Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

Een imaging gebaseerde methode wordt beschreven dat kan worden gebruikt voor het identificeren van de S-fase en analyseren van de dynamiek van de celcyclus in de C. elegans hermafrodiete germline met behulp van de thymidine analoge EdU. Deze methode vereist geen transgenen en is compatibel met immunefluorescentie kleuring.

Abstract

Analyse van de celcyclus in eukaryoten maakt vaak gebruik van chromosoom morfologie, expressie en/of lokalisatie van gene producten die nodig zijn voor de verschillende fasen van de celcyclus, of de opneming van nucleoside-analogen. Tijdens de S-fase, de polymerase van DNA integreren thymidine analogen zoals EdU of BrdU chromosomale DNA, markering van de cellen voor analyse. Voor C. elegans, de nucleoside analoge EdU wordt gevoed aan de wormen tijdens reguliere cultuur en is compatibel met immunefluorescentie technieken. De kiemcellen van C. elegans is een krachtig model-systeem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus, want het is transparant, genetisch facile en Meiotische profase en cellulaire differentiatie/geslachtscel optreden in een lineaire montage-achtige manier. Deze eigenschappen maken EdU een geweldig hulpmiddel om de studie van dynamische aspecten van mitotically fietsen cellen en germline ontwikkeling. Dit protocol wordt beschreven hoe u met succes EdU bacteriën bereiden, voeden ze met wild-type C. elegans hermafrodieten, de hermafrodiete gonaden ontleden, vlekken voor EdU opneming in DNA, vlek met antilichamen tegen diverse celcyclus detecteren en Developmental markers, beeld van de gonaden en analyseren van de resultaten. Het protocol beschrijft de variaties in de methode en de analyse voor de meting van de S-fase index, M-fase index G2 duur, celcyclus duur, tarief van Meiotische binnenkomst en tarief van Meiotische profase progressie. Deze methode kan worden aangepast om te bestuderen van de celcyclus of cel geschiedenis in andere weefsels, stadia, genetische achtergronden en fysiologische omstandigheden.

Introduction

In dierlijke ontwikkeling, honderden, duizenden, miljoenen, miljarden of zelfs miljarden celdelingen dienen te vormen van het volwassen organisme. De celcyclus, het aantal cellulaire gebeurtenissen samengesteld uit G1 (gap), S (synthese), G2 (gap), en M (mitose) definiëren de reeks van gebeurtenissen die zijn uitgevoerd elke celdeling. De celcyclus is dynamisch en best gewaardeerde in reële tijd, die kan technisch moeilijk. De technieken die in dit protocol gepresenteerd toelaten dat een om de metingen van de fasen en timing van de celcyclus van stilstaande beelden te maken.

Labelen met nucleoside analogen zoals 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) is de gouden standaard om te identificeren van de S-fase in de studies van de celcyclus dynamiek in de Caenorhabditis elegans (C. elegans) volwassene hermafrodiete germline1,2,3,4,5. Zowel de EdU als BrdU kan worden gebruikt in bijna elke genetische achtergrond, als zij niet op een genetische construct baseren zich. Visualiseren van BrdU vereist agressieve chemische behandeling om het antigeen voor anti-BrdU antilichamen tegen vlekken, die vaak onverenigbaar is met de beoordeling van andere cellulaire markers gevisualiseerd door mede kleuring met extra antilichamen bloot te stellen. Daarentegen visualiseren EdU treedt op door klik chemie milde omstandigheden en is dus compatibel met antilichaam mede kleuring6,7.

De specificiteit van het label is duidelijk, omdat kernen alleen de (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-analogen van thymidine in DNA tijdens de S-fase integreren. Visualisatie vindt plaats in vaste weefsel. De EdU-label is onzichtbaar vanzelf tot een azide-bevattende kleurstof of fluorophore reageert covalent met de alkyn in EdU door koper-gekatalyseerde Klik scheikunde8. EdU labeling bieden onmiddellijk informatie over welke kernen in de S-fase, met behulp van een korte puls van labeling. EdU kan ook dynamische informatie bieden, met behulp van puls-jacht of continu etikettering; bijvoorbeeld, in een puls-chase experiment, het etiket bij elke celdeling wordt verdund of doorgegeven als nondividing cellen vooruitgang door middel van ontwikkeling.

De C. elegans hermafrodiete germline is een krachtig modelsysteem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus. De volwassen kiemcellen is een gepolariseerde assemblagelijn met stamcellen gevonden op de distale einde gevolgd door ingang en progressie via Meiotische profase, gecoördineerd met de stadia van de geslachtscel meer proximally (Figuur 1). Proximale eind, eicellen rijpen, zijn algemeen en bevrucht en beginnen embryogenese in de baarmoeder9,10,11. De cel-diameter van ~ 20 lange regio in de buurt van de distale tip-cel, waaronder de mitotically fietsen germline stengel, voorlopercellen en Meiotische cellen in de S-fase maar niet op de cellen in Meiotische profase, heet de voorlopercellen zone2,4 , 9 , 12. de celmembranen bieden onvolledig scheiding tussen de kernen in de distale germline, maar de zone voorlopercellen ondergaan mitotische cel grotendeels zelfstandig fietsen. De duur van de mediane mitotische celcyclus germline van voorlopercellen van zone jonge volwassen hermafrodieten is ~6.5 h; G1-fase is kort of afwezig is, en onbeweeglijkheid1,2,13niet wordt nageleefd. Germline stamcel differentiatie vindt plaats via in wezen directe differentiatie en dus mist transit-sturen divisies4. Tijdens de differentiatie in de pachytene fase, ongeveer 4 van de 5 kernen eicellen niet zullen vormen, maar in plaats daarvan ondergaan apoptosis, fungeert als verpleegkundige cellen door het doneren van hun cytoplasmatische inhoud aan de ontwikkelende oöcyt12,14 , 15.

Naast labeling cellen in de S-fase met nucleoside analogen, men kan het identificeren van de cellen in de mitose en meiose met behulp van antilichaam kleuring. Kernen in de mitose zijn immunoreactive aan anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antilichaam (genaamd pH3)7,16. Kernen in meiose zijn immunoreactive naar anti-hem-3 antilichaam (een Meiotische chromosoom as eiwit)17. Kernen in de voorlopercellen zone kunnen worden geïdentificeerd door het ontbreken van HIM-3, de aanwezigheid van het nucleoplasmic van REC-818of de aanwezigheid van WAPL-1-19. WAPL-1 intensiteit is het hoogst in de somatische gonaden, hoog in de zone van voorlopercellen, en lage tijdens de vroege Meiotische prophases19. Verschillende metingen van de celcyclus zijn mogelijk met een paar variaties in het protocol: ik) kernen in de S-fase identificeren en meten van de S-fase index; II) identificeren kernen in M-fase en meten van de M-fase-index; III) bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase werden; IV) de duur van de maatregel van G2; V) meten de duartion van G2 + M + G1 fasen; VI) maatregel het tarief van Meiotische binnenkomst; VII) schatting van de mate van Meiotische progressie.

Men kan meerdere metingen van de celcyclus van slechts een paar soorten natte-lab experimenten maken. Het onderstaande protocol beschrijft een 30 min pulse labelen door C. elegans volwassen hermafrodieten vervoederen EdU label bacteriën en co labeling cellen van de M-fase door kleuring met anti-pH3 antilichaam en voorlopercellen zone cellen door kleuring met anti-WAPL-1 antilichaam. Alleen de wijzigingen in de duur van de EdU feed (stap 2.5), soort antilichamen (stap 5), en analyses (stap 8.3) zijn vereist voor de extra metingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van EdU-geëtiketteerden bacteriën

  1. Een starter cultuur van MG1693 groeien. Escherichia coli MG1693 (E. coli) draagt een mutatie in thyA.
    1. Streak uit E. coli MG1693 uit een bevroren glycerol voorraad op een 120 mm lysogenie Bouillon (LB) agar petrischaal. Cultuur bij 37 ° C's nachts.
    2. Inoculeer uit twee afzonderlijke E. coli MG1693 kolonies in tweeën dupliceren vloeibare pond cultuur bij 37 ° C gedurende ~ 16 h 4 mL tubes.
      Opmerking: MG1693 groeit prima in de LB zonder aan te vullen met thymine of thymidine.
  2. E. coli MG1693 in minimale media aangevuld met EdU groeien.
    1. Autoclaaf een conische kolf van 500 mL.
    2. Steriele techniek gebruiken toe 5 mL 20% glucose, 50 μl van 10 mg/mL van thiamine, 120 μL van 5 mM thymidine, 100 μl van 1 M MgSO4, 200 μl van 10 mM EdU, 100 mL M9 buffer en 4 mL vers geteelde overnachting MG1693 cultuur.
      Opmerking: De uiteindelijke concentratie van EdU is 20 μM in deze cultuur1,7. Deze concentratie leidt tot DNA schade en celcyclus arrestatie als rechtstreeks toegepast op zoogdiercellen in cultuur20. Echter, slechts een fractie van deze EdU is opgenomen in de E. coli en dus beschikbaar voor C. elegans. Er is geen bewijs van celcyclus aanhoudingsbevel en geen verandering in de grootte van de voorvader zone of M-fase index na EdU behandeling van jonge volwassen hermafrodieten.
    3. Cultuur 's nachts, maar niet langer dan 24 uur bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  3. Concentreer je EdU-geëtiketteerden E. coli en M9 agar petrischalen toepassen.
    1. Vooraf cool een tafelblad centrifuge tot 4 ° C.
    2. Steriele techniek gebruiken om over te brengen van de cultuur in 2-4 steriele 50 mL conische buizen.
    3. Centrifugeer de culturen bij 3000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten aan de EdU-geëtiketteerden E. colipellet.
      Opmerking: Dispose van EdU-bevattende supernatans volgens de richtlijnen van de lokale en institutionele.
    4. Resuspendeer de pellets met 4 mL verse M9. Gebruik een steriele 1 mL pipet tip of een serologische steriele 5 mL-pipet. Resuspending van de pellets kan enkele minuten duren.
    5. Gebruik van de dezelfde Pipetteer toepassen en verspreiden van ~ 8 druppels geresuspendeerde EdU-geëtiketteerden E. coli MG1693 naar het midden van de kamertemperatuur 60 mm M9 agar petrischalen. Één partij levert ~ 16 gerechten.
    6. Laat de gerechten te drogen voor enkele uren of 's nachts bij kamertemperatuur, dan verzegelen van elk gerecht met een strook van laboratorium film. Gerechten kunnen worden opgeslagen bij 15 ° C ~ 2 weken en bij 4 ° C ~ 2 maanden. Gebruik dezelfde batch van EdU gerechten voor elke set van experimenten.

2. feeding EdU aan C. elegans

  1. Synchroniseren bevolking door getimede ei leggen, alkalische hypochloriet behandeling gevolgd door broedeieren in S-medium met cholesterol, of door het plukken van de juiste fase21. Groeien de dieren naar gewenste werkgebied (hier, 24 h post-L4) op Nematode groeimedium bezaaid met E. coli OP50 bij 20 ° C.
    Opmerking: Bereiden 50 – 100 dieren per experiment, zoals sommige niet goed kan ontleden, en anderen zullen verloren gaan tijdens het wassen en over te dragen.
  2. Laat de EdU gerechten opwarmen tot 20 ° C (of de temperatuur die nodig zijn voor het experiment).
  3. Wassen van de dieren uit NGM gerechten, gebruikmakend van de M9 of -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1,5 mL-buis. Toestaan dat de dieren te kort te regelen door de zwaartekracht of een korte spin in een microcentrifuge.
  4. Verwijder het supernatant en wassen van de dieren 1 – 2 keer met ~ 1 mL M9 of PBS. Verwijder het supernatant.
  5. Gebruiken een glazen pipet van Pasteur voor het overbrengen van de dieren in een kleine druppel M9 of PBS in het midden van het EdU-gazon. Wacht een paar minuten voor de vloeistof te worden geabsorbeerd en Incubeer bij 20 ° C gedurende 30 minuten (voor directe meting van de S-fase) of meer (voor het meten van geschiedenis van de S-fase), zo nodig.
    Opmerking: EdU signaal is aantoonbaar in germline kernen na zo weinig als 15 min van EdU1voeding.
  6. De wormen afwassen de EdU-schotel met ~ 2 mL M9 of PBS in een glas ontrafeling van de schotel.

3. dissectie en fixatie van C. elegans Germline

Opmerking: Dit protocol voor de dissectie, fixatie en antilichaam kleuring van de C. elegans hermafrodiete germline is bijna identiek aan die gepubliceerd door Gervaise en Arur (2016)22, behalve dat de 1 mL glazen buizen kunnen worden gecentrifugeerd om te versnellen wassen stappen en een uitgesponnen glazen pipet van Pasteur kan worden gebruikt om de vloeistof van 1 mL glazen buizen effectiever.

  1. Wassen en ontleden van C. elegans germlines.
    1. Toestaan dat de dieren om af te wikkelen naar de onderkant van de ontleden schotel, swirl voor het verzamelen van de dieren in het centrum, en een lange Pipet van Pasteur kunt verwijderen van PBS. Was 1 – 2 keer met ~ 2 mL PBS.
    2. Voeg 2 mL PBS en 4 μL van 100 mM levamisole te immobiliseren van de dieren. Swirl de schotel opnieuw uit om te verzamelen van de dieren in het midden van de schotel.
      Opmerking: Immobilisatie kan enkele seconden tot enkele minuten duren. Volledige immobilisatie is niet nodig voor succesvolle dissectie. Sommige mensen hebben betere succes wanneer dieren ontrafeling van onvolledig geïmmobiliseerd.
    3. Ontleden van de dieren met een paar 25G 5/8" naalden door te snijden op het hoofd (ongeveer tussen de twee faryngaal bollen) of de staart. Wees voorzichtig niet te snijden van de lus van de kiemcellen. Darm en germline moeten "pop uit" van de lichaamsholte toe te schrijven aan interne druk, maar blijven aangesloten. Dit protocol komt overeen met eerder gepubliceerde Gervaise en Arur (2016)22.
      Opmerking: Houd de dissectie tijd aan ~ 5 min, zeker niet meer dan 15 min. langere tijden van de dissectie kunnen resulteren in het verlies van antilichaam kleuring signaal (Sudhir Nayak, persoonlijke mededeling) en verhongering in PBS van invloed kan zijn op de Fysiologie van de dieren. Leren om te ontleden snel en nauwkeurig kan enige praktijk nemen.
    4. Indien nodig, swirl voor het verzamelen van de ontleed dieren in het midden, en een lange Pipet van Pasteur kunt verwijderen van zo veel PBS mogelijk.
  2. Positiebepaling en uitdrogen van weefsels
    1. Voeg 2 mL 3% paraformaldehyde (PFA) in PBS oplossing. Betrekking hebben op de schotel losjes met laboratorium film en winkel op een bankje of in een lade voor 10 min.
      Opmerking: Ontdooien PFA oplossing in een 37 ° C water bad en vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voordat de ontrafeling van de germlines.
      Let op: PFA oplossing is matig toxische waarschijnlijk kankerverwekkend te worden ingedeeld en een teratogen. Dampen uitstoten van paraformaldehyde oplossingen zijn licht ontvlambaar. Nitril handschoenen dragen. Verdun PFA van 16% tot 3% in een chemische zuurkast. Als u werkt buiten de zuurkast, houden alle containers bedekt.
    2. Overbrengen in de gonaden zorgvuldig een schone 5 mL glazen centrifugebuis.
    3. Voeg ~ 3 mL PBSTw (PBS met 0,1% Tween-20) naar de schotel die de gonaden om te helpen met het ophalen van de resterende gonaden en Verdun de PFA-oplossing.
    4. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min. jongere of kleinere dieren moeten langer spin keer dan oudere of grotere dieren.
    5. Met behulp van een lange glazen pipet, overbrengen in het supernatant ongewenste materiële bekerglas voor uiteindelijke negeren in ongewenste materiële fles in de chemische kap.
    6. Voeg toe 2 mL hoogwaardig methanol vooraf gekoeld worden tot-20 ° C. Dekking van de centrifugebuis strak met laboratorium film.
      Opmerking: Gebruik van verse hoogwaardige "gold label" methanol is essentieel voor goede morfologie met bepaalde antilichamen.
      Let op: Methanol is een ontvlambare vloeistof en damp, dat giftig bij inslikken, ingeademd of toegestaan om contact met de huid. Draag handschoenen en passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Gebruik een vriezer die geschikt is voor kleine hoeveelheden van springstoffen.
    7. Winkel in de vriezer-20 ° C gedurende 1 uur, zelfs 's nachts of zelfs enkele maanden.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. het hydrateren van Germlines

  1. Vul de glazen centrifugebuis naar boven met PBSTw te verdunnen van de methanol en hydrateren van de geslachtsklieren. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min.
  2. Met behulp van een lange glazen pipet van Pasteur, overbrengen in het supernatant ongewenste materiële bekerglas voor uiteindelijke negeren in ongewenste materiële fles in de chemische kap.
  3. De geslachtsklieren 3 keer met ~ 5 mL PBSTw, spinnen neer in een klinische centrifuge op 870 x g gedurende ~ 1 min. telkens wassen. Verwijder het supernatant.
  4. Spoel een kleine 1 mL borosilicaatglas buis en een lange glazen pipet van Pasteur met PBSTw.
  5. Voeg ~ 700 l PBSTw en gebruik van de lange glazen pipet van Pasteur de gonaden overbrengen naar de kleine buis. Gebruik een paar extra druppels van PBSTw om ervoor te zorgen dat alle geslachtsklieren worden overgedragen.
  6. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min. met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
    Opmerking: Als antistofdetectie niet nodig is, gaat u naar stap 6.

5. het opsporen van antigenen met antistoffen

  1. Verdun de primaire antilichamen in het serum van de 30% in PBS. In het huidige voorbeeld, anti-WAPL-1 antilichaam is verdunde 1:2,000 en anti-pH3 antilichaam is verdunde 1:500. Centrifugeer vers ontdooid serum voor 10 minuten in een microfuge bij 20.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van de deeltjes. Gebruik de bovendrijvende substantie, die kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor meerdere dagen. Gebruik de juiste serum ter vervanging van het ontvangende organisme van secundaire antilichamen (geit serum wordt hier gebruikt). Een optionele blokkerende stap kan worden toegevoegd voordat het prestatiemeteritembestand van primaire antilichamen.
  2. 100 μl van verdunde primair antilichaam toepassen op elk klein glazen buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
    Opmerking: Incubatie tijden variëren door antilichaam. Voor sommige antilichamen is 2 h bij kamertemperatuur voldoende. Langere incubations (bv., overnachting) zijn mogelijk, maar de achtergrond kan verhogen.
  3. Vul de buizen om top met PBSTw en spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min.
  4. Wassen van de geslachtsklieren 3 keer gebruik ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 5 min per wasbeurt zodat overtollige primair antilichaam te verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
  5. Verdun de secundaire antilichamen in het serum van 30% geit in PBS. In het huidige voorbeeld worden geit-anti-konijn-594 en geit-anti-muis-647 elk verdund op 1:400.
    Opmerking: Selecteer secundaire antilichamen zorgvuldig om ervoor te zorgen dat kleurstoffen zijn verschillend van de kleurstof in de EdU-kit. In het huidige voorbeeld bevatte de EdU kit een 488 nm excitatie kleurstof.
  6. 100 μl van verdunde secundair antilichaam toepassen op elk klein glazen buis. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur 2 h.
    Opmerking: Incubatie tijden variëren door antilichaam. Voor sommige secundaire antilichamen volstaat 1 uur bij kamertemperatuur. Langere incubations (bv., overnachting) zijn mogelijk, maar de achtergrond kan verhogen.
  7. Wassen van de geslachtsklieren 3 keer gebruik ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 5 min per wasbeurt zodat overtollige secundair antilichaam te verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
    Opmerking: Gonaden kunnen worden opgeslagen in 100 μl van PBS na deze stap, indien nodig, hoewel dit signaal kan beperken. PBS verwijderen voordat u verdergaat.

6. Voer de reactie van de EdU-Klik om te detecteren EdU

Opmerking: Het uitvoeren van de EdU is klik reactie vóór het antilichaam kleuring stappen (uitvoeren van stap 6 vóór stap 5) mogelijk, afhankelijk van de antilichamen gebruikt7. Echter de reagentia Klik op bepaalde antigenen storen (bv., REC-8 antilichaam is gevoelig voor fixatie en permeabilization). De hier aangegeven volgorde levert heldere antilichaam kleuring met de REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3 vlag en CYE-1 antilichamen gebruikt, onder anderen.

  1. Bereid de klik EdU cocktail8 vers door het volgende toe te voegen aan een schone 1,5 mL-buis. De volgorde van toevoegingen is belangrijk. Beschermen tegen licht en onderhouden alle reagentia op ijs. Dit recept levert genoeg voor één monster (100 μl); Vermenigvuldig het recept zo nodig.
    1. Voeg 2 mL ultrazuiver water aan de buffer additief. Dit maakt 10 x buffer toevoegingsmiddel, die moeten worden verdund tot 1 x onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken.
    2. 8,5 μl van 10 x buffer aan 76.5 μL van ultrazuiver water toevoegen. Meng goed.
    3. Voeg 4 l 100 mM CuSO4 (kan worden aangeduid als onderdeel E). Meng goed.
    4. 0,25 μL van de 488 nm kleurstof Azide toevoegen. Het moet worden ontdooid bij kamertemperatuur, zoals haar oplosmiddel, dimethylsulfoxide, solide bij 4 ° C. is Meng goed en beschermen tegen licht.
    5. Mix 9 μL van ultrazuiver water met 1 μL van de buffer additief in de dop van de tube. Pipetteer van het GLB te voegen aan de resterende cocktail, en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.
  2. Het uitvoeren van de EdU Klik op reactie.
    1. ~ 100 μl van klik EdU cocktail aan de gonaden in de kleine buis toevoegen. Bedek met laboratorium film en incubeer gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Een keer wassen met 100 μl van reactie spoelen buffer.
    3. Wassen van de geslachtsklieren 4 keer gebruiken ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 15 min per wasbeurt om overtollige EdU cocktail Components wilt verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.

7. de vlekken van DNA en bereiden van dia 's

  1. 1 druppel (~ 25 μL) antifade montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, gebruikt voor het visualiseren van DNA) toevoegen aan de geslachtsklieren. Wacht een paar minuten zodat het kan regelen en meng met de geslachtsklieren.
    Opmerking: Afwisselend, een verdunning van de 1:1,000 van de DAPI (uit een voorraad van de 0,1 mg/mL) in PBS kan worden toegepast voor 5 min, gevolgd door 20 μL van 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) in 90% glycerol, of een ander antifade montage medium.
  2. Een grote 2,5% agarose pad op een microscoopglaasje standaard glas voor te bereiden.
  3. Gebruik een nieuwe schone stofvrije lange glazen pipet van Pasteur de gonaden overbrengen naar de agarose pad. Houd alle vloeistof en gonaden in de smalle onderkant van de pipet om te minimaliseren van het verlies van de geslachtsklieren.
    Opmerking: Gonaden vast aan kleine glazen buis of in lange glazen pipet van Pasteur kan worden "gered" door spoelen met PBSTw, het verzamelen van de vloeistof in een ontleden schotel en plukken van individuele dieren in de dia verschijnt met een wimper.
  4. Gebruik een wimper (of een lus van dun haar) vastgelijmd aan een tandenstoker aan de gonaden over de agarose pad verdelen en de stofdeeltjes te verwijderen.
  5. Breng een dekglaasje van rechthoekige glazen aan. Lagere langzaam van de ene kant om te voorkomen dat luchtbellen. Gebruik een weefsel te verwijderen overtollige oplossing waardoor het dekglaasje aan vrij bewegen.
    Opmerking: Kies coverslips die overeenkomen met de Microscoop die zal worden gebruikt. #1 en #1.5 coverslips werken goed.
  6. Laat de dia's te regelen en licht 's nachts drogen bij kamertemperatuur of 4 ° C. Dit helpt om iets plat de geslachtsklieren. Dia's moeten worden bewaard bij 4 ° C.
  7. Optioneel: Seal de randen van de dia met nagellak, of een andere dia sealer. Afdichten van de hoeken eerst, dan de zijkanten, voorkomt het dekglaasje aan verschuiven.

8. confocal beeldvorming en analyse

  1. Beeld de distale gonaden met een draaiende schijf confocal fluorescente microscoop is voorzien van een hoge energie-lichtbron, plan-apochromatische doelstellingen en een hoog rendement Microscoop camera. De opnamen met 1 μm of strengere afstand tussen z-stacks. Neem nota van laser energie, gevoeligheid en blootstelling tijd voor alle zenders.
    1. Gebruikt u het volgende: 405 nm laser lijn excitatie met een 485 nm (W60) emissie filter voor DAPI, 488 nm laser lijn excitatie met een 527 nm (W55) emissie filter voor EdU, 561 nm laser lijn excitatie met een 615 nm (W70) emissie filter voor WAPL-1 en een 640 nm laser lijn excita ning met een 705 nm (W90) emissie filter voor pH3.
      Opmerking: Signaal intensiteit en de intensiteit van de achtergrond zal verschillen. Ook zullen de vereiste blootstelling tijden variëren, eventueel tot 10-fold.
  2. Gebruik de cel teller plug-in23 in Fiji24,25 te handmatig tellen elke kern. Label elke individuele nucleus volgens de aanwezigheid en de afwezigheid van pH3 EdU en WAPL-1. Gebruik de klassen van kernen beschreven in tabel 1 en Figuur 2, dit alles van de hieronder beschreven berekeningen zal vergemakkelijken.
    Opmerking: Geschoolde experimentalisten kunnen nauwkeurig alle kernen in een 3D-beeld zonder dubbele telling of ontbrekende alle kernen rekenen. Afwisselend, men kan rekenen elke nucleus in elke z-vlak, en de merken-naar-cellen R script3 kan worden gebruikt voor het verwijderen van vermenigvuldigen-geteld kernen.
  3. Bereken cel aantallen en de frequentie van de bovenstaande punten afhankelijk van het soort meting van de celcyclus nodig. De soorten kernen worden gedefinieerd in tabel 1 en Figuur 2. De berekeningen zijn samengevat in tabel 2.
    1. (Variatie ik) Ter identificatie van de kernen in de S-fase, voederen van de dieren EdU gedurende 30 minuten. Alle kernen EdU label weergeven zijn S-fase kernen. Als u wilt berekenen, neem de som A en C-kernen, Zie tabel 1 en Figuur 2.
      Opmerking: Alle EdU label kernen zijn In een 30 min EdU puls in wild-type volwassen hermafrodieten, samen met een label met voorlopercellen zone markeringen1.
    2. Voor het meten van de zone van voorlopercellen, vlek met een voorlopercellen zone teller zoals REC-8 of WAPL-1 antilichaam. De voorlopercellen zone wordt gedefinieerd als alle nucleoplasmic REC-818 of WAPL-1 immunoreactive germline kernen. Als u wilt berekenen, som van alle WAPL-1 immunoreactive kernen (A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      Opmerking: WAPL-1 is het ook etiketten met de DTC en somatische gonaden kernen die niet moeten worden meegeteld. Somatische kernen zijn gemakkelijk te herkennen door intensieve WAPL-1 signaal, standpunt enigszins buiten de kiemcellen, en een "gebakken-ei"-morfologie van de kernen.
    3. Voor het meten van de S-fase-index, een 30 min EdU experiment uitvoeren en co label met REC-8 of WAPL-1 antilichaam. De S-fase-index wordt gedefinieerd als het percentage van de voorvader zone die is in de S-fase. Als u wilt berekenen, tellen alle kernen van de S-fase, en vervolgens delen door het totale aantal voorlopercellen zone kernen (A + C / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
    4. (Variatie II) Ter identificatie van de kernen in M-fase, vlek met pH3 antilichaam. Elke pH3 immunoreactive kernen zijn kernen van de M-fase. Dit werkt ongeacht de duur van de EdU feed. Als u wilt berekenen, nemen de som van A en B-kernen, Zie tabel 1 en Figuur 2.
      Opmerking: WAPL-1 is het ook etiketten met de DTC en somatische gonaden kernen die niet moeten worden meegeteld. Somatische kernen zijn gemakkelijk te herkennen door intensieve WAPL-1 signaal, standpunt enigszins buiten de kiemcellen, en een "gebakken-ei"-morfologie van de kernen.
    5. Voor het meten van de M-fase-index, label samen met pH3 en REC-8 of WAPL-1-antistoffen. De M-fase-index wordt gedefinieerd als het percentage van de voorvader-zone die zich in M-fase. Als u wilt berekenen, tellen alle kernen van de M-fase en vervolgens delen door het totale aantal voorlopercellen zone kernen (A + B / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
    6. (Variatie III) Kernen in mitotische en Meiotische S-fase label zowel met EdU. Om te vertellen van de twee bevolkingsgroepen uit elkaar, bepalen of de S-fase werd gevolgd door mitose of door meiose. Om te bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase, EdU-feed voor 4 h en co label voor pH3 (een marker van de M-fase) en HIM-3 (een eiwit van de as Meiotische chromosoom) van de antilichaam kleuring. Opnemen van de kernen die zowel de EdU als de pH3 weergegeven (type A, Zie tabel 1 en Figuur 2) als mitotische S-fase terwijl kernen die zowel de EdU als de HIM-3 weergegeven (type E, Zie tabel 1 en Figuur 2) als Meiotische S-fase.
    7. (Variatie IV) Berekenen van de duur van G2-fase.
      Opmerking: G2-fase scheidt S-fase van de M-fase. Hoewel geen markering is gemeld aan etiket G2 in de kiemcellen van C. elegans , kunt een berekenen van de duur van G2-fase door het combineren van gegevens uit verschillende experimenten die M-fase (op het moment van de dissectie) en de S-fase (vanaf verschillende h vóór label dissectie). Een cel waarin zowel de M-fase en de S-fase markers G2-fase afgerond in de loop van het experiment. Een cel waarin alleen de M-fase markering en niet de S-fase markering was niet in de S-fase tijdens het experiment.
      1. Voor het berekenen van de duur van de G2-fase, EdU-feed voor 2 h en co label met pH3 antilichaam. Enige kernen die label met pH3 (dit zijn in M-fase ten tijde van de dissectie) voor de aanwezigheid van EdU (deze waren in de S-fase tijdens de 2 h EdU etiket voorafgaand aan dissectie) onderzoeken. Berekenen van de Fractie van de kernen van de M-fase die G2-fase afgerond (A / A + B, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      2. Herhaal dit experiment met een 3U EdU-label, en opnieuw met een 4 h EdU label (en optioneel een 5U EdU-label). Plot de procent van pH3 positieve kernen die EdU positief over de y-as en de duur van EdU-label op de x-as, zoals weergegeven in figuur 3A.
      3. Het berekenen van de mediane duur van G2-fase door het aansluiten van de punten op de grafiek en bepalen waar de lijn kruist 50%, zoals getoond in figuur 3A.
      4. Berekenen de maximale duur van G2-fase door het aansluiten van de punten op de grafiek en bepalen waar kruist de lijn 99%, zoals getoond in figuur 3A.
    8. (Variatie V) Bereken de duraion van G2 + M + G1.
      Opmerking: In de C. elegans germline, G1-fase is ongewoon korte. Hoewel geen markering is gemeld aan het label G1 in het C. elegans germline, kan een schatten van de duur van de som van de G1, G2 en M-fase en vergelijk deze tijd met de tijd van de G2-fase hierboven beschreven. De maximale duur van G2 + M + G1 is naar schatting van het percentage van alle voorlopercellen zone kernen (WAPL-1 immunoreactive) dat EdU negatieve (S-fase niet ondergaan) blijven na EdU labeling voor enkele uren.
      1. Voor het berekenen van de duur van G2 + M + G1, EdU-feed voor 2 h en co label met REC-8 of WAPL-1 antilichaam. Bepalen van de Fractie van de voorvader zone die S-fase gedurende deze tijd onderging (A + C / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      2. Herhaal dit experiment met een 3U EdU-label, en opnieuw met een 4 h EdU label (en optioneel een 5U EdU-label). Plot de procent van REC-8 of WAPL-1 positieve kernen die EdU positief over de y-as en de duur van EdU-label op de x-as, zoals weergegeven in figuur 3B.
      3. Berekenen de maximale duur van G2 + M + G1 door het aansluiten van de punten op de grafiek en vinden waar kruist de lijn 99%, zoals getoond in figuur 3B.
        Opmerking: Het is mogelijk om uit te voeren van de experimenten voor de duur van de G2 en G2 + M + G1 als een enkele set van 2, 3, 4 en 5 h EdU experimenten door mede labelen met zowel konijn-anti-WAPL-1 en muis-anti-pH3 antilichamen.
    9. (Variatie VI) Om te identificeren van de kernen die gerepliceerd in de zone van voorlopercellen maar hebben sinds ingevoerde meiose, voederen van de dieren EdU voor 10u en co label met REC-8 of WAPL-1-antistoffen. Alle kernen weergeven EdU label waren in de S-fase tijdens die 10 h. Alle kernen die niet nucleoplasmic REC-8 of WAPL-1 kleuring weergegeven waren in meiose. Gewoon tellen de kernen met EdU etikettering die niet weergeven labelen met de voorlopercellen zone markering (E, Zie tabel 1).
      Opmerking: Omgekeerd als gonaden voor de Meiotische profase marker HIM-3 met anti-HIM-3 antilichamen zijn bevlekt, tellen het aantal kernen met EdU labeling die zijn ook positief voor HIM-3.
    10. Voor het berekenen van het tarief van Meiotische binnenkomst, het bovenstaande experiment met een 5 h, 10 h en 15 h etiket van EdU uitvoeren Plot het aantal kernen die meiose ingevoerd via de y-as en de duur van het EdU-label op de x-as, zoals in Figuur 3 c. Gebruik vervolgens een eenvoudige lineaire regressie voor de berekening van de helling (kernen ingevoerd meiose per h) uit y = mx + b.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van een lineaire regressie om te bereken het percentage van Meiotische vermelding. Het zou onjuist zijn om simpelweg verdelen van het aantal kernen die meiose ingevoerd door de duur van het EdU-label, want het y-snijpunt niet nul is.
    11. (Variatie VII) Meet het tarief van Meiotische progressie.
      Opmerking: Aangezien EdU covalent in DNA is opgenomen, kan het worden gebruikt voor het bijhouden van een bevolking van cellen tot differentiatie. De cellen die onderging S-fase in de zone van voorlopercellen behouden de EdU-label als ze aangaan van meiose, vooruitgang door middel van meiose, en ondergaan oögenese. Een puls-chase experiment met EdU kan worden gebruikt voor het meten van de snelheid van Meiotische progressie.
      1. EdU-geëtiketteerden bacteriën voeden de dieren gedurende 4 uur (de "pulse"). De dieren op labelloze OP50 bacteriën voor 48 h (de "jacht"), overdragen dan ontleden en co label met een voorvader zone teller zoals REC-8 of WAPL-1 (of een marker Meiotische profase zoals HIM-3) indien gewenst.
      2. Wanneer imaging, kijk voor de positie van de meest proximale EdU-geëtiketteerden kern. Het tarief van Meiotische progressie is de afstand (in de diameters van de cel aan het einde van de zone van voorlopercellen) reisde door de meest proximale EdU label nucleus tijdens de achtervolging 48u.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aangezien DNA-synthese te nemen EdU vereist is, kan men concluderen dat EdU-geëtiketteerden kernen S-fase onderging tijdens het venster van de tijd van de EdU-labeling. Men kan de kernen dat label in een 30 min vervoederen EdU bacteriën aangeduid als kernen in de S-fase ten tijde van de dissectie interpreteren. Kernen die label in een meer continu EdU experiment voeding kunnen vroeg in het venster van de tijd en sinds de linker S-fase hebt gelabeld, of kunnen hebben met het label in het late deel van het venster van de tijd van de EdU. EdU signaal lokaliseert samen met DAPI signaal. In enkele kernen dekt EdU signaal alle chromosomen, terwijl in andere kernen EdU signaal naar 1 – 2 lichte puncta (Figuur 4 lokaliseert). Deze puncta zijn waarschijnlijk het x-chromosoom, die laat in de S-fase13repliceert.

Hier, de dieren werden gevoed met EdU voortdurend voor 30 min en ontleed, zoals beschreven hierboven en in Figuur 5. Een voorbeeld van succesvolle EdU kleuring in een jonge volwassen dieren en één voorbeeld van de mislukte EdU kleuring in een oudere volwassen dier (zie hieronder) worden weergegeven in Figuur 4. EdU signaal van een 30 min labeling lokaliseert aan ongeveer de helft van de kernen in de voorlopercellen zone (gedefinieerd door WAPL-1 antilichaam labeling maar benaderd door DAPI morfologie26,27,28). Index van de S-fase, het aandeel van de voorvader zone die is EdU positieve, was eerder gemeld op 57 ±5% en maar liefst 70 procent in jonge volwassenen1,2,3. M-fase index is ongeveer 2-3%1,29. In continu voeding voor 4 uur of langer, alle kernen in het voorlopercellen zone label met EdU, en sommige kernen die gemarkeerd in de zone van voorlopercellen hebben sindsdien gesloten Meiotische profase1.

Terwijl de techniek consequent in de jonge volwassen dieren wild-type werkt, niet een belangrijke fractie van erop 5 dag oud hermafrodieten (zelfs die met sperma) label in een 30 min EdU pulse (figuur 4E). Echter, met een 4 h EdU voeding, bijna al deze dieren label. Sporadische mislukking aan etiket in genetische vrouwelijke dieren met korte pulsen van EdU is ook gemeld30. Er kunnen andere situaties die leiden sporadische falen tot etiket tot.

Men kan de duur van de celcyclus berekenen door het uitvoeren van verschillende EdU-labeling experimenten met pH3 labeling in elk. De duur van G2 werd geschat door het analyseren van het percentage van de kernen in M-fase (pH3 immunoreactive) die EdU positief in de tijdsverloop (Figuur 6 waren). Deze aanpak geeft de mediaan en de maximale duur van G2 (figuur 3A). De mediane tijd was geïnterpoleerd, een geschatte duur van de G2 van 2,5 h in jonge volwassen hermafrodieten tonen. De duur van G2 + M + G1 was naar schatting van het percentage van alle voorlopercellen zone kernen (WAPL-1 immunoreactive) die waren EdU positieve (Figuur 6). De G2 + M + G1-methode biedt een maximumduur maatregel voor de gecombineerde fasen (figuur 3B). De 99e percentiel tijd was geïnterpoleerd, een geschatte duur van de G2 + M + G1 van 3.4 h in jonge volwassen hermafrodieten tonen. Gegevens uit de dezelfde experimenten werden gebruikt voor het berekenen van het tarief van Meiotische entry (kernen per h). Het tarief is de helling van de lineaire regressie van het aantal kernen die ingevoerd meiose (EdU positief, negatief of HIM-3 positief van de WAPL-1) gedurende de looptijd van het EdU-label (Figuur 3 c). De waarden voor wild-type 1 dag oud volwassen hermafrodieten zijn weergegeven in tabel 2.

Figure 1
Figuur 1: Diagram van C. elegans germline en celcyclus. (A) de celcyclus van kiemcellen in de jonge volwassen hermafrodiete germline. Getallen geven het geschatte percentage van de tijd doorgebracht in elke fase van de celcyclus. (B) C. elegans hermafrodieten hebben twee U-vormige germlines (rood en blauw). De spermatheca is weergegeven in geel en de baarmoeder met de ontwikkeling van de embryo's is weergegeven in donkergrijs. De oranje stippellijn geeft aan waar de dieren worden ontleed om de diepte van de germlines. (C)-Diagram van een ongevouwen C. elegans germline. DAPI (blauw) is een DNA-kleurstof die hoogtepunten van nucleaire morfologie. De zone van de distale voorlopercellen (gemarkeerd in het rood op basis van WAPL-1 antilichaam kleuring) bevat mitotically fietsen stamcellen, voorlopercellen en cellen in Meiotische S-fase (WAPL-1 ook etiketten somatische gonaden kernen). Cellen in de mitotische en Meiotische S-fase van een label met een 30 min EdU puls en zijn groen gemarkeerd. Twee cellen in de M-fase label met pH3 antilichaam en worden weergegeven in het zwart. De distale tip-cel (DTC) biedt de GLP-1/Notch ligand om het lot van de cel van de stam van deze cellen. Als de cellen uit de buurt van de DTC migreren, ze sluiten de voorlopercellen-zone en voer Meiotische profase. Gele cellen zijn sperma in de spermatheca. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Venn-diagram van de klassen van kernen. Kernen zijn gegroepeerd op de aanwezigheid en de afwezigheid van drie markers: WAPL-1 duidt zone voorlopercellen (rood), EdU geeft aan cellen in de S-fase (groen) en pH3 duidt cellen (blauw) van de M-fase. Celtypen, worden aangeduid als A-G. Opmerking in de jonge volwassen hermafrodieten wild-type cellen van het type F worden aangetroffen, waardoor cellen doen niet mede label met EdU en pH3 buiten de voorlopercellen (WAPL-1 positief) zone. De distale gonaden diagram hieronder geeft een voorbeeld van A-E en G kernen. Zie tabel 1 voor meer detail. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: grafische presentatie van de celcyclus duur en aantal Meiotische vermelding experimentele gegevens. (A) de duur van G2 fase wordt geïnterpoleerd van pH3 en EdU mede labeling volgende gevarieerd-duur EdU pulsen grijze lijnen geven aan 50e en 99e percentielen gebruikt in het interpoleren van de mediaan en de maximale duur van de G2, aangegeven door pijlen. (B) een cel in G2, M of G1 fase EdU niet opgenomen. Dus, de maximale duur van G2 + M + G1-fase kan worden geschat door het meten van de maximale duur van EdU-label dat de opbrengst van EdU-negatieve cellen. De duur van G2 + M + G1-fase wordt geïnterpoleerd EdU en REC-8 mede labeling na gevarieerd-duur EdU pulsen. Grijze lijn geeft aan 99e percentiel gebruikt in het interpoleren van de maximumduur van G2 + M + G1, aangegeven met een pijl. Het is niet mogelijk om te interpoleren van de mediane duur van G2 + M + G1. (C) het percentage van Meiotische binnenkomst (in de kernen per h – Zie tabel 2) wordt berekend uit de helling van de regressielijn. Merk op dat aangezien het y-snijpunt snijpunt niet nul is, een regressie is het noodzakelijk voor een nauwkeurige berekening van het percentage van Meiotische vermelding (C). . Foutbalken geven standaarddeviatie. Cijfers bewerkt en herdrukt met toestemming van Fox et al. 2011-1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeld van geslaagde en mislukte 30 min EdU kleuring. Confocal microscoop beelden van een 1 dag oud (A-D) en een 5 dagen oude (E-H) hermafrodiete gonaden (sperma niet uitgeput) na een 30 min EdU labeling experiment. De onderbroken witte lijn markeert het einde van de voorvader zone. Het sterretje geeft de positie van de distale tip. Groene EdU kleuring gevisualiseerd door klikt u op chemie (A). Mislukte EdU labeling resulteert in low-level achtergrond kleuring maar geen heldere EdU + kernen (E). Rode merktekens WAPL-1 immunofluorescentie (B, F). Geel geeft overlapping (C, G). Blauwe merken DAPI kleuring voor DNA (D, H). Enkele pijlpunten geven een kern met EdU kleuring gedurende de chromatine. Dubbele pijlpunten geven een kern met EdU puncta op slechts één paar chromosomen. Beelden werden verkregen met een 63 X doelstelling. Schaal bar = 10 µm (D, H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: experimentele Workflow. Een samenvatting van de experimentele protocol te groeien (A), ontleden EdU label (B), (C), antilichaam vlek (D), voeren de klik-reactie op een kleurstof aan EdU (E) koppelen, vlekken van DNA (F), germlines (G), van het beeld en kwantificeren van EdU label en antilichaam bevlekt kernen (H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: voorbeeld van succesvolle 4 h EdU kleuring. Confocal microscoop beelden van een 1 dag oud volwassen hermafrodiete gonaden na een 4 h EdU labeling experiment. De onderbroken witte lijn markeert het einde van de voorvader zone. Het sterretje geeft de positie van de distale tip. Magenta markeert pH3 immunofluorescentie (A, C). Groene EdU kleuring gevisualiseerd door klikt u op chemie (B, C). Rode merktekens WAPL-1 immunofluorescentie (D). Geel geeft de overlapping van EdU en WAPL-1 (E). Blauwe merken DAPI kleuring voor DNA (F). Enkele pijlpunten geven kernen samen aangeduid met EdU en pH3. Dubbele pijlpunt markeert een pH3 + EdU-kern - een zeldzame gebeurtenis in een 4 h EdU labeling. Pijlen mark EdU + WAPL-1 - kernen die meiose hebt ingevoerd. Beelden werden verkregen met een 63 X doelstelling. Een 10 µm schaal bar wordt weergegeven (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Markering: pH3 EdU * WAPL-1 of REC-8 HEM-3
Interpretatie: Mitose S-fase * Progenitor Zone Meiose
Klasse: Gecombineerde interpretatie:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 in de M-fase, waren in voorlopercellen zone, in mitotische S-fase tijdens EdU label (voltooide G2)
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 in de M-fase, werden in voorlopercellen zone, niet in S-fase tijdens EdU label
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 in interfase, in voorlopercellen zone, waren in de S-fase tijdens EdU label
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 in de interfase, in voorlopercellen zone, werden niet in de S-fase tijdens EdU label
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 in meiose, waren in Meiotische S-fase tijdens EdU label (Meiotische vermelding kernen)
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 terug naar mitose (gevonden in sommige mutanten) of Meiotische divisies (spermatogenese)
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 in meiose, werden niet in de S-fase tijdens EdU label
som totale pH3 positief zijn; alle cellen in de M-fase som totale EdU positief; alle cellen in de S-fase som totale WAPL-1 positief;  alle cellen in de zone van de voorvader som totale HIM-3 positief; alle cellen in Meiotische profase

Tabel 1: klassen van kernen. * Opmerking dat 30 min en 4 h EdU experimenten in interpretatie verschillen. In langere duur EdU experimenten, cellen zijn waarschijnlijk gevorderd dan S-fase. Zie Inleiding en stap 8 voor duur van EdU labeling voor relevante experiment.

Onderdeel van de celcyclus Operationele definitie Berekening * Waarde **
Progenitor Zone kernen alle WAPL-1 (of REC-8) positieve, HIM-3 negatieve kernen A + B + C + D 231 ± 23 kernen
S-fase kernen kernen EdU positief na 30 min EdU label en WAPL-1 positief A + C 133 min of meer 20 kernen
Kernen van de M-fase pH3 en WAPL-1 co-positive kernen A + B 5,2 ± 2,3 kernen
S-fase index S-fase kernen / Progenitor Zone kernen A + C / A + B + C + D 57% van de celcyclus
M-fase index Kernen van de M-fase / Progenitor Zone kernen A + B / A + B + C + D 2% van de celcyclus
Meiotische Entry cellen EdU label kernen in meiose E afhankelijk van de duur van EdU-label
Meiotische ingang tarief Meiotische vermelding kernen per h van EdU-label Helling van figuur 4 C *** 20.3 kernen per h
G2 duur (mediaan) 50% snijpunt van Figure4A 2,5 h
G2 duur (maximaal) 99% snijpunt van figuur 4A 3,5 h
G2 + M + G1 duur (maximaal) 99% snijpunt van figuur 4B 3,5 h
Celcyclus duur (mediaan) mediane G2 duur / G2-index *** 6.5 h
Celcyclus duur (maximaal) G2 maximumduur / G2-index *** 8.1 h

Tabel 2: berekeningen van de celcyclus. * Letters geven de klassen van kernen omschreven in tabel 1 en Figuur 3. Berekeningen zijn van Fox et al. gewijzigd 2011-1. ** Waarden (± standaardafwijking) voor wild-type hermafrodieten bij 20 ° C tot 24u post medio-L4 stadium aan de orde gesteld. Merk op dat aangezien het y-snijpunt snijpunt niet nul is, een regressie is het noodzakelijk voor een nauwkeurige berekening van het percentage van Meiotische binnenkomst. De G2-index wordt bepaald door het aftrekken van de S-fase index M-fase index en de geschatte G1-index (2%) van 100%, zoals beschreven door Fox et al. 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voorbereiding van EdU-geëtiketteerden bacteriën (stap 1) is van cruciaal belang voor dit protocol, en het eerste punt voor het oplossen van problemen. De jonge volwassen hermafrodieten wild-type etiket zeer betrouwbaar in een 4 h EdU-pulse, waardoor dit een nuttige controle voor elke nieuwe partij van EdU-geëtiketteerden bacteriën. Bovendien zal intact EdU-geëtiketteerden bacteriën die worden ingevoerd door de darm (in oudere dieren of bepaalde farynx/grinder defecte mutanten) label met klik chemie en worden weergegeven als heldere langwerpige puncta in de darm. Een alternatieve techniek voor het labelen van hermafrodieten maakt gebruik van een "weken" in een hoge concentratie (1 mM) van EdU-3. Deze techniek starves de dieren voor de duur van de etikettering, maar biedt een handige manier om te mijden maken EdU-geëtiketteerden bacteriën bij het oplossen van fixatie en klik op chemie. Als een experiment EdU "weken" terwijl een EdU-feed niet is succesvol is, dan bereiden verse EdU-geëtiketteerden bacteriën. Om te bereiken een voldoende bacteriële dichtheid terwijl ook het bereiken van een hoog gehalte van de EdU, wellicht een aanpassen van de concentraties van EdU en thymidine.

De belangrijkste beperking van deze techniek voor het labelen van de S-fase is de noodzaak om te voeden van EdU-geëtiketteerden bacteriën aan dieren. De dieren die niet (als gevolg van genotype of een stadium voeden) kunnen niet worden aangeduid met deze techniek. Niettemin, nucleoside analogen zijn momenteel de enige methode om te identificeren van de S-fase kernen in de kiemcellen van C. elegans en hun gebruik vereist niet dat elke transgenen in de dieren aanwezig zijn. Bovendien, zodra opgenomen, EdU blijft in kernen zelfs als zij S-fase, vooruitgang door middel van de celcyclus afrit, verdelen of differentiëren. Het signaal verzwakt door de helft met elke celdeling. Dit maakt EdU perfect voor het bijhouden van een cel geschiedenis zelfs door een paar celdelingen.

De stabiliteit van EdU maakt pulse-chase experimenten eenvoudig; gewoon spoel overtollige EdU bacteriën van de dieren na de gewenste duur puls is voltooid en de dieren op labelloze bacteriën overdragen. EdU blijft in DNA en blijft zichtbaar, zelfs na meerdere celdelingen. De experimenten zijn echter beperkt tot een enkel type van S-fase label (een enkele puls van EdU). Co labelen met EdU en BrdU is mogelijk in zoogdiercellen31 maar niet is gemeld in C. elegans. Co etikettering van IdU en CldU wordt gebruikt in zoogdieren32 maar ook niet gemeld in C. elegans.

De belangrijkste voordelen van EdU labeling zijn dat de methode geen transgenen vereist, EdU kan worden vervoederd aan C. elegans tijdens reguliere cultuur, de chemie compatibel met immunefluorescentie technieken is en EdU DNA voor een lange tijd blijft nadat de voeding heeft gestopt. Deze eigenschappen maken EdU een geweldig hulpmiddel om vele aspecten van de celcyclus en geslachtscellen dynamiek te bestuderen.

Celcyclus en geslachtscellen dynamics analyse met EdU kan worden toegepast op een verscheidenheid van onderzoeksvragen. Slechts een paar voorbeelden van verdere toepassingen van deze methode: Hoe verander de dynamiek van de celcyclus in dieren met celcyclus genmutaties? Hoe beïnvloeden de fysiologische omstandigheden de celcyclus in stamcellen, het tarief van geslachtscellen Meiotische profase inwerkingtreding en het tarief van geslachtscellen progressie via Meiotische profase? Hoe verandert de celcyclus tijdens de ontwikkeling van het larven? Welke invloed hebben grote signalering traject verstoringen op de celcyclus, naast wijzigingen in cel lot (zoals ectopische proliferatie)? Dit systeem kan worden gewijzigd om te bestuderen wat de cellen doen in vele verschillende omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan de E. coli voorraad center voor MG1693; Wormbase; de Caenorhabditis genetica centrum dat wordt gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid Office van onderzoek infrastructuur programma's (P40OD010440) voor stammen; Zach Pincus voor statistisch advies; Aiping Feng voor reagentia; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar en John Brenner voor opleiding, advies, ondersteuning en nuttige discussie; en de Kornfeld en Schedl labs voor feedback over dit manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 aan KK, R01 GM100756 naar TS] en een National Science Foundation predoctoraal fellowship [DGE-1143954 en DGE-1745038 naar ZK]. De National Institutes of Health noch de National Science Foundation had een rol in het ontwerp van de studie, verzameling, analyse en interpretatie van gegevens, en geen schriftelijk het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 140 C. elegans EdU S-fase celcyclus kiemcellen Meiotische S-fase M-fase G2-fase
Cell Cycle analyse in de <em>C. elegans</em> Germline met de Thymidine analoge EdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter