت في نهاية القاصي متبوعاً بالدخول والتقدم من خلال هو الطور الأول، بالتنسيق مع مراحل للجاميطات أكثر بروكسيمالي (الشكل 1). في نهاية الدانية، بويضات ناضجة وهي أوفولاتيد والمخصبة وتبدأ امبريوجينيسيس في الرحم9،،من1011. تسمى منطقة طويلة ~ 20 الخلية قطرها قرب الخلية الحافة البعيدة، التي تشمل الجذعية germline ركوب ميتوتيكالي، وخلايا السلف وهو S-مرحلة الخلايا لكن لا الخلايا في الطور الأول هو،2،منطقة السلف4 , 9 , 12-توفير أغشية الخلية فصل غير كامل بين الأنوية في germline القاصي، ولكن الخلايا منطقة السلف الخضوع للخلية الانقسامية ركوب الدراجات بشكل مستقل إلى حد كبير. مدة دورة الخلية الانقسامية متوسط الخلايا منطقة السلف germline في الشباب المنحرفين الكبار ح ~6.5؛ المرحلة G1 مختصر أو غائبا، ولا يحترم التتابع1،2،13. يحدث من خلال التمايز المباشر أساسا تمايز الخلايا الجذعية Germline ومما يفتقر إلى تضخيم عبور الشعب4. خلال التمايز في مرحلة باتشيتيني، حوالي 4 من أصل 5 نويات لن يشكل بويضات لكن بدلاً من الخضوع للمبرمج، بوصفها ممرضة الخلايا عن طريق التبرع بمحتوياتها هيولى إلى12،البويضات النامية14 , 15.

بالإضافة إلى وضع العلامات من الخلايا في مرحلة ثانية مع النظير نوكليوزيد، واحد تحدد الخلايا في الانقسام والانقسام الاختزالي استخدام تلطيخ جسم. نوى في الانقسام يتم إيمونوريكتيفي لمكافحة--والرمات--هيستون H3 (Ser10) جسم (تسمى pH3)7،16. نوى في الانقسام الاختزالي إيمونوريكتيفي إلى جسم المناهضة له-3 (بروتين كروموسوم هو محور)17. يمكن التعرف على النوى في منطقة السلف بغياب سموه-3، ووجود نوكليوبلاسميك REC-818، أو وجود وابل-119. كثافة وابل-1 أعلى في الغدد التناسلية الجسدية، عالية في المنطقة، والسلف ومنخفضة خلال وقت مبكر بروفاسيس هو19. عدة دورة الخلية القياسات الممكنة مع عدد قليل من الاختلافات في البروتوكول: أنا) تحديد الأنوية في مرحلة ثانية، وقياس مؤشر S-المرحلة؛ ثانيا) تحديد الأنوية في مرحلة م وقياس مؤشر المرحلة م؛ ثالثا) تحديد ما إذا كانت نواة الانقسامية أو هو S-المرحلة؛ رابعا) قياس مدة G2؛ V) قياس دوارتيون G2 + M + G1 المراحل؛ سادسا) قياس معدل دخول هو؛ سابعا) تقدير معدل التقدم هو.

يمكن للمرء أن قياسات دورة الخلية متعددة من أنواع قليلة من تجارب مختبر الرطب. البروتوكول أدناه وصف نبض 30 دقيقة وسم بتغذية C. ايليجانس الكبار المنحرفين مع إيدو المسماة البكتيريا وشارك التوسيم م-مرحلة الخلايا تلطيخ الخلايا المنطقة مع الأجسام المضادة-pH3، والسلف تلطيخ مع الأجسام المضادة-وابل-1. التغييرات فقط في فترة إيدو آر (الخطوة 2، 5)، نوع من الأجسام المضادة المستخدمة (الخطوة 5)، وتحليلات (الخطوة 8.3) المطلوبة للقياسات الإضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد البكتيريا المسماة إيدو

  1. تنمو ثقافة كاتب MG1693. الإشريكيّة القولونية MG1693 (كولاي) يحمل طفرة في ثيا.
    1. الانتصارات خارج MG1693 كولاي من مخزون والغليسيرول مجمدة على أجار مرق (رطل) ليسوجيني 120 مم طبق بيتري. الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. تلقيح من كل اثنين كولاي MG1693 المستعمرات إلى قسمين مكرر 4 أنابيب مل من سائل "الثقافة رطل" في 37 درجة مئوية ح ~ 16.
      ملاحظة: MG1693 ينمو غرامة في رطل دون المكمل مع الثايمين أو thymidine.
  2. تنمو MG1693 كولاي في الحد الأدنى من وسائل الإعلام تستكمل مع إيدو.
    1. اﻷوتوكﻻف قارورة مخروطية 500 مل.
    2. استخدام أسلوب تعقيم لإضافة 5 مل جلوكوز 20 ٪، 50 ميكروليتر من 10 ملغ/مل ثيامين، 120 ميكروليتر من thymidine 5 مم، 100 ميكروليتر من 1 م MgSO4، 200 ميكروليتر من 10 ملم إيدو و 100 مل من المخزن المؤقت M9 4 مل الطازجة نمت الثقافة MG1693 بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: تركيز إيدو النهائي 20 ميكرومتر في هذه الثقافة1،7. هذا التركيز يؤدي إلى الحمض النووي الضرر ودورة الخلية اعتقال إذا كان تطبيقها مباشرة على خلايا الثدييات في الثقافة20. ومع ذلك، هو إدماج سوى جزء صغير من هذا إيدو في كولاي والمتاحة وبالتالي إلى C. ايليجانس. هناك أي دليل على دورة الخلية اعتقال وأي تغيير في حجم المنطقة السلف أو فهرس م-المرحلة بعد إيدو معاملة المنحرفين البالغين الشباب.
    3. الثقافة بين عشية وضحاها، ولكن لا تزيد عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
  3. تركز المسمى إيدو كولاي وتنطبق على أطباق بيتري أجار M9.
    1. قبل بارد الطرد مركزي منضدية إلى 4 درجات مئوية.
    2. استخدام أسلوب تعقيم لنقل الثقافة إلى 2 – 4 العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية الشكل.
    3. الطرد المركزي في الثقافات في 3,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بيليه المسمى إيدو كولاي.
      ملاحظة: التخلص من المادة طافية المحتوية على إيدو وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والمؤسسية.
    4. ريسوسبيند الكريات مع 4 مل M9 الطازجة. استخدام تلميح بيبيت عقيمة 1 مل أو بيبيت مصلية مل 5 عقيمة. ريسوسبيندينج الكريات قد يستغرق عدة دقائق.
    5. استخدم بيبيت نفسه لتطبيق ونشر ~ 8 قطرات من حراكه المسمى إيدو كولاي MG1693 إلى وسط درجة حرارة الغرفة 60 ملم و M9 أجار بيتري الأطباق. تعطي دفعة واحدة الأطباق ~ 16.
    6. تسمح الأطباق الجاف لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم ختم كل طبق مع قطاع من الفيلم المختبر. ويمكن تخزين الأطباق على 15 درجة مئوية لمدة أسابيع ~ 2 وعلى 4 درجة مئوية لمدة أشهر ~ 2. استخدام نفس الدفعة من الأطباق إيدو لكل مجموعة من التجارب.

2-تغذية إيدو إلى C. ايليجانس

  1. مزامنة السكان بالعلاج تحت كلوريت العلمانيين، والقلوية البيض توقيت متبوعاً الفقس إلى S-المتوسطة مع نسبة الكولسترول في الدم، أو باختيار المرحلة المناسبة21. تنمو الحيوانات إلى المرحلة المرجوة (هنا، ح 24 وظيفة-L4) على "متوسط نمو ديدان أسطوانية" المصنف مع OP50 كولاي في 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: إعداد الحيوانات 50 – 100 كل تجربة، بعض قد لا تشريح أيضا، وآخرين سيتم فقدان عملية الغسيل ونقل.
  2. تسمح الأطباق إيدو الحارة إلى 20 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المطلوبة للتجربة).
  3. غسل الحيوانات من أطباق NGM استخدام M9 أو مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) في أنبوب 1.5 مل. السماح للحيوانات بتسوية بإيجاز بالجاذبية أو تدور موجزة في ميكروسينتريفوجي.
  4. إزالة المادة طافية وغسل الحيوانات 1-2 مرات مع ~ 1 مل من M9 أو برنامج تلفزيوني. إزالة المادة طافية.
  5. استخدام زجاج ماصة باستور لنقل الحيوانات في قطره صغيرة من M9 أو برنامج تلفزيوني في وسط العشب إيدو. انتظر لبضع دقائق للسائل لاستيعابه، ثم احتضانها في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (لقياس S-المرحلة مباشر) أو أكثر (لقياس التاريخ المرحلة S)، حسب الحاجة.
    ملاحظة: إشارة إيدو قابلاً للاكتشاف في نوى germline بعد أقل من 15 دقيقة من إيدو تغذية1.
  6. يغسل الطبق إيدو مع مل ~ 2 M9 أو برنامج تلفزيوني في زجاج تشريح طبق الديدان.

3-تشريح وتثبيت Germline C. ايليجانس

ملاحظة: هذا البروتوكول للتشريح والتثبيت، وتلطيخ جسم من germline خنثي C. ايليجانس مطابق تقريبا لأن نشر جيرفايسي وأرور (2016)22، إلا أنه يمكن فصل أنابيب زجاجية 1 مل لتسريع غسل الخطوات وزجاج تشدق ماصة باستور يمكن استخدامها لإزالة السائل من أنابيب زجاجية 1 مل أكثر فعالية.

  1. أغسل وتشريح جيرملينيس C. ايليجانس .
    1. السماح للحيوانات إلى تسوية إلى الجزء السفلي من الطبق تشريح، دوامة جمع الحيوانات في الوسط، واستخدام ماصة باستور طويلة لإزالة برنامج تلفزيوني. أغسل 1 – 2 مرات مع مل ~ 2 من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني و 4 ميكروليتر من levamisole 100 مم شل الحيوانات. دوامة الطبق مرة أخرى لجمع الحيوانات في وسط الطبق.
      ملاحظة: يمكن أن يستغرق التثبيت بين بضع ثوان وبضع دقائق. التثبيت الكامل ليس من الضروري لنجاح تشريح. بعض الناس لديهم أفضل النجاح عند تشريح المعطل تداولها الحيوانات.
    3. تشريح الحيوانات مع زوج من الإبر 25 5/8 "بقطع في الرأس (تقريبا بين المصابيح البلعوم اثنين) أو الذيل. الحرص على عدم قطع الحلقة الفعل. الأمعاء و germline ينبغي أن "تخرج" تجويف الجسم نتيجة للضغوط الداخلية، ولكن لا تزال تعلق. يشبه هذا البروتوكول منشورة سابقا جيرفيس وعرار (2016)22.
      ملاحظة: الحفاظ على الوقت تشريح لدقيقة ~ 5، بالتأكيد لا يزيد عن 15 دقيقة وقت أطول للتشريح قد يؤدي إلى فقدان إشارة جسم المصبوغة (سودهير ناياك، اتصال شخصي) والموت جوعاً في برنامج تلفزيوني قد تؤثر على فيزيولوجيا الحيوانات. تعلم تشريح بسرعة وبدقة قد يستغرق بعض الممارسات.
    4. إذا لزم الأمر، دوامة جمع الحيوانات تشريح في المركز، واستخدام ماصة باستور طويلة لإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان.
  2. فيكس ويذوي الأنسجة
    1. إضافة 2 مل من 3% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني الحل. تغطية الطبق فضفاضة مع الفيلم المختبر والمتجر على مقاعد البدلاء أو في درج لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: ذوبان الجليد حل منهاج عمل بيجين 37 درجة مئوية في المياه حمام وثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل تشريح جيرملينيس.
      تنبيه: حل منهاج عمل بيجين معتدل السمية ومسرطنة وتناسليا. الأبخرة التي تنبعث منها من حلول بارافورمالدهيد قابلة للاشتعال. ارتداء القفازات النتريل. تمييع منهاج العمل من 16% إلى 3% في غطاء الأبخرة كيميائية. عندما تعمل خارج غطاء الدخان، تبقى جميع الحاويات المشمولة.
    2. نقل الغدد التناسلية بعناية إلى أنبوب الطرد مركزي زجاج نظيفة 5 مل.
    3. إضافة ~ 3 مل ببستو (برنامج تلفزيوني مع 0.1% توين-20) للطبق يحتوي على الغدد التناسلية للمساعدة في استرداد باقي الغدد التناسلية وتمييع الحل منهاج عمل بيجين.
    4. زيادة ونقصان لأسفل في أجهزة الطرد مركزي سريرية في 870 x ز ل ~ 1 دقيقة الأصغر سنا أو أصغر الحيوانات تتطلب وقت أطول لزيادة ونقصان من الحيوانات الأكبر سنا أو أكبر.
    5. باستخدام ماصة زجاجية طويلة، نقل المادة طافية على الكأس المواد غير المرغوب فيها لتجاهل في نهاية المطاف في زجاجة المواد غير المرغوب فيها في هود الكيميائية.
    6. إضافة 2 مل ميثانول غرد مبردة مسبقاً إلى-20 درجة مئوية. تغطية أنبوب الطرد المركزي محكم مع الفيلم المختبر.
      ملاحظة: استخدام الميثانول الطازجة عالية الجودة "تسمية الذهب" ضروري مورفولوجية السليم مع بعض الأجسام المضادة.
      تنبيه: الميثانول سائل الاشتعال وبخار، التي سامة إذا ابتلع، استنشاق، أو السماح بالاتصال بالجلد. ارتداء القفازات ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة. استخدام ثلاجة مناسبة لكميات صغيرة من المواد القابلة للاشتعال.
    7. مخزن في الثلاجة-20 درجة مئوية ح 1، حتى بين عشية وضحاها أو حتى عدة شهور.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-ترطيب جيرملينيس

  1. ملء الأنبوب الطرد المركزي الزجاج إلى الأعلى مع ببستو تمييع في الميثانول وترطيب الغدد التناسلية. تدور إلى أسفل في أجهزة الطرد مركزي سريرية في 870 x ز ~ 1 دقيقة.
  2. استخدام زجاج طويلة ماصة باستور، نقل المادة طافية على الكأس المواد غير المرغوب فيها لتجاهل في نهاية المطاف في زجاجة المواد غير المرغوب فيها في هود الكيميائية.
  3. أغسل الغدد التناسلية باستخدام 3 مرات ~ 5 مل ببستو، الغزل إلى أسفل في أجهزة الطرد مركزي سريرية في 870 x ز ~ 1 دقيقة في كل مرة. إزالة المادة طافية.
  4. شطف أنبوب زجاج البورسليكات صغيرة 1 مل وزجاج طويلة ماصة باستور مع ببستو.
  5. إضافة ميكروليتر ~ 700 من ببستو واستخدام الزجاج طويلة ماصة باستور لنقل الغدد التناسلية إلى أنبوب صغير. استخدام بضع قطرات إضافية من ببستو لضمان أن يتم نقل جميع الغدد التناسلية.
  6. زيادة ونقصان لأسفل في أجهزة الطرد مركزي سريرية في 870 x ز لدقيقة ~ 1 استخدام زجاج طويلة الأمد ماصة باستور، إزالة السائل قدر ممكن دون الإخلال بالغدد التناسلية. ترك لا يزيد عن 50 ميكروليتر.
    ملاحظة: إذا لم يكن الكشف عن الأجسام المضادة اللازمة، تخطي إلى الخطوة 6.

5-الكشف عن المستضدات مع الأجسام المضادة

  1. تمييع الابتدائي الأجسام المضادة في مصل الدم 30% في برنامج تلفزيوني. في هذا المثال، الأجسام المضادة-وابل-1 هو المخفف 1:2,000 والأجسام المضادة-pH3 المخفف 1: 500. الطرد المركزي المصل المذابة طازجة لمدة 10 دقيقة في [ميكروفوج] في 20,000 x ز عند 4 درجة مئوية لإزالة الجسيمات. استخدام المادة طافية، التي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أيام. استخدام المصل المناسب لمطابقة الكائن المضيف الثانوي الأجسام المضادة (المصل الماعز تستخدم هنا). ويمكن إضافة خطوة حظر اختياري قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية.
  2. تطبيق 100 ميكروليتر من جسم الابتدائي المخفف لكل أنبوبة زجاجية صغيرة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 4.
    ملاحظة: قد تختلف أوقات الاحتضان بالضد. لبعض الأجسام المضادة، ح 2 في درجة حرارة الغرفة غير كافية. إينكوباتيونس أطول (على سبيل المثال-، بين عشية وضحاها) ممكنة، ولكن قد تزيد من الخلفية.
  3. ملء الأنابيب أعلى مع ببستو وتدور إلى أسفل في أجهزة الطرد مركزي سريرية في 870 x ز ~ 1 دقيقة.
  4. أغسل الغدد التناسلية 3 مرات استخدام ~ 1 مل من ببستو. إينكوباتي ~ 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي للسماح بجسم الأولية الزائدة منتشر في المياه والصرف الصحي. استخدام تشدق زجاج طويلة ماصة باستور، إزالة السائل قدر ممكن دون الإخلال بالغدد التناسلية. ترك لا يزيد عن 50 ميكروليتر.
  5. تمييع الثانوي الأجسام المضادة في مصل الماعز 30% في برنامج تلفزيوني. في هذا المثال، الماعز-مكافحة-أرنب-594 والماعز-مكافحة--الماوس-647 هي كل المخفف في 1: 400.
    ملاحظة: تحديد الأجسام المضادة الثانوية بعناية للتأكد من الأصباغ تكون متميزة من الصبغة في الطقم إيدو. في هذا المثال، يتضمن الطقم إيدو صبغة إثارة 488 نانومتر.
  6. تطبيق 100 ميكروليتر من جسم الثانوي المخفف لكل أنبوبة زجاجية صغيرة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    ملاحظة: قد تختلف أوقات الاحتضان بالضد. لبعض الأجسام المضادة الثانوية، 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة غير كافية. إينكوبيشنز أطول (على سبيل المثال-، بين عشية وضحاها) ممكنة، ولكن قد تزيد من الخلفية.
  7. أغسل الغدد التناسلية 3 مرات استخدام ~ 1 مل من ببستو. إينكوباتي ~ 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي للسماح بجسم الثانوية الزائدة منتشر في المياه والصرف الصحي. استخدام تشدق زجاج طويلة ماصة باستور، إزالة السائل قدر ممكن دون الإخلال بالغدد التناسلية. ترك لا يزيد عن 50 ميكروليتر.
    ملاحظة: الغدد التناسلية يمكن تخزينها في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني بعد هذه الخطوة، إذا لزم الأمر، على الرغم من أن هذا قد يقلل من الإشارات. قم بإزالة برنامج تلفزيوني قبل المتابعة.

6-القيام برد فعل فوق إيدو للكشف عن إيدو

ملاحظة: أداء إيدو انقر فوق رد فعل قبل جسم تلطيخ الخطوات (إجراء الخطوة 6 قبل الخطوة 5) ممكن، تبعاً للأجسام المضادة المستخدمة7. ومع ذلك، قد تتداخل الكواشف فوق مع بعض المستضدات (مثلاً.، 8 تفصيل جسم حساس للتثبيت وبيرميبيليزيشن). ترتيب المقدمة هنا غلة جسم مشرق تلطيخ مع تفصيل-8، وابل-1, HIM-3, pH3، والعلم، و CYE-1 الأجسام المضادة المستخدمة، بين أمور أخرى.

  1. إعداد انقر فوق إيدو كوكتيل8 جديدة بإضافة ما يلي إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل. من المهم ترتيب الإضافات. حماية من الضوء والحفاظ على جميع المواد الكاشفة على الجليد. هذه الوصفة تعطي ما يكفي لنموذج واحد (100 ميكروليتر)؛ وتتكاثر الوصفة حسب الحاجة.
    1. إضافة 2 مل الماء عالي النقاوة إلى المخزن المؤقت المضافة. وهذا يجعل 10 × مضافة المخزن المؤقت، الذي يجب أن يخفف إلى 1 x مباشرة قبل استخدامها.
    2. إضافة ميكروليتر 8.5 من 10 x العازلة إلى 76.5 ميكروليتر من الماء عالي النقاوة. مزيج جيد.
    3. إضافة ميكروليتر 4 من 100 ملم CuSO4 (قد يكون المسمى كمكون ه). مزيج جيد.
    4. إضافة 0.25 ميكروليتر من الصبغة نانومتر 488 أزيد. يجب إذابة في درجة حرارة الغرفة، كما في المذيبات، ثنائي ميثيل سلفوكسيد، صلبة في 4 درجات مئوية. مزيج جيد وحماية من الضوء.
    5. 9 ميكس ميكروليتر من الماء عالي النقاوة مع 1 ميكروليتر من المخزن المؤقت المضافة في عملية النداء الموحد للأنبوب. بيبيت من الغطاء لإضافة إلى كوكتيل المتبقية، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  2. القيام برد فعل فوق إيدو.
    1. إضافة ~ 100 ميكروليتر من فوق إيدو كوكتيل الغدد التناسلية في أنبوب صغير. تغطية مع الفيلم المختبر واحتضان لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. أغسل مرة واحدة مع 100 ميكروليتر من رد فعل شطف المخزن المؤقت.
    3. أغسل الغدد التناسلية 4 مرات استخدام ~ 1 مل من ببستو. إينكوباتي ~ 15 دقيقة لكل غسل للسماح بفائض مكونات كوكتيل إيدو منتشر في المياه والصرف الصحي. استخدام تشدق زجاج طويلة ماصة باستور، إزالة السائل قدر ممكن دون الإخلال بالغدد التناسلية. ترك لا يزيد عن 50 ميكروليتر.

7-وصمة عار الحمض النووي وإعداد الشرائح

  1. إضافة 1 قطره (~ 25 ميكروليتر) متوسطة تصاعد أنتيفادي مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، المستخدمة لتصور الحمض النووي) الغدد التناسلية. انتظر لبضع دقائق حتى يمكن تسوية وخلط مع الغدد التناسلية.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، إضعاف 1:1,000 DAPI (من مخزون 0.1 مغ/مل) في برنامج تلفزيوني قد تطبق لمدة 5 دقائق، تليها 20 ميكروليتر من 1، 4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو) في والغليسيرول 90%، أو متوسطة التركيب أنتيفادي آخر.
  2. إعداد منصة 2.5% [اغروس] كبيرة على شريحة الميكروسكوب زجاجية قياسية.
  3. استخدام جديدة نظيفة غبار خالية من الزجاج طويلة ماصة باستور لنقل الغدد التناسلية إلى لوح [اغروس]. إبقاء جميع السائل والغدد التناسلية في الجزء السفلي الضيق من ماصة لتقليل الخسائر في الغدد التناسلية.
    ملاحظة: الغدد التناسلية عالقة بأنابيب زجاجية صغيرة أو في زجاج طويلة ماصة باستور يمكن أن تكون "إنقاذ" قبل الشطف مع ببستو، وجمع السائل في طبق تشريح، وانتقاء الحيوانات الفردية على الشريحة مع جفن.
  4. استخدام جفن (أو حلقة من الشعر رقيقة) ملتصقاً بمسواك لتوزيع الغدد التناسلية على لوحة المفاتيح [اغروس] وإزالة ذرات الغبار.
  5. تطبيق ساترة زجاجية مستطيلة. انخفاض ببطء من جانب واحد لتجنب فقاعات الهواء. استخدام أنسجة لإزالة الزائدة الحل مما يحول دون ساترة من التنقل بحرية.
    ملاحظة: اختيار كوفيرسليبس التي تطابق إلى المجهر الذي سيتم استخدامه. #1 و #1.5 كوفيرسليبس تعمل بشكل جيد.
  6. السماح للشرائح لتسوية وجاف قليلاً بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. وهذا يساعد على تسطيح طفيف الغدد التناسلية. يجب أن يتم تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية.
  7. اختياري: ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر، أو آخر الشريحة السدادة. ختم الزوايا أولاً، ثم الجانبين، يمنع ساترة من التحول.

8-[كنفوكل] التصوير والتحليل

  1. صورة الغدد التناسلية القاصي مع غزل قرص [كنفوكل] مجهر فلوري مجهزة بمصدر ضوء عالية طاقة وأهداف الخطة اللازيغيه كاميرا مجهر عالية كفاءة. التقاط الصور مع 1 ميكرومتر أو تشديد التباعد بين رصات z. يحيط علما بالليزر وقت السلطة، والحساسية، والتعرض لكل القنوات.
    1. استخدم الأمر التالي: 405 نانومتر الليزر خط الإثارة مع عامل تصفية انبعاثات نانومتر (W60) 485 ل DAPI، 488 نانومتر الليزر خط الإثارة مع عامل تصفية انبعاثات نانومتر (W55) 527 إيدو، 561 نانومتر الليزر خط الإثارة مع عامل تصفية انبعاثات نانومتر (W70) 615 لوابل-1، و 640 نانومتر ليزر خط اكسسيتا نشوئها مع عامل تصفية انبعاثات نانومتر (W90) 705 pH3.
      ملاحظة: سوف تختلف كثافة الإشارات وكثافة الخلفية. وبالمثل، أوقات التعرض المطلوبة سوف تختلف، ربما يصل إلى 10 إضعاف.
  2. استخدام المكونات في "عداد خلية"23 في فيجي24،25 لعد كل نواة يدوياً. قم بتسمية كل نواة الفردية وفقا لوجود وغياب pH3، إيدو، ووابل-1. استخدام فئات نويات المبينة في الجدول 1 و الشكل 2، كما سيسهل هذه كافة الحسابات المبينة أدناه.
    ملاحظة: يمكن الاعتماد التجريبيون المهرة بدقة جميع النوى في صورة ثلاثية الأبعاد دون العد المزدوج أو أي نويات في عداد المفقودين. بدلاً من ذلك، واحد قد عد كل نواة في كل z-الطائرة، و البرنامج النصي R علامات للخلايا3 يمكن أن تستخدم لإزالة الأنوية تتضاعف-عد.
  3. حساب أرقام الخلية والترددات من التهم المذكورة أعلاه تبعاً لنوع القياس دورة الخلية المطلوبة. يتم تعريف أنواع الأنوية في الجدول 1 و الشكل 2. ويرد في الجدول 2 العمليات الحسابية.
    1. (الاختلاف أنا) تحديد الأنوية في مرحلة ثانية، تغذية الحيوانات إيدو لمدة 30 دقيقة. نواة أي عرض تسمية إيدو نويات S-المرحلة. لحساب, تأخذ الأنوية مبلغ ألف وجيم، انظر الجدول 1 و الشكل 2.
      ملاحظة: في 30 دقيقة نبض إيدو في البرية من نوع الكبار المنحرفين، إيدو جميع المسمى الأنوية المسمى يشترك مع السلف المنطقة علامات1.
    2. قياس منطقة السلف، وصمة عار مع علامة منطقة السلف مثل جسم REC-8 أو وابل-1. يتم تعريف منطقة السلف هنا ككل نوكليوبلاسميك REC-818 أو نوى germline إيمونوريكتيفي وابل-1. لحساب، حساب مجموع جميع الأنوية إيمونوريكتيفي وابل-1 (ألف + باء + جيم + دال، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
      ملاحظة: 1 وابل تسميات DTC ونوى الغدد التناسلية الجسدية التي لا ينبغي أن يحسب أيضا. الأنوية الجسدية من السهل التعرف بإشارة وابل-1 مكثفة للغاية، والموقف قليلاً خارج الفعل، ومورفولوجية "بيض مقلي" الأنوية.
    3. لقياس مؤشر S-المرحلة، أداء 30 دقيقة تجربة إيدو وتسمية المشاركة مع جسم REC-8 أو وابل-1. يتم تعريف فهرس S-المرحلة كنسبة منطقة السلف التي في مرحلة ثانية. لحساب، عد جميع S-المرحلة الأنوية، ومن ثم قسمة مجموع عدد الأنوية منطقة السلف (A + C/ألف + باء + جيم + دال، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
    4. (التغيير الثاني) تحديد الأنوية في مرحلة م، وصمة عار مع جسم pH3. أي نوى إيمونوريكتيفي pH3 نوى م-المرحلة. يعمل هذا بغض النظر عن مدة إيدو آر. لحساب، أن مجموع A ونوى ب، انظر الجدول 1 و الشكل 2.
      ملاحظة: 1 وابل تسميات DTC ونوى الغدد التناسلية الجسدية التي لا ينبغي أن يحسب أيضا. الأنوية الجسدية من السهل التعرف بإشارة وابل-1 مكثفة للغاية، والموقف قليلاً خارج الفعل، ومورفولوجية "بيض مقلي" الأنوية.
    5. لقياس مؤشر م-المرحلة، شارك التسمية مع pH3 وتفصيل-8 أو الأجسام المضادة وابل-1. يتم تعريف فهرس م-المرحلة كنسبة منطقة السلف التي في مرحلة م. لحساب، عد جميع م-المرحلة الأنوية، ومن ثم القسمة على العدد الإجمالي للسلف منطقة نوى (ألف + باء/ألف + باء + جيم + دال، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
    6. (تباين الثالث) نوى في مرحلة ثانية الانقسامية وهو كل تسمية مع إيدو. أقول الشعبين وبصرف النظر، تحديد عما إذا كانت المرحلة S أعقب الانقسام أو الانقسام. لتحديد ما إذا كانت نواة في مرحلة ثانية الانقسامية أو هو، تغذية إيدو ح 4 وتسمية المشارك ل pH3 (علامة M-مرحلة) وسموه-3 (بروتين كروموسوم هو محور) تلطيخ جسم. سجل الأنوية التي تعرض كل من إيدو و pH3 (نوع A، انظر الجدول 1 و الشكل 2) كمرحلة ثانية الانقسامية بينما الأنوية التي تعرض كل من إيدو وسموه-3 (نوع ه، انظر الجدول 1 و الشكل 2) كمرحلة ثانية هو.
    7. (تباين الرابع) حساب مدة المرحلة G2.
      ملاحظة: يفصل G2-المرحلة المرحلة S من م-المرحلة. على الرغم من أن لم يبلغ أي علامة لتسمية G2 في germline C. ايليجانس ، واحد يمكن حساب مدة المرحلة G2 بدمج البيانات من عدة تجارب أن تسمية المرحلة M (وقت التشريح) والمرحلة S (بدءاً من عدة ح قبل تشريح). خلية تعرض م-المرحلة وعلامات S-المرحلة المرحلة G2-أثناء التجربة. خلية التي تعرض علامة M-المرحلة فقط وليس علامة S-المرحلة لم يكن في مرحلة ثانية أثناء التجربة.
      1. لحساب مدة المرحلة G2، تغذية إيدو ح 2 وتسمية المشارك مع جسم pH3. دراسة نوى فقط أن التسمية مع pH3 (هذه مرحلة م في وقت التشريح) لوجود إيدو (وهذه كانت في مرحلة ثانية خلال التسمية إيدو ح 2 قبل تشريح). حساب جزء نواة م-المرحلة التي أكملت المرحلة G2 (A/A + B، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
      2. تكرار هذه التجربة مع تسمية إيدو ح 3، ومرة أخرى مع تسمية إيدو ح 4 (واختيارياً تسمية إيدو ح 5). مؤامرة في المئة من نوى pH3 الإيجابية التي هي إيجابية على المحور الصادي إيدو والمدة لتسمية إيدو على المحور س، كما هو مبين في الشكل 3 ألف.
      3. حساب متوسط مدة المرحلة G2 بتوصيل النقاط على الرسم البياني وتحديد حيث يتقاطع الخط مع 50%، كما هو موضح في الشكل 3 ألف.
      4. حساب الحد الأقصى لمدة المرحلة G2 بتوصيل النقاط على الرسم البياني وتحديد حيث يتقاطع الخط مع 99%، كما هو موضح في الشكل 3 ألف.
    8. (تباين الخامس) حساب دوريون من G2 + M + G1.
      ملاحظة: في germline C. ايليجانس ، المرحلة G1 قصيرة على نحو غير عادي. على الرغم من أن لم يبلغ أي علامة لتسمية G1 في germline C. ايليجانس ، أحد تقدير مجموع مدة المرحلة G2 و M و G1، وثم قارن هذا الوقت مع الوقت G2-المرحلة الموصوفة أعلاه. ويقدر الحد الأقصى لمدة G2 + M + G1 من النسبة المئوية لجميع السلف منطقة نوى (وابل 1 إيمونوريكتيفي) التي ما زالت سلبية إيدو (لم تطرأ المرحلة S) بعد تسمية إيدو لعدة ساعات.
      1. لحساب مدة G2 + M + G1، تغذية إيدو ح 2 وتسمية المشارك مع جسم REC-8 أو وابل-1. تحديد جزء منطقة السلف التي شهدت المرحلة S أثناء هذا الوقت (A + C/ألف + باء + جيم + دال، انظر الجدول 1 و الشكل 2).
      2. تكرار هذه التجربة مع تسمية إيدو ح 3، ومرة أخرى مع تسمية إيدو ح 4 (واختيارياً تسمية إيدو ح 5). ارسم نسبة 8 تفصيل أو نويات وابل-1 الإيجابية التي هي إيجابية على المحور الصادي إيدو والمدة لتسمية إيدو على المحور السيني، كما هو موضح في الشكل 3.
      3. حساب الحد الأقصى لمدة G2 + M + G1 بتوصيل النقاط على الرسم البياني وإيجاد حيث يتقاطع الخط مع 99%، كما هو موضح في الشكل 3 (ب).
        ملاحظة: من الممكن لإجراء تجارب لتحديد مدة G2 و G2 + M + G1 كمجموعة واحدة من 2، 3، 4، وتجارب إيدو ح 5 بوسم يشترك مع أضداد الأرنب-مكافحة-وابل-1 والماوس-مكافحة-pH3.
    9. (تباين السادس) لتحديد الأنوية التي تتكرر في منطقة السلف ولكن منذ ذلك الحين دخل الانقسام الاختزالي، تغذية الحيوانات إيدو ح 10 وتسمية المشارك مع الأجسام المضادة REC-8 أو وابل-1. كانت نواة أي عرض تسمية إيدو في مرحلة ثانية خلال تلك ح 10. وكانت أي الأنوية التي لا تعرض نوكليوبلاسميك REC-8 أو 1 وابل تلطيخ في الانقسام الاختزالي. عد ببساطة الأنوية مع إيدو العلامات التي لا يتم عرض العلامات مع علامة منطقة السلف (ه، انظر الجدول 1).
      ملاحظة: على العكس من ذلك، إذا كانت الغدد التناسلية ملطخة لعلامة الطور الأول هو HIM-3 مع الأجسام المضادة-HIM-3، عد عدد الأنوية مع إيدو العلامات التي أيضا إيجابية لسموه-3.
    10. لحساب معدل دخول هو، إجراء التجربة أعلاه مع تسمية إيدو ح 5، ح 10، وح 15. ارسم عدد الأنوية التي دخلت الانقسام على المحور الصادي والمدة للتسمية إيدو على المحور س، كما هو مبين في الشكل 3. ثم استخدم انحدار خطي بسيط لحساب الميل (الانقسام الاختزالي أنوية دخلت كل ح) من y = mx + b.
      ملاحظة: من الضروري استخدام انحدار خطي لحساب معدل دخول هو. أنه سيكون من غير صحيحة لتقسيم عدد الأنوية التي بدأ الانقسام مدة التسمية إيدو، ببساطة لأن التقاطع y ليست صفراً.
    11. (تباين السابع) قياس معدل التقدم هو.
      ملاحظة: حيث أدمجت إيدو تساهمي في الحمض النووي، يمكن استخدامه لتعقب عدد خلايا عن طريق المفاضلة. الخلايا التي خضعت لمرحلة ثانية في منطقة السلف الاحتفاظ بالتسمية إيدو كما أنها تدخل في الانقسام الاختزالي، التقدم المحرز من خلال الانقسام الاختزالي، والخضوع لتكون البويضات. يمكن استخدامها لقياس معدل التقدم هو تجربة نبض--تشيس مع إيدو.
      1. تغذية البكتيريا المسماة إيدو للحيوانات ح 4 ("نبض"). نقل الحيوانات إلى غير مسمى البكتيريا OP50 ح 48 ("مطاردة")، ثم تشريح وتسمية المشاركة مع علامة منطقة السلف مثل REC-8 أو وابل-1 (أو علامة الطور الأول هو مثل HIM-3) إذا رغبت في ذلك.
      2. عند التصوير، وابحث عن موقف نواة المسمى إيدو الدانية أكثر. معدل التقدم هو هو المسافة (في أقطار الخلية من نهاية منطقة السلف) سافر من إيدو الدانية آخر يسمى نواة أثناء مطاردة ح 48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حيث يلزم تركيب الدنا أن تدمج إيدو، يسع المرء أن يستنتج أن أنوية المسمى إيدو خضع S-المرحلة خلال الإطار الزمني وسم إيدو. واحد قد تفسر الأنوية هذه التسمية في 30 دقيقة تغذية مع إيدو المسماة البكتيريا كنواة في مرحلة ثانية في وقت تشريح. نوى أن التسمية في إيدو مستمر تعد تغذية التجربة قد وصفت المبكر في إطار الوقت ومنذ المرحلة S الأيسر، أو قد يكون المسمى في الجزء متأخرة من النافذة وقت إيدو. إشارة إيدو يموضع اشتركت مع إشارة DAPI. في بعض الأنوية، إشارة إيدو يغطي جميع الكروموسومات، بينما في الأخرى أنوية إيدو يموضع إشارة إلى 1 – 2 بونكتا مشرق (الشكل 4). من المرجح أن هذه بونكتا إكستشروموسومي، الذي يتطابق في أواخر المرحلة S13.

وهنا، كانت الحيوانات التي تتغذى على إيدو بشكل مستمر لمدة 30 دقيقة وتشريح، كما هو موضح أعلاه، وفي الشكل 5. وترد في الشكل 4مثال على نجاح إيدو تلطيخ حيوانا البالغين شباب ومثال واحد لتلطيخ إيدو فاشلة في حيوان البالغين الأكبر سنا (انظر أدناه). يموضع إيدو إشارة من وضع العلامات 30 دقيقة لما يقرب من نصف الأنوية في منطقة السلف (المعرفة بواسطة جسم وابل-1 وضع العلامات ولكن يقترب من DAPI مورفولوجيا26،،من2728). فهرس المرحلة S، ونسبة منطقة السلف إيدو إيجابية، وقد ذكر من قبل في 57 دقة ± 5% وتصل إلى 70% في صغار البالغين1،،من23. فهرس م-المرحلة هو حوالي 2 – 3%1،29. في استمرار تغذية ح 4 أو أطول، جميع الأنوية في تسمية منطقة السلف مع إيدو، وبعض الأنوية التي وصفت في منطقة السلف منذ دخلت الطور الأول هو1.

بينما الأسلوب يعمل باستمرار في الحيوانات البرية من نوع البالغين الشباب، فشل جزء كبير من تفعيل المنحرفين يوم 5 القديمة (حتى تلك التي تحتوي على الحيوانات المنوية) تسمية نبض إيدو (4E الشكل) في 30 دقيقة. ومع ذلك، مع ح 4 إيدو التغذية، ما يقرب من جميع هذه الحيوانات التسمية. وكان فشل متقطعة للتسمية في الحيوانات الإناث الجينية مع نبضات قصيرة من إيدو أيضا المبلغ عنها30. قد تكون هناك حالات أخرى تؤدي إلى فشل متقطعة للتسمية.

أحد حساب مدة دورة الخلية عن طريق إجراء وسم إيدو تجارب عديدة مع pH3 العلامات في كل. وقدرت مدة G2 تحليل نسبة نويات مرحلة M (pH3 إيمونوريكتيفي) التي كانت إيدو الإيجابية خلال الوقت (الشكل 6). ويعطي هذا النهج الوسط والحد الأقصى لمدة G2 (الشكل 3A). وكان محرف الوقت الوسيط، تبين مدة G2 تقريبي من ح 2.5 في الشباب المنحرفين الكبار. وقدرت مدة G2 + M + G1 من النسبة المئوية لجميع السلف منطقة نوى (وابل 1 إيمونوريكتيفي) التي كانت إيدو الإيجابية (الشكل 6). يوفر الأسلوب G2 + M + G1 تدبير أقصى مدة للمراحل مجتمعة (الشكل 3B). وكان محرف الوقت المئين 99، تبين مدة G2 + M + G1 تقريبي من ح 3.4 في الشباب المنحرفين الكبار. البيانات المستمدة من التجارب نفسها التي استخدمت لحساب معدل دخول هو (نويات كل ح). هو المعدل الميل لخط الانحدار الخطي عدد الأنوية التي دخلت الانقسام الاختزالي (إيجابية إيدو، وابل-1 الإيجابية السلبية أو HIM-3) على مدى فترة إيدو التسمية (الشكل 3). قيم البرية من نوع 1 يوم من العمر الكبار المنحرفين مبينة في الجدول 2.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي germline C. ايليجانس ودورة الخلية- (أ) دورة الخلية من الخلايا الجرثومية في germline خنثي البالغين الشباب. وتشير الأرقام إلى النسبة المئوية التقريبية للوقت الذي يقضيه في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. (ب) قد المنحرفين C. ايليجانس اثنين جيرملينيس على شكل U (الأحمر والأزرق). ويرد سبيرماثيكا باللون الأصفر ويرد الرحم مع وضع الأجنة في الرمادي الداكن. يشير خط برتقالي متقطع حيث يتم تشريح الحيوانات لقذف جيرملينيس. (ج) رسم تخطيطي تكشفت C. ايليجانس germline. DAPI (الأزرق) هو صبغة الحمض النووي الذي يسلط الضوء على مورفولوجيا النووية. منطقة السلف القاصي (الضوء الأحمر استناداً إلى تلطيخ جسم وابل-1) يحتوي على ركوب ميتوتيكالي الخلايا الجذعية وخلايا السلف، والخلايا في مرحلة ثانية هو (وابل-1 تسميات أيضا نواة جسدية الغدد التناسلية). الخلايا في مرحلة ثانية الانقسامية وهو التسمية مع 30 دقيقة نبض إيدو ويشار إليها باللون الأخضر. التسمية مع جسم pH3 خليتين في مرحلة م وتظهر باللون الأسود. يوفر الخلية نصيحة القاصي (DTC) يجند GLP-1/الدرجة للحفاظ على الخلايا الجذعية مصير هذه الخلايا. كما تهاجر الخلايا بعيداً عن DTC، هي الخروج من منطقة السلف وأدخل الطور الأول هو. الخلايا الصفراء هي الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: رسم تخطيطي متداخل من فئات الأنوية. يتم تجميع نواة بوجود وعدم وجود علامات ثلاث: وابل-1 يشير إلى خلايا منطقة السلف (أحمر)، إيدو يشير إلى خلايا S-المرحلة (الأخضر) و pH3 يشير إلى خلايا M-المرحلة (أزرق). يتم تعريف أنواع الخلايا ألف إلى زاي. علما بأن خلايا نوع و لا توجد في البرية من نوع الشباب المنحرفين الكبار، ولا تسمية الخلايا يشترك مع إيدو و pH3 خارج السلف (إيجابية وابل-1) المنطقة. الغدد التناسلية القاصي الرسم التخطيطي أدناه تشير إلى مثال واحد من ألف إلى هاء والنوى ز. انظر الجدول 1 للاطلاع على مزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: العرض الرسومي لمدة دورة الخلية ومعدل هو إدخال بيانات تجريبية. (أ) مدة G2 هو محرف المرحلة من pH3 وايدو المشترك وضع العلامات التالية تتفاوت مدة إيدو البقول الخطوط الرمادية تشير إلى مقاييس النسبة المئوية الخمسين والتسعين المستخدمة في التحريف متوسط وأقصى المدد G2، يتبين من الأسهم. لا يتضمن الخلية (ب) في مرحلة M G2 أو G1 إيدو. وهكذا يمكن تقدير المدة القصوى للمرحلة G2 + M + G1 بقياس الحد الأقصى لفترة إيدو التسمية التي تعطي خلايا إيدو سالب. مدة المرحلة G2 + M + G1 هو محرف من إيدو وتفصيل-8 شارك وسم بعد مدة تتفاوت إيدو البقول. يشير الخط الرمادي إلى 99 النسبة المئوية المستخدمة في التحريف الحد الأقصى لمدة G2 + M + G1، يتبين من سهم. من غير الممكن أن اقحم متوسط مدة G2 + M + G1. (ج) معدل دخول هو (في نويات كل ح – انظر الجدول 2) يحسب من الميل لخط الانحدار. لاحظ أن منذ اعتراض التقاطع y ليس صفراً، انحدار اللازمة لحساب دقيق لمعدل دخول هو (ج). . أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. تعديل الأرقام وطبع بإذن من فوكس et al. 20111. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مثال لتلطيخ إيدو الناجحة وغير الناجحة و 30 دقيقة- صور المجهر [كنفوكل] قديمة يوم 1 (أ-د) ويوم 5 قديمة (ح ه) خنثي الغدد التناسلية (لا الحيوانات المنوية المنضب) بعد 30 دقيقة إيدو تجربة وضع العلامات. خط أبيض متقطع يمثل نهاية منطقة السلف. علامات النجمة موقف الحافة البعيدة. علامات خضراء تلطيخ إيدو تصور قبل انقر فوق الكيمياء (A). وسم إيدو فاشلة النتائج في الخلفية ذات المستوى المنخفض تلطيخ لكن ليس مشرق إيدو + نوى (E). علامات حمراء 1 وابل الفلورة (ب، و). اللون الأصفر يشير إلى التداخل (ج، ز). علامات زرقاء DAPI تلطيخ للحمض الخلوي الصبغي (د، ح). واحد رؤوس الأسهم تشير إلى نواة مع إيدو تلطيخ طوال الكروماتين. تشير رؤوس الأسهم مزدوجة نواة مع بونكتا إيدو على زوج واحد فقط من الكروموسومات. وتم الحصول على صور ذات هدف X 63. شريط المقياس = 10 ميكرون (د، ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: سير العمل التجريبي- ملخص البروتوكول التجريبي لتنمو (A)، تشريح تسمية إيدو (ب)، (ج)، جسم وصمة عار (د)، القيام برد فعل انقر فوق إرفاق صبغة إيدو (E)، وصمة عار الحمض النووي (F)، صورة جيرملينيس (ز)، و تحديد مقدار إيدو المسمى وجسم الملون الأنوية (ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مثال لتلطيخ إيدو ح 4 ناجحة. تجربة صور المجهر [كنفوكل] الغدد التناسلية خنثي الكبار 1 يوم من العمر بعد إيدو ح 4 وضع العلامات. خط أبيض متقطع يمثل نهاية منطقة السلف. علامات النجمة موقف الحافة البعيدة. أرجواني علامات pH3 الفلورة (أ، ج). علامات خضراء تلطيخ إيدو تصور قبل انقر فوق الكيمياء (ب، ج). الفلورة علامات حمراء وابل-1 (د). اللون الأصفر يشير إلى تداخل إيدو ووابل-1 (ﻫ). علامات زرقاء DAPI تلطيخ للحمض النووي (F). واحد رؤوس الأسهم تشير إلى نويات المشترك المسمى مع إيدو و pH3. ويمثل السهم المزدوج pH3 + إيدو-نواة-نادر حدوث في إيدو ح 4 وضع العلامات. سهام علامة إيدو + وابل-1-الأنوية التي دخلت الانقسام الاختزالي. وتم الحصول على صور ذات هدف X 63. يظهر شريط مقياس 10 ميكرون (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

علامة: pH3 إيدو * 1-وابل أو تفصيل-8 له-3
التفسير: الانقسام S-المرحلة * منطقة السلف الانقسام الاختزالي
الفئة: تفسير مشترك:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 م-المرحلة، في منطقة السلف، كانت في المرحلة S الانقسامية أثناء تسمية إيدو (G2 المكتملة)
ب Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 م-المرحلة، في منطقة السلف، لم تكن في مرحلة ثانية خلال تسمية إيدو
ج Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 في الطور البيني، في منطقة السلف، كانت في مرحلة ثانية من خلال تسمية إيدو
د Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 في الطور البيني، في منطقة السلف، لم تكن في مرحلة ثانية خلال تسمية إيدو
ه Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 في الانقسام الاختزالي، كانت في مرحلة ثانية هو أثناء تسمية إيدو (الإدخال هو نوى)
و Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 العودة إلى الانقسام (وجدت في بعض طفرات) أو الشعب هو (في الحيوانات المنوية)
ز Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 في الانقسام الاختزالي، لم تكن في مرحلة ثانية خلال تسمية إيدو
مجموع إجمالي pH3 الإيجابية؛ كافة الخلايا في مرحلة م مجموع إجمالي إيدو إيجابية؛ كافة الخلايا في مرحلة ثانية المبلغ الإجمالي 1 وابل إيجابية؛  كافة الخلايا في منطقة السلف مجموع إجمالي 3 سموه إيجابية؛ كافة الخلايا في الطور الأول هو

الجدول 1: فئات نويات. * ملاحظة أن تجارب إيدو 30 دقيقة و 4 ح تختلف في التفسير. في أطول مدة إيدو والتجارب، وخلايا تقدمت يرجح أن تتجاوز مرحلة ثانية. انظر مقدمة و الخطوة 8 فترة إيدو وسم للتجربة ذات الصلة.

جزء دورة الخلية تعريف عملي حساب * قيمة * *
منطقة السلف أنوية جميع وابل-1 (أو تفصيل-8) نوى السلبية الإيجابية، HIM-3 ألف + باء + جيم + دال 231 ± 23 نوى
S-المرحلة الأنوية أنوية إيدو إيجابية بعد تسمية إيدو 30 دقيقة وإيجابية وابل-1 أ + ج 133 ± 20 أنوية
م-المرحلة الأنوية pH3 ونوى كوبوسيتيفي وابل-1 ألف + باء 5.2 ± 2.3 أنوية
فهرس المرحلة S S-المرحلة الأنوية/نواة المنطقة السلف أ + ج/ألف + باء + جيم + دال 57% دورة الخلية
فهرس المرحلة M أنوية م-المرحلة/نواة المنطقة السلف A + B/ألف + باء + جيم + دال 2% دورة الخلية
هو دخول الخلايا إيدو المسمى الأنوية في الانقسام الاختزالي ه ويختلف حسب مدة تسمية إيدو
هو معدل دخول نوى هو إدخال كل ح لتسمية إيدو المنحدر من الشكل 4 ج * * * أنوية 20.3 كل ح
مدة G2 (متوسط) اعتراض 50% من Figure4A ح 2.5
G2 المدة (كحد أقصى) اعتراض 99% من الشكل 4A ح 3.5
G2 + M + G1 المدة (كحد أقصى) اعتراض 99% من الشكل 4B ح 3.5
مدة دورة الخلية (متوسط) متوسط المدة G2/G2-فهرس * * * ح 6.5
مدة دورة الخلية (الحد الأقصى) الحد الأقصى لمدة G2/G2-فهرس * * * ح 8.1

الجدول 2: حسابات دورة الخلية- * الأحرف تمثل فئات نويات المحدد في الجدول 1 و الشكل 3. يتم تعديل العمليات الحسابية من فوكس et al. 20111. * * قيم (± الانحراف المعياري) للمنحرفين البرية من نوع التي أثيرت عند 20 درجة مئوية تتراوح أعمارهم إلى مرحلة أواسط L4 بعد 24 ساعة. ملاحظة أن نظراً لاعتراض التقاطع y ليس صفراً، تراجعا من الضرورية لإجراء حساب دقيق لمعدل دخول هو. G2-المؤشر يتحدد عن طريق طرح مؤشر S-المرحلة، M-المرحلة الفهرس، وتقريبية G1-فهرس (2 في المائة) من 100%، كما وصفها فوكس وآخرون 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد البكتيريا المسماة إيدو (الخطوة 1) أمر حاسم لهذا البروتوكول، والنقطة الأولى لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الشباب المنحرفين الكبار البرية من نوع التسمية جداً موثوق في ح 4 نبض إيدو، مما يجعل هذا عنصر تحكم مفيدة لكل دفعة جديدة من البكتيريا المسماة إيدو. بالإضافة إلى ذلك، سوف تسمية مع الكيمياء انقر سليمة المسمى إيدو البكتيريا التي تدخل الأمعاء (في الحيوانات الأكبر سنا أو بعض طفرات البلعوم/طاحونة المعيبة) وتظهر مشرق بونكتا مستطيل في القناة الهضمية. يستخدم أسلوب بديل لوسم المنحرفين "نقع" في تركيزات عالية من إيدو3(1 مم). هذا الأسلوب تجويع الحيوانات لمدة وضع العلامات، ولكن يوفر وسيلة مفيدة لتجاوز صنع البكتيريا المسماة إيدو عند استكشاف أخطاء التثبيت وانقر فوق الكيمياء. إذا كانت تجربة إيدو "نقع" بنجاح في حين ليس تغذية إيدو، ثم إعداد البكتيريا المسماة إيدو الطازجة. للوصول إلى كثافة بكتيرية كافية بينما أيضا تحقيق محتوى العالي من إيدو، واحد قد تحتاج إلى ضبط تركيزات إيدو و thymidine.

القيد الرئيسي لهذا الأسلوب لوسم المرحلة S في حاجة إلى تغذية البكتيريا المسماة إيدو للحيوانات. قد لا يكون المسمى الحيوانات التي لا تستطيع إطعام (بسبب وراثي أو المرحلة) مع هذا الأسلوب. ومع ذلك، النظير نوكليوزيد حاليا هي الطريقة الوحيدة لتحديد الأنوية S-المرحلة في germline C. ايليجانس ، واستخدامها لا يتطلب أن يكون أي المتسلسلات موجودة في الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، بمجرد إدراجها، يبقى إيدو في نويات حتى وهي إنهاء المرحلة S، التقدم المحرز خلال دورة الخلية، تقسيم، أو التفريق. تضعف الإشارة بمقدار النصف مع كل انقسام الخلية. وهذا يجعل إيدو مثالية لتتبع التاريخ في خلية حتى عن طريق انقسامات الخلية قليلة.

استقرار إيدو يجعل نبض--تشيس تجارب مباشرة؛ ببساطة شطف البكتيريا إيدو الزائدة من الحيوانات بعد الانتهاء من نبض المدة المطلوبة ونقل الحيوانات إلى البكتيريا غير مسمى. إيدو يبقى في الحمض النووي، ويظل مرئياً حتى بعد عدة انقسامات الخلية. بيد أن التجارب لا تقتصر على نوع واحد من تسمية المرحلة S (نبضة واحدة من إيدو). وسم يشترك مع إيدو وبردو ممكن في خلايا الثدييات31 ولكن لم أبلغ في C. ايليجانس. شارك العلامات عن طريق حقن المخدرات وكلدو يستخدم في الثدييات32 ولكن أيضا عدم ذكر في C. ايليجانس.

المزايا الرئيسية لوسم إيدو هي أن الأسلوب يتطلب لا المتسلسلات ويمكن تغذية إيدو إلى C. ايليجانس خلال الثقافة العادية والكيمياء متوافق مع تقنيات إيممونوفلوريسسينت وايدو استمرت في الحمض النووي لفترة طويلة بعد التغذية توقفت. هذه الميزات تجعل إيدو أداة عظيمة لدراسة جوانب كثيرة من ديناميات دورة الخلية والخلية الجرثومية.

تحليل ديناميات دورة الخلية والخلية الجرثومية مع إيدو يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية. مجرد أمثلة قليلة على مزيد من التطبيقات لهذا الأسلوب: كيف تغيير ديناميات دورة الخلية في الحيوانات مع طفرات الجينات دورة الخلية؟ كيف تؤثر الظروف الفسيولوجية دورة الخلية في الخلايا الجذعية ومعدل دخول الخلية الجرثومية في الطور الأول هو معدل تطور الخلية الجرثومية من خلال الطور الأول هو؟ كيف يغير دورة الخلية أثناء تطوير اليرقات؟ كيف تؤثر الاضطرابات مسار الإشارات الرئيسية في دورة الخلية، بالإضافة إلى التغييرات في مصير الخلية (مثل انتشار حمل خارج الرحم)؟ يمكن تعديل هذا النظام لدراسة ما تقوم به الخلايا في العديد من الظروف المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لمركز الأسهم كولاي على MG1693؛ وورمباسي؛ مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس الذي تموله الوطنية معاهد للصحة للبحوث البنية التحتية برامج Office (P40OD010440) لسلالات؛ بينكوس زاك للمشورة الإحصائية؛ قد فنغ للمواد الكيميائية؛ لوك شنايدر وشارف أندريا سانديب كومار برينر جون للتدريب والمشورة، والدعم، ومناقشة مفيدة؛ ومختبرات كورنفيلد و Schedl لردود الفعل على هذه المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في "المعاهد الوطنية للصحة" [R01 AG02656106A1 إلى، GM100756 R01 للملخص] وزمالة "مؤسسة العلوم الوطنية" بريدوكتورال [دج-1143954 و 1745038 تأيين لصنع]. المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة العلوم الوطنية لا بأي دور في تصميم الدراسة، وجمع وتحليل وتفسير البيانات، ولا في كتابة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 140، C. ايليجانس، إيدو، المرحلة S، دورة الخلية، والخط، هو S-المرحلة، M-المرحلة، مرحلة G2
تحليل دورة الخلية في Germline <em>C. ايليجانس</em> مع إيدو التناظرية Thymidine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter