Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cellen syklus analyse i C. elegans Germline med Thymidine Analog EdU

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

En imaging-basert metode beskrives som kan brukes til å identifisere S-fase og analysere celle syklus dynamikk i C. elegans Hermafroditt germline bruke thymidine analoge EdU. Denne metoden krever ingen effekter av transgener og er kompatibel med immunofluorescent flekker.

Abstract

Cellen syklus analyse i eukaryoter benytter ofte kromosom morfologi, uttrykk og/eller lokalisering av genet produkter kreves for ulike faser av cellen syklus, eller innlemmelse av nukleosid analogs. I S-fasen innlemme DNA polymerases thymidine analogs som EdU eller BrdU i chromosomal DNA, merke celler for analyse. For C. elegans, nukleosid analoge EdU mates til ormer under vanlige kultur og er kompatibel med immunofluorescent teknikker. Germline C. elegans er et kraftig modellsystem for studiene signalnettverk trasé, stilk celler, meiose og celle syklus fordi det er gjennomsiktig, genetisk lettvinte, og meiotic prophase og cellulære differensiering/gametogenesis oppstår i en montering-lignende lineært. Disse funksjonene gjør EdU en stor verktøyet å studere dynamisk aspekter av mitotically sykling celler og germline utvikling. Denne protokollen beskriver hvordan å forberede EdU bakterier, mate dem til vill-type C. elegans hermafroditter, dissekere den Hermafroditt gonad, stain for EdU inkorporering DNA, flekker med antistoffer å oppdage ulike cellen syklus og utviklingsmessige markører, bildet i gonad og analysere resultatene. Protokollen beskriver variasjoner i metoden og analyse for måling av S-fase indeks, M-fase indeks, G2 varighet, celle varighet, rate av meiotic oppføring og hastighet på meiotic prophase progresjon. Denne metoden kan tilpasses for å studere i cellen syklus eller cellen historie i andre vev, stadier, genetisk bakgrunn og fysiologiske forhold.

Introduction

I animalske utvikling må hundrevis, tusenvis, millioner, milliarder eller selv billioner av celledelinger danne voksen organisme. Cellen syklusen, utvalget av mobilnettet hendelser består av G1 (mellomrom), S (syntese), G2 (mellomrom), og M (mitose) definerer serien av hendelser kjøres hver celledeling. Cellen syklusen er dynamisk og best verdsatt i sanntid, som kan være teknisk vanskelig. Teknikker som presenteres i denne protokollen tillater en å lage målinger av faser og timing av cellen syklus fra stillbilder.

Merking med nukleosid analogs som 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) eller 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) er gull standard å identifisere S-fase i studiene i cellen syklus dynamikk i den Caenorhabditis elegans (C. elegans) voksen Hermafroditt germline1,2,3,4,5. Både EdU og BrdU kan brukes i nesten alle genetisk bakgrunn, som de ikke stole på noen genetiske konstruksjon. Visualisere BrdU krever sterke rengjøringsmidler å avsløre antigen for anti-BrdU antistoff flekker, som er ofte uforenlig med vurdering av andre cellulære markører visualisert ved co farging med ytterligere antistoffer. Derimot visualisere EdU oppstår ved klikk kjemi under mild forhold og dermed er kompatibel med antistoff co flekker6,7.

Spesifisiteten av etiketten er klart siden kjerner bare inkludere thymidine (5-ethynyl-2-deoxyuridine) analogs inn DNA i S-fasen. Visualisering foregår i fast vev. EdU etiketten er usynlig i seg selv til en azide som inneholder fargestoff eller fluorophore reagerer covalently med alkyne i EdU av kobber-katalysert Klikk kjemi8. EdU merking kan gi umiddelbar informasjon som kjerner er i S-fase, med en kort puls av merking. EdU kan også gi dynamisk informasjon, puls-jage eller kontinuerlig merking; for eksempel i en puls-jage eksperimentet, etiketten er utvannet på hver celledeling eller overført som nondividing celler fremgang gjennom utvikling.

C. elegans Hermafroditt germline er en kraftig modellsystem for studiene signalnettverk trasé, stilk celler, meiose og celle syklus. Den voksne germline er en polarisert samlebåndet med stamceller finnes på den klubbeformede enden etterfulgt av oppføringen og progresjon gjennom meiotic prophase, koordinert med stadier av gametogenesis mer proximally (figur 1). Ved den proksimale enden, oocytes modnes, er ovulated og befruktet og begynne embryogenesis i livmoren9,10,11. ~ 20 celle-diameter lang regionen nær den distale cellen, som inkluderer mitotically sykling germline stammen, stamfar celler og meiotic S-fase celler men ikke cellene i meiotic prophase, kalles stamfar sone2,4 , 9 , 12. cellemembraner gir ufullstendig skille mellom kjerner i den distale germline, men stamfar sonen cellene gjennomgår mitotisk celle sykling stort sett selvstendig. Median mitotisk celle syklus varigheten av germline stamfar sonen celler i ung voksen hermafroditter er ~6.5 h; G1 er kort eller fraværende, og gågaten er ikke observert1,2,13. Germline stem celledifferensiering skjer gjennom egentlig direkte differensiering og dermed mangler transitt-forsterke divisjoner4. Under differensiering pachytene Stadium, ca 4 ute av 5 kjerner vil ikke danne oocytes men i stedet gjennomgår apoptose, fungerer som sykepleier celler ved å donere cytoplasmatiske innholdet utvikling oocyte12,14 , 15.

I tillegg til merking celler i S-fase med nukleosid analogs, kan en finne cellene i mitose og meiose bruker antistoff flekker. Kjerner i mitose er immunoreactive til anti-phospho-histone H3 (Ser10) antistoff (kalt pH3)7,16. Kjerner i meiose er immunoreactive til anti-ham-3 antistoff (en meiotic kromosom aksen protein)17. Kjerner i sonen stamfar kan identifiseres ved fravær av HIM-3, tilstedeværelse av nucleoplasmic REC-818eller tilstedeværelse av WAPL-1-19. WAPL-1 intensitet er høyest i den somatisk gonad, høy i sonen stamfar, og lav under tidlig meiotic prophases19. Flere celle syklus målingene er mulig med noen få variasjoner i protokollen: jeg) identifisere atomkjerner i S-fase og måle S-fase index; II) identifiserer kjerner i M-fase og måle M-fase indeksen. III) fastslå om kjerner var i mitotisk eller meiotic S-fase; IV) mål varigheten av G2; V) måle duartion av G2 + M + G1 faser. VI) måle hastigheten meiotic inngangspunktet; VII) anslå av meiotic progresjon.

En kan lage flere celle syklus målinger for bare noen få typer våt-lab eksperimenter. Protokollen nedenfor beskriver en 30 min puls merking av fôring C. elegans voksen hermafroditter med EdU merket bakterier og co merking M-fase celler av flekker med anti-pH3 antistoffer og stamfar sonen celler av flekker med anti-WAPL-1 antistoff. Bare endringer i varigheten av EdU feed (trinn 2,5), type antistoffer ansatt (trinn 5), og analyser (trinn 8.3) kreves for flere målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av EdU-merket bakterier

  1. Vokse et forrett kultur MG1693. Escherichia coli (E. coli) MG1693 bærer en mutasjon i thyA.
    1. Strek ut E. coli MG1693 fra en frossen glyserol aksje til en 120 mm lysogeny kjøttkraft (LB) agar Petriskål. Kultur på 37 ° C over natten.
    2. Vaksinere fra to individuelle E. coli MG1693 kolonier i to like 4 mL rør av flytende lb kultur på 37 ° C ~ 16 h.
      Merk: MG1693 vokser fint i LB uten supplere med thymine eller thymidine.
  2. Vokse E. coli MG1693 i minimal medier med EdU.
    1. Autoclave en 500 mL konisk kolbe.
    2. Bruk steril teknikk legge 5 mL av 20% glukose, 50 μL av 10 mg/mL Thiamin, 120 μL 5 mM thymidine, 100 μL 1 M MgSO4, 200 μL av 10 mM EdU, 100 mL M9 buffer og 4 mL av fersk dyrket overnatting MG1693 kultur.
      Merk: Den siste konsentrasjonen av EdU er 20 μM i denne kultur1,7. Denne konsentrasjonen fører til DNA skade og celle syklus arrestasjon hvis brukt direkte på pattedyrceller i kultur20. Men er bare en brøkdel av denne EdU inkorporert i E. coli og dermed tilgjengelig for C. elegans. Det er ingen bevis for celle syklus arrestasjon og ingen endring i stamfar sone eller M-fase indeks etter EdU behandling av unge voksne hermafroditter.
    3. Kultur over natten, men ikke lenger enn 24 h på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
  3. Konsentrere EdU-merket E. coli og gjelder M9 agar Petri retter.
    1. Pre kjøle en tabletop sentrifuge til 4 ° C.
    2. Bruke steril teknikk for å overføre kulturen i 2-4 sterilt 50 mL konisk rør.
    3. Sentrifuge kulturer 3000 x g på 4 ° C i 30 minutter til pellets EdU-merket E. coli.
      Merk: Kast EdU inneholder nedbryting i henhold til lokale og institusjonelle retningslinjer.
    4. Resuspend pellets med 4 mL frisk M9. Bruk en steril 1 mL Pipetter tips eller en steril 5 mL serologisk pipetter. Resuspending pellets kan ta flere minutter.
    5. Bruk den samme Pipetter og spre ~ 8 dråper resuspended EdU-merket E. coli MG1693 til midten av romtemperatur 60 mm M9 agar Petri retter. En batch gir ~ 16 retter.
    6. La rettene til tørk i flere timer eller over natten i romtemperatur, deretter forsegle hver rett med en stripe av laboratoriet film. Retter kan lagres på 15 ° C for ~ 2 uker og 4 ° C ~ 2 måneder. Bruk samme batch EdU retter for hvert sett av eksperimenter.

2. fôring EdU til C. elegans

  1. Synkronisere befolkningen ved tidsbestemt egg lå, alkaliske hypokloritt behandling etterfulgt av klekking i S-medium med kolesterol, eller ved å plukke riktige stadiet21. Vokse dyrene til ønsket fase (her, 24 h innlegg-L4) på Rundormer vekst Medium plantet med E. coli OP50 på 20 ° C.
    Merk: Forberede 50-100 dyr per forsøk, som noen ikke kanskje dissekere godt, og andre går tapt under vask og overføring.
  2. Tillate EdU retter å varme 20 ° C (eller temperaturen som kreves for eksperimentet).
  3. Vask dyrene fra NGM retter med M9 eller fosfat-bufret saltvann (PBS) til en 1,5 mL tube. Tillate dyr å avgjøre kort ved tyngdekraft eller en kort spin i en microcentrifuge.
  4. Fjerne nedbryting og vask dyrene 1-2 ganger med ~ 1 mL av M9 eller PBS. Fjerne nedbryting.
  5. Bruke et glass Pasteur pipette for å overføre dyrene i en liten dråpe M9 eller PBS på midten av EdU plenen. Vent noen minutter for flytende å bli absorbert, så ruge ved 20 ° C for 30 min (for direkte S-fase måling) eller lenger (for å måle historie S-fase), etter behov.
    Merk: EdU signalet er i germline kjerner etter så lite som 15 min av EdU fôring1.
  6. Vaske ormer av EdU parabolen med ~ 2 mL M9 eller PBS i et glass dissekere parabolen.

3. disseksjon og fiksering av C. elegans Germline

Merk: Denne protokollen for disseksjon, fiksering og antistoff farging av C. elegans Hermafroditt germline er nesten identisk publisert av Gervaise og Arur (2016)22, bortsett fra at 1 mL glass rør kan være sentrifugeres for å fremskynde vaske trinnene og trukket ut glass Pasteur pipette kan brukes til å fjerne væske fra 1 mL BILLEDRØR mer effektivt.

  1. Vask og dissekere C. elegans germlines.
    1. Tillat dyr til å bosette til bunnen av dissecting fatet, virvel å samle dyrene i midten, og bruke en lang Pasteur pipette fjerne PBS. Vask 1-2 ganger med ~ 2 mL PBS.
    2. Legg 2 mL PBS og 4 μL 100 mM levamisole til nakkens dyrene. Swirl parabolen igjen å samle dyrene i midten av parabolen.
      Merk: Immobilisering kan ta mellom et par sekunder og noen få minutter. Komplett immobilisering er ikke nødvendig for vellykket disseksjon. Noen mennesker har bedre suksess når dissekere ufullstendig immobilisert dyr.
    3. Dissekere dyr med et par 25G 5/8-tommers pinner ved å kutte i hodet (ca mellom to pharyngeal pærene) eller halen. Ta vare ikke for å kutte løkken av germline. Tarmen og germline bør "pop" av kroppens hulrom på grunn av internt press, men fortsatt festet. Denne protokollen er lik tidligere publiserte Gervaise og Arur (2016)22.
      Merk: Hold disseksjon tiden på ~ 5 min, absolutt ikke mer enn 15 minutter lengre disseksjon tid kan resultere i tap av antistoff flekker signal (Sudhir Nayak, personlig kommunikasjon) og sult i PBS kan påvirke dyrenes fysiologi. Lære å dissekere raskt og nøyaktig, kan det ta litt praksis.
    4. Hvis nødvendig, virvel for å samle dissekert dyrene i midten, og bruk en lang Pasteur pipette fjerne PBS så mye som mulig.
  2. Fastsette og tørke vev
    1. Legg 2 mL 3% paraformaldehyde (PFA) i PBS løsning. Dekk parabolen med laboratoriet film og store på en benk eller i en skuff i 10 min.
      Merk: Tine PFA løsningen i en 37 ° C vann bad og deretter avkjøles til romtemperatur før dissekere germlines.
      FORSIKTIG: PFA løsning er moderat giftig og et sannsynlig karsinogen og teratogen. Damper emitting fra paraformaldehyde solutions er brannfarlig. Bruk nitrilhansker. Fortynne PFA fra 16% til 3% i kjemisk avtrekksvifte. Når du arbeider utenfor avtrekksvifte, holde alle beholdere dekket.
    2. Overføre gonader nøye til ren 5 mL sentrifuge røret.
    3. Legge til ~ 3 mL PBSTw (PBS med 0,1% Tween-20) på maten som gonader for å hente gjenstående gonader og fortynne PFA løsningen.
    4. Nedspinning i en klinisk centrifuge 870 x g for ~ 1 min. yngre eller mindre dyr krever lengre spinn ganger enn eldre eller større dyr.
    5. Bruker en lang glass pipette, overføre nedbryting til uønsket materiale beaker for eventuell kast i uønsket materiale flaske i kjemisk panseret.
    6. Legge til 2 mL av høyverdig metanol pre nedkjølt til 20 ° C. Dekk sentrifuge røret tett med laboratoriet film.
      Merk: Bruk av fersk høyverdig "gold label" metanol er avgjørende for riktig morfologi med visse antistoffer.
      FORSIKTIG: Metanol er en svært brennbar væske og damp, som er giftig svelging innånding eller lov til å ta kontakt med huden. Bruke hansker og riktig personlig verneutstyr. Bruke en fryser passer for små mengder flammables.
    7. Oppbevar i 20 ° C fryseren 1t, over natten eller enda flere måneder.
      Merk: Protokollen kan pauses her.

4. rehydrate Germlines

  1. Fyll det sentrifuger røret til toppen med PBSTw å fortynne metanol og rehydrate gonader. Nedspinning i en klinisk sentrifuge 870 x g i ~ 1 min.
  2. Bruker en lang glass Pasteur pipette, overføre nedbryting til uønsket materiale beaker for eventuell kast i uønsket materiale flaske i kjemisk panseret.
  3. Vask gonader 3 ganger med ~ 5 mL PBSTw, spinning ned i en klinisk sentrifuge 870 x g i ~ 1 min hver gang. Fjerne nedbryting.
  4. Skyll en liten 1 mL Borosilikatglass rør og en lang glass Pasteur pipette med PBSTw.
  5. Legger ~ 700 μL PBSTw og bruker lang glasset Pasteur pipette overføre gonader til små røret. Bruke noen flere dråper PBSTw for å sikre at alle gonader overføres.
  6. Nedspinning i en klinisk centrifuge 870 x g for ~ 1 min. med et trukket ut lange glass Pasteur pipette, fjerne så mye som mulig uten å forstyrre gonader. La mer enn 50 μL.
    Merk: Hvis antistoff oppdagelsen ikke er nødvendig, hopper du til trinn 6.

5. finne antigener med antistoffer

  1. Fortynne primære antistoffer i 30% serum i PBS. I dagens eksempel anti-WAPL-1 antistoff er utvannet 1:2,000 og anti-pH3 antistoffer er utvannet 1:500. Sentrifuge fersk tinte serum for 10 min i en microfuge på 20 000 x g på 4 ° C å fjerne partikler. Bruk nedbryting, som kan lagres på 4 ° C i flere dager. Bruk passende serum for å matche verten organisme av sekundær antistoffer (geit serum brukes her). Et valgfritt blokkerer trinn kan legges før tilsetning av primære antistoffer.
  2. Bruke 100 μL utvannet primære antistoff hver lite glass-rør. Inkuber ved romtemperatur 4 h.
    Merk: Inkubasjon ganger varierer avhengig av antistoff. For noen antistoffer er 2 timer ved romtemperatur tilstrekkelig. Lengre incubations (f.eks., overnatting) er mulig, men kan øke bakgrunnen.
  3. Fyll rørene topp med PBSTw og spinne ned i en klinisk sentrifuge 870 x g i ~ 1 min.
  4. Vask gonader 3 ganger bruker ~ 1 mL PBSTw. Incubate for ~ 5 minutter per vask tillate overflødig primære antistoff å spre inn i vask. Bruker en trukket ut lenge glass Pasteur pipette, fjerne så mye som mulig uten å forstyrre gonader. La mer enn 50 μL.
  5. Fortynne sekundære antistoffer i 30% geit serum i PBS. I dagens eksempel er geit-anti-kanin-594 og geit-anti-mus-647 hver utvannet på 1:400.
    Merk: Velg sekundær antistoffer nøye for å sikre fargestoffer er forskjellig fra fargestoff i EdU kit. I dagens eksempel inneholdt EdU settet en 488 nm eksitasjon fargestoff.
  6. Bruke 100 μL utvannet sekundære antistoff hver lite glass-rør. Inkuber i mørket ved romtemperatur 2T.
    Merk: Inkubasjon ganger varierer avhengig av antistoff. For noen sekundær antistoffer er 1 time i rom temperatur nok. Lengre incubations (f.eks., overnatting) er mulig, men kan øke bakgrunnen.
  7. Vask gonader 3 ganger bruker ~ 1 mL PBSTw. Incubate for ~ 5 minutter per vask tillate overflødig sekundære antistoff å spre inn i vask. Bruker en trukket ut lenge glass Pasteur pipette, fjerne så mye som mulig uten å forstyrre gonader. La mer enn 50 μL.
    Merk: Gonader kan lagres i 100 μL PBS etter dette trinnet hvis nødvendig, selv om dette kan redusere signalet. Fjerne PBS før du fortsetter.

6. utføre EdU Klikk reaksjonen å oppdage EdU

Merk: Utfører EdU er Klikk reaksjon før antistoffer flekker trinn (utføre trinn 6 før trinn 5) mulig avhengig av antistoffer brukes7. Men Klikk reagensene kan forstyrre enkelte antigener (f.eks., REC-8 antistoff er følsom for fiksering og permeabilization). Denne rekkefølgen her gir lyse antistoff farging med REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, flagg og CYE-1 antistoffer brukes, blant annet.

  1. Klargjør Klikk EdU cocktail8 frisk ved å legge til følgende en ren 1,5 mL tube. Rekkefølgen på tillegg er viktig. Beskytte mot lys og vedlikeholde reagenser på is. Denne oppskriften gir nok for ett utvalg (100 μL); multiplisere oppskriften etter behov.
    1. Legge til 2 mL ultrapure vann bufferen additiv. Dette gjør 10 x buffer additiv, som må fortynnes til 1 x umiddelbart før å bruke.
    2. Legge til 8,5 μL 10 x buffer 76,5 μL ultrapure vann. Bland godt.
    3. Tilsett 4 μL av 100 mM CuSO4 (kan være merket som komponent E). Bland godt.
    4. Legge til 0,25 μL 488 nm fargestoff Azide. Det må være tint i romtemperatur, som sin løsemiddel, dimethyl sulfoxide, er solid på 4 ° C. Bland godt og beskytte mot lyset.
    5. Mix 9 μL av ultrapure vann med 1 μL bufferen additiv i cap av røret. Pipetter fra lokket til å legge til den resterende cocktailen, og bland godt pipettering opp og ned.
  2. Utføre EdU Klikk reaksjonen.
    1. Tilsett ~ 100 μL av Klikk EdU cocktail gonader i liten tube. Dekk med laboratoriet film og ruge i 30-60 minutter ved romtemperatur.
    2. Vask en gang med 100 μL reaksjon skyll buffer.
    3. Vask gonader 4 ganger bruker ~ 1 mL PBSTw. Incubate for ~ 15 minutter per vask tillate overflødig EdU cocktail komponenter å spre inn i vask. Bruker en trukket ut lenge glass Pasteur pipette, fjerne så mye som mulig uten å forstyrre gonader. La mer enn 50 μL.

7. flekken DNA og klargjøre lysbildene

  1. Legge til 1 dråpe (~ 25 μL) antifade montering medium med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, brukes til å visualisere DNA) gonader. Vent noen minutter slik at det kan avgjøre og bland med gonader.
    Merk: Alternativt en 1:1,000 fortynning av DAPI (fra en 0,1 mg/mL lager) i PBS kan brukes i 5 min, etterfulgt av 20 μL 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) i 90% glyserol, eller en annen antifade montering medium.
  2. Forberede en stor 2,5% agarose pad på en standard barometer microscope skyve.
  3. Bruk en ny ren støvfritt lang glass Pasteur pipette overføre gonader til agarose pad. Oppbevare alle flytende og gonader smale nederst pipette å minimere tap av gonader.
    Merk: Gonader stakk til små glassrør eller i lang glass Pasteur pipette kan "reddes" av skylling med PBSTw, samle væske i dissecting parabol og plukke enkelte dyr på lysbildet med en øyenvippe.
  4. Bruk en øyenvippe (eller en løkke av tynt hår) festet til en tannpirker distribuere gonader over agarose pad og fjerne støvpartikler.
  5. Bruke en rektangulær glass dekkglassvæske. Lavere sakte fra en side å unngå luftbobler. Bruk en vev for å fjerne overflødig løsning dermed hindrer dekkglassvæske i å bevege seg fritt.
    Merk: Velge coverslips som passer til mikroskopet som skal brukes. #1 og #1.5 coverslips fungerer bra.
  6. Gi lysbildene for å bosette og tørke litt over natten i romtemperatur eller 4 ° C. Dette gjør litt flat gonader. Lysbildene skal lagres på 4 ° C.
  7. Valgfritt: Forsegle kantene av lysbildet med neglelakk, eller et annet lysbilde sealer. Tetting hjørnene først, deretter sidene, hindrer dekkglassvæske skifter.

8. AC confocal bildebehandling og analyse

  1. Bildet den distale gonad med en roterende plate AC confocal fluorescerende mikroskop utstyrt med høy energi lyskilde, plan-apochromatic mål og en høy effektivitet mikroskop kamera. Ta bilder med 1 μm eller strammere avstanden mellom z-stabler. Ta note av laser makt, følsomhet og eksponering tid for alle kanaler.
    1. Bruk følgende: 405 nm laser linje eksitasjon med en 485 nm (W60) utslipp filter for DAPI, 488 nm laser linje eksitasjon med en 527 nm (W55) utslipp filter for EdU, 561 nm laser linje eksitasjon 615 nm (W70) utslipp filter for WAPL-1 og en 640 nm laser linje excita sjon med 705 nm (W90) utslipp filter for pH3.
      Merk: Signal intensitet og bakgrunn intensiteten varierer. Likeledes, de nødvendig eksponeringstider varierer muligens opp til 10-fold.
  2. Bruk cellen Counter plug-in23 i Fiji24,25 manuelt telle hver kjerne. Merk hver enkelt kjernen i henhold til tilstedeværelse og fravær av pH3 og EdU WAPL-1. Bruk klasser av kjerner beskrevet i tabell 1 og figur 2, dette vil lette alle beregningene beskrevet nedenfor.
    Merk: Dyktige experimentalists kan nøyaktig regne alle atomkjerner i et 3D-bilde uten telle eller mangler noen kjerner. Eventuelt kan en teller hver kjerne i hver z-fly, og merker-til-celler R script3 kan brukes til å fjerne multiplisere-talt kjerner.
  3. Beregne cellen tallene og frekvenser fra over teller avhengig av cellen syklus måling nødvendig. Hvilke typer kjerner defineres i tabell 1 og figur 2. Beregningene oppsummeres i tabell 2.
    1. (Variasjon jeg) For å identifisere kjerner i S-fase, mate dyr EdU 30 min. Alle atomkjerner vise EdU etiketten er S-fase kjerner. Hvis du vil beregne, tar summen A og C kjerner, se tabell 1 og figur 2.
      Merk: I en 30 min EdU puls i vill-type voksne hermafroditter, alle EdU merket kjerner er co merket med stamfar sone markører1.
    2. For å måle sonen stamfar, flekker med en stamfar sonen markør som REC-8 eller WAPL-1 antistoff. Sonen stamfar defineres her som alle nucleoplasmic REC-818 eller WAPL-1 immunoreactive germline kjerner. Hvis du vil beregne, summere alle WAPL-1 immunoreactive kjerner (A + B + C + D, se tabell 1 og figur 2).
      Merk: WAPL-1 også merker DTC og somatiske gonad kjerner som ikke bør bli regnet. Somatiske kjerner er lett å identifisere ved svært intens WAPL-1 signal, posisjon litt utenfor germline, og en "stekt egg" morfologi av kjerner.
    3. For å måle S-fase indeksen, utfører en 30 min EdU eksperiment og co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antistoff. S-fase indeksen er definert som andelen av sonen stamfar i S-fase. For å beregne, teller alle S-fase kjerner, og deler av det totale antallet stamfar sonen kjerner (+ vekselstrøm / A + B + C + D, se tabell 1 og figur 2).
    4. (Variant II) For å identifisere kjerner i M-fase, flekker med pH3 antistoffer. Noen pH3 immunoreactive kjerner er M-fase kjerner. Dette fungerer uavhengig av varigheten av EdU feed. Hvis du vil beregne, tar summen av A og B kjerner, se tabell 1 og figur 2.
      Merk: WAPL-1 også merker DTC og somatiske gonad kjerner som ikke bør bli regnet. Somatiske kjerner er lett å identifisere ved svært intens WAPL-1 signal, posisjon litt utenfor germline, og en "stekt egg" morfologi av kjerner.
    5. For å måle M-fase indeksen, co etiketten med pH3 og REC-8 eller WAPL-1 antistoffer. M-fase indeksen er definert som andelen av sonen stamfar i M-fase. For å beregne, teller alle M-fase kjerner, og deler av det totale antallet stamfar sonen kjerner (A + B / A + B + C + D, se tabell 1 og figur 2).
    6. (Variant III) Kjerner i mitotisk og meiotic S-fase etiketten både med EdU. For å fortelle de to populasjonene fra hverandre, kan du bestemme om S-fasen ble etterfulgt av mitose eller ved meiose. For å avgjøre om kjerner i mitotisk eller meiotic S-fase, mate EdU for 4 h og co etikett for pH3 (en M-fase markør) og HIM-3 (en meiotic kromosom aksen protein) av antistoff flekker. Registrere kjerner som viser både EdU og pH3 (type A, se tabell 1 og figur 2) som mitotisk S-fasen mens kjerner som viser både EdU og HIM-3 (type E, se tabell 1 og figur 2) som meiotic S-fase.
    7. (Variant IV) Beregne varigheten til G2 fase.
      Merk: G2-fase skiller S-fase fra M-fase. Selv om ingen markør er rapportert til etiketten G2 C. elegans germline, kan en beregne varigheten av G2 fase ved å kombinere data fra flere eksperimenter som etiketten M-fase (ved disseksjon) og S-fase (starter på flere h før disseksjon). En celle som viser både M-fase og S-fase markører fullførte G2-fase i løpet av eksperimentet. En celle som viser bare M-fase markøren og ikke S-fase markøren var ikke i S-fase under eksperimentet.
      1. For å beregne varigheten til G2-fase, mate EdU for 2t og co etikett med pH3 antistoffer. Undersøke bare kjerner som etiketten med pH3 (dette er i M-fase ved disseksjon) etter EdU (disse var i S-fase under 2t EdU etiketten før disseksjon). Beregner brøkdelen av M-fase atomkjerner som fullførte G2-fase (A / A + B, se tabell 1 og figur 2).
      2. Gjenta dette eksperimentet med en 3t EdU etikett, og igjen med en 4 h EdU etikett (og eventuelt en 5t EdU etikett). Tegn prosent av pH3 positive kjerner som EdU positivt på y-aksen og varigheten av EdU etiketten på x-aksen, som vist i figur 3A.
      3. Beregne medianen varigheten til G2-fase ved koble poeng i diagrammet og bestemme der linjen krysser 50%, som vist i figur 3A.
      4. Beregn den maksimale varigheten av G2-fase ved koble poeng i diagrammet og bestemme der linjen krysser 99%, som vist i figur 3A.
    8. (Variant V) Beregne duraion av G2 + M + G1.
      Merk: I C. elegans germline, G1 fase er uvanlig kort. Selv om ingen markør er rapportert å merke G1 i C. elegans germline, kan beregne summen varigheten av G2, M og G1 fase, og deretter sammenligne denne gangen med G2-fase tiden beskrevet ovenfor. Den maksimale varigheten av G2 + M + G1 anslås fra prosenten av alle stamfar sonen kjerner (WAPL-1 immunoreactive) forblir EdU negative (ikke gjennomførte S-fase) etter EdU merking i flere timer.
      1. For å beregne varigheten til G2 + M + G1, mate EdU for 2t og co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antistoff. Bestemme brøkdel av stamfar sonen som gjennomgikk S-fase i denne perioden (+ vekselstrøm / A + B + C + D, se tabell 1 og figur 2).
      2. Gjenta dette eksperimentet med en 3t EdU etikett, og igjen med en 4 h EdU etikett (og eventuelt en 5t EdU etikett). Tegn prosent av REC-8 eller WAPL-1 positiv kjerner som EdU positivt på y-aksen og varigheten av EdU etiketten på x-aksen, som vist i figur 3B.
      3. Beregn den maksimale varigheten av G2 + M + G1 ved koble poeng i diagrammet og finne der linjen krysser 99%, som vist i figur 3B.
        Merk: Det er mulig å utføre eksperimenter for å bestemme varigheten av G2 og G2 + M + G1 som et enkelt sett med 2, 3, 4 og 5 h EdU eksperimenter ved co merking med både kanin-anti-WAPL-1 og mus-anti-pH3 antistoffer.
    9. (Variant VI) Å identifisere kjerner som replikeres i sonen stamfar, men har siden angitt meiose, mate dyr EdU 10t og co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antistoffer. Alle atomkjerner vise EdU etiketten var i S-fase i løpet av de 10 h. Alle atomkjerner som ikke viser nucleoplasmic REC-8 eller WAPL-1 flekker var i meiose. Bare telle kjerner med EdU merking som ikke viser merking med stamfar sonen markøren (E, se tabell 1).
      Merk: Derimot hvis gonader er farget for meiotic prophase markøren HIM-3 med anti-HIM-3 antistoffer, antallet kjerner med EdU merking som er også positivt for HIM-3.
    10. For å beregne hastigheten på meiotic oppføring, utføre over eksperimentet med en 5 h og 10 h 15 h etiketten for EdU. Tegne inn antall kjerner som angitt meiose på y-aksen og varigheten av EdU etiketten på x-aksen, som vist i Figur 3 c. Deretter bruker en enkel lineær regresjon beregne stigningstallet (kjerner angitt meiose per h) fra y = mx + b.
      Merk: Det er viktig å bruke en lineær regresjon for beregning av meiotic posten. Det ville være feil å bare dividere antall kjerner som angitt meiose av varigheten av EdU, fordi y-skjæringspunktet ikke er null.
    11. (Variant VII) Måle frekvensen av meiotic progresjon.
      Merk: Siden EdU bygges covalently inn i DNA, kan det brukes til å spore en populasjon av celler gjennom differensiering. Cellene som gjennomgikk S-fase i sonen stamfar beholde EdU etiketten som de inn i meiose, gjennom meiose, og gjennomgå oogenesis. En puls-jage eksperimentere med EdU kan brukes til å måle frekvensen av meiotic progresjon.
      1. Feed EdU-merket bakterier til dyrene 4 h (til "pulse"). Overføre dyrene til umerket OP50 bakterier 48 h ("jakten"), og dissekere og co etikett med merketråd stamfar sonen som REC-8 eller WAPL-1 (eller en meiotic prophase markør som HIM-3) hvis ønskelig.
      2. Når imaging, se etter plasseringen av mest proksimale EdU-merket kjernen. Hastigheten på meiotic progresjon er avstanden (i celle diameter fra slutten av sonen stamfar) reiste med de mest proksimale EdU merket kjernen under 48t jakten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siden DNA-syntese er nødvendig å innlemme EdU, kan en konkludere med at EdU-merket kjerner gjennomgikk S-fase under tidsvinduet EdU-merking. En kan tolke kjerner som etikett i en 30 min fôring med EdU merket bakterier som atomkjerner i S-fase ved disseksjon. Kjerner som etiketten i en lenger kontinuerlig EdU fôring eksperimentet kan ha merket tidlig i tidsvinduet og siden venstre S-fase, eller kan ha merket i slutten del av EdU tidsvinduet. EdU signal regionaliserer sammen med DAPI signal. I noen kjerner dekker EdU signal alle chromosomes, mens i andre kjerner EdU signal regionaliserer til 1-2 lyse puncta (Figur 4). Disse puncta er sannsynligvis X-chromosome, som replikerer sent i S-fase13.

Her, dyrene ble matet med EdU kontinuerlig i 30 min og dissekert, som beskrevet ovenfor og i figur 5. Et eksempel på vellykket EdU farging i en ung voksen dyr og et eksempel på vellykket EdU farging i en eldre voksen dyr (se nedenfor) er vist i Figur 4. EdU signalet fra en 30 min merking regionaliserer omtrent halvparten av kjerner i sonen stamfar (definert av WAPL-1 antistoff merking men tilnærmes med DAPI morfologi26,27,28). S-fase indeks, andelen stamfar sonen som EdU positiv, var tidligere rapportert på 57 ±5% og så høyt som 70% i unge voksne1,2,3. M-fase indeksen er ca 2-3%1,29. Kontinuerlig mating 4 h eller lenger, alle kjerner i stamfar sonen etiketten med EdU, og noen kjerner som merket i sonen stamfar ha siden skrevet meiotic prophase1.

Mens teknikken fungerer konsekvent i vill-type ung voksen dyr, en betydelig andel av parret 5 dagers gammel hermafroditter (selv de som inneholder sæd) ikke etiketten i en 30 min EdU puls (figur 4E). Men med en 4 h EdU fôring, nesten alle disse dyrene etiketten. Sporadiske manglende etikett i genetisk kvinnelige dyr med korte pulser av EdU har også vært rapportert30. Det kan være andre situasjoner som fører til sporadisk feil etiketten.

Man kan beregne varigheten av cellen syklus ved å utføre flere EdU-merking eksperimenter med pH3 merking i hver. Varigheten av G2 ble beregnet ved å analysere prosent av kjerner i M-fase (pH3 immunoreactive) som var EdU positiv løpet tid (figur 6). Denne tilnærmingen gir median og maksimale varigheten av G2 (figur 3A). Median tiden var interpolert, viser en tilnærmet G2 varighet på 2,5 t i ung voksen hermafroditter. Varigheten av G2 + M + G1 ble anslått fra prosentandelen av alle stamfar sonen kjerner (WAPL-1 immunoreactive) som var EdU positiv (figur 6). Metoden G2 + M + G1 gir en maksimal varighet for kombinert faser (figur 3B). 99nde persentil tiden var interpolert, viser en tilnærmet G2 + M + G1 varighet på 3,4 h i ung voksen hermafroditter. Data fra samme eksperimentene ble brukt til å beregne hastigheten på meiotic oppføring (kjerner per h). Satsen er stigningstallet for den lineære regresjonen antall kjerner angitt meiose (EdU positiv, WAPL-1 negative eller HIM-3 positiv) over varigheten av EdU etiketten (Figur 3 c). Verdiene for vill-type 1 dag gammel voksen hermafroditter vises i tabell 2.

Figure 1
Figur 1: Diagram av C. elegans germline og celle syklus. (A) cellen syklus av bakterie celler i den unge voksne Hermafroditt germline. Tallene viser omtrentlig prosentandelen av tid brukt i hver celle syklus fase. (B) C. elegans hermafroditter har to U-formet germlines (rød og blå). Spermatheca vises i gult og livmoren utvikle embryo vises i mørk grå. Den stiplede oransje linjen angir hvor dyr er dissekert extrude i germlines. (C) Diagram av en utbrettet C. elegans germline. DAPI (blå) er en DNA fargestoff som fremhever kjernefysiske morfologi. Den distale stamfar sonen (uthevet i rødt basert på WAPL-1 antistoff flekker) inneholder mitotically sykling stamceller, stamfar celler og celler i meiotic S-fase (WAPL-1 også etiketter somatisk gonad kjerner). Celler i mitotisk og meiotic S-fase etikett med en 30 min EdU puls og angis i grønt. To cellene i M-fase etikett med pH3 antistoffer og vises i svart. Den distale cellen (DTC) gir GLP-1/hakk ligand for å opprettholde stamcelleforskningen skjebnen til disse cellene. Som cellene migrere fra DTC, de avslutter sonen stamfar og angi meiotic prophase. Gule cellene er sperm i spermatheca. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Venndiagram klasser av kjerner. Kjerner er gruppert etter tilstedeværelse og fravær av tre indikatorer: WAPL-1 angir stamfar sonen celler (rød), EdU angir S-fase celler (grønn), og pH3 angir M-fase celler (blå). Celletyper identifiseres som AG. Merk at i vill-type unge voksne hermafroditter celler av typen F finnes ikke, og celler ikke co etiketten med EdU og pH3 utenfor (WAPL-1 positiv) stamfar sone. Distale gonad diagrammet nedenfor viser et eksempel på AE og G kjerner. Se tabell 1 for flere detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: grafisk fremstilling av cellen syklus varighet og hastighet på meiotic oppføring eksperimentelle data. (A) varigheten av G2 fase interpoleres fra pH3 og EdU co merking følgende variert varighet EdU pulser grå linjer angir 50th og 99nde persentil brukes i interpolere median og maksimal G2 varigheter, angitt med piler. (B) en celle i G2, M eller G1 fase innlemme ikke EdU. Dermed kan den maksimale varigheten av G2 + M + G1 fase anslås ved å måle den maksimale varigheten av EdU etiketten som gir EdU-negativ celler. Varigheten av G2 + M + G1 fase interpoleres EdU og REC-8 co merking etter variert varighet EdU pulser. Grå linjen angir 99nde persentil brukes i interpolere maksimal G2 + M + G1 varighet, angitt med en pil. Det er ikke mulig å interpolere median G2 + M + G1 varigheten. (C) antall meiotic oppføring (i kjerner per h-se tabell 2) er beregnet fra stigningstallet til regresjonslinjen. Merk at siden y-skjæringspunktet skjæringspunktet ikke er null, en regresjon er nødvendig for en nøyaktig beregning av satsen for meiotic oppføring (C). . Feilfelt viser standardavviket. Endret og gjengitt med tillatelse fra Fox et al. 20111. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel på vellykkede og mislykkede 30 min EdU farging. AC confocal mikroskop bilder av en 1 dag gammel (A-D) og en 5 dagers gammel (Eh) Hermafroditt gonad (ikke sperm utarmet) etter en 30 min EdU merking eksperiment. Den stiplede hvite linjen markerer slutten på sonen stamfar. Stjernen markerer posisjonen til den distale tuppen. Grønne klikker EdU flekker visualisert ved kjemi (A). Mislykket EdU merking gir lavt nivå bakgrunn flekker men ingen lys EdU + kjerner (E). Røde merker WAPL-1 immunofluorescence (B, F). Gult angir overlapping (C, G). Blå merker DAPI flekker for DNA (D, H). Enkelt pilspisser indikerer en kjerne med EdU flekker over hele chromatin. Dobbel pilspisser indikerer en kjerne med EdU puncta på bare et par av kromosomer. Bildene ble oppnådd med et 63 X mål. Skala bar = 10 µm (D, H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksperimentell arbeidsflyten. Et sammendrag av eksperimentelle protokollen å vokse (A), analysere EdU etikett (B), (C), antistoff flekk (D), utføre Klikk reaksjonen å knytte en farge til EdU (E), flekken DNA (F), image germlines (G), og kvantifisere EdU merket og antistoff farget kjerner (H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: eksempel på vellykket 4 h EdU farging. AC confocal mikroskop bilder av en 1 dag gammel voksen Hermafroditt gonad etter en 4 h EdU merking eksperiment. Den stiplede hvite linjen markerer slutten på sonen stamfar. Stjernen markerer posisjonen til den distale tuppen. Magenta markerer pH3 immunofluorescence (A, C). Grønne klikker EdU flekker visualisert ved kjemi (B, C). Røde merker WAPL-1 immunofluorescence (D). Gult angir overlappingen av EdU og WAPL-1 (E). Blå merker DAPI flekker for DNA (F). Enkelt pilspisser angir kjerner co merket med EdU og pH3. Den doble pilspissen markerer en pH3 + EdU-kjerne - en sjelden forekomst i en 4 h EdU merking. Piler merke EdU + WAPL-1 - kjerner som har angitt meiose. Bildene ble oppnådd med et 63 X mål. 10 µm skala bar vises (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Merketråden: pH3 EdU * WAPL-1 eller REC-8 HAM-3
Tolkning: Mitose S-fase * Stamfar sone Meiose
Klasse: Kombinert tolkning:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 i M-fase, var i stamfar sonen, i mitotisk S-fase under EdU etikett (fullført G2)
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i M-fase, ble i stamfar sonen, ikke i S-fase i EdU etikett
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 Interphase, i stamfar sonen, var i S-fase under EdU etikett
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i Interphase, i stamfar sonen, ble ikke i S-fase i EdU etikett
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 i meiose, var i meiotic S-fase under EdU etikett (meiotic oppføring kjerner)
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 gå tilbake til mitose (finnes i enkelte mutanter) eller meiotic divisjoner (i spermatogenesis)
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 i meiose, ble ikke i S-fase i EdU etikett
sum totalt pH3 positivt; alle celler i M-fase sum totale EdU positiv; alle celler i S-fase sum totalt WAPL-1 positiv;  alle celler i stamfar sone sum totale HIM-3 positiv; alle cellene i meiotic prophase

Tabell 1: klasser av kjerner. * Merk at 30 min og 4 h EdU eksperimenter varierer i tolkning. Lengre varighet EdU eksperimenter, celler har trolig kommet utover S-fase. Se introduksjon og trinn 8 for varigheten av EdU merking for aktuelle eksperimentet.

Cellen syklus del Operasjonell definisjon Beregning * Verdien **
Stamfar sonen kjerner alle WAPL-1 (eller REC-8) positive, HIM-3 negativ kjerner A + B + C + D 231 ± 23 kjerner
S-fase kjerner kjerner EdU positiv etter 30 min EdU etikett og WAPL-1 positiv A + C 133 ± 20 kjerner
M-fase kjerner pH3 og WAPL-1 co-positive kjerner A + B 5.2 ± 2.3 kjerner
S-fase indeks S-fase kjerner / stamfar sonen kjerner A + C / A + B + C + D 57% av cellen syklus
M-fase indeks M-fase kjerner / stamfar sonen kjerner A + B / A + B + C + D 2% av cellen syklus
Meiotic oppføring celler EdU merket atomkjerner i meiose E varierer etter EdU etikett
Meiotic oppføring pris Meiotic oppføring kjerner per h EdU etiketten Skråning figur 4 C *** 20,3 kjerner per h
G2 varighet (median) 50% skjæringspunkt fra Figure4A 2,5 t
G2 varighet (maksimum) 99% skjæringspunkt fra figur 4A 3,5 t
G2 + M + G1 varighet (maksimum) 99% skjæringspunkt fra figur 4B 3,5 t
Cellen varighet (median) Median G2 varighet / G2-indeks *** 6.5 h
Cellen varighet (maksimum) maksimal G2 varighet / G2-indeks *** 8.1 h

Tabell 2: cellen syklus beregninger. * Bokstaver representerer klassene av kjerner definert i tabell 1 og Figur 3. Beregninger er endret fra Fox et al. 20111. ** Verdier (± standardavvik) for vill-type hermafroditter reist ved 20 ° C alderen til 24 h innlegg midt-L4 scenen. Merk at siden y-skjæringspunktet skjæringspunktet ikke er null, en regresjon er nødvendig for en nøyaktig beregning av satsen for meiotic oppføring. G2-indeksen bestemmes ved å trekke S-fase indeks, M-fase indeksen, og omtrentlig G1-indeks (2%) fra 100%, som beskrevet av Fox et al. 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utarbeidelse av EdU-merket bakterier (trinn 1) er avgjørende for denne protokollen, og det første punktet for feilsøking. Vill-type unge voksne hermafroditter etikett veldig pålitelig i en 4 h EdU-puls, noe som gjør dette til en nyttig kontroll for hver nye batch EdU-merket bakterier. I tillegg vil intakt EdU-merket bakterier angir tarmen (i eldre dyr eller visse pharynx/jeksel defekt mutanter) merke med Klikk kjemi og vises som lyse avlang puncta i tarmen. En alternativ teknikk for merking hermafroditter bruker en "suge" høy konsentrasjon (1 mM) EdU3. Denne teknikken sulter dyrene for varigheten av merking, men gir en nyttig måte å omgå gjør EdU-merket bakterier ved feilsøking fiksering og klikk kjemi. Hvis en EdU "suge" eksperimentet er vellykket, mens en EdU-feed ikke er, deretter forberede frisk EdU-merket bakterier. For å nå en bakteriell tettheten mens også oppnå en høy EdU-innhold, må en justere konsentrasjonen av EdU og thymidine.

Den viktigste begrensningen av denne teknikken for merking av S-fase er i behovet for å mate EdU-merket bakterier til dyr. Dyr som ikke kan mate (på grunn av genotype eller etappen) kan ikke merkes med denne teknikken. Likevel nukleosid analogs er den eneste metoden å identifisere S-fase atomkjerner i C. elegans germline, og deres bruk krever ikke at noen effekter av transgener være til stede i dyr. I tillegg når innarbeidet, EdU forblir i kjerner som ut S-fase, gjennom cellen syklusen, deler, eller skille. Signalet svekker med halvparten hver celledeling. Dette gjør EdU perfekt for sporing en celle historie selv gjennom noen celledelinger.

Stabiliteten i EdU gjør puls-jage eksperimenter enkel; bare skyll overflødig EdU bakterier fra dyrene etter ønsket varighet pulsen er ferdig og overføre dyrene til umerkede bakterier. EdU forblir i DNA og forblir synlig selv etter flere celledelinger. Men er eksperimenter begrenset til én type S-fase etikett (en enkelt puls av EdU). Co merking med EdU og BrdU er mulig i pattedyrceller31 men ikke har blitt rapportert i C. elegans. Co merking av sprøytebruk og CldU brukes i pattedyr32 men også ikke har blitt rapportert i C. elegans.

De viktigste fordelene av EdU merking er at metoden krever ingen effekter av transgener, EdU kan bli matet til C. elegans under vanlige kultur, kjemi er kompatibel med immunofluorescent teknikker og EdU vedvarer i DNA lenge etter fôring stoppet. Disse funksjonene gjør EdU en stor verktøyet å studere mange aspekter av cellen syklus og bakterie celle dynamikken.

Cellen syklus og bakterie celle dynamics analyse med EdU kan brukes til en rekke problemstillinger. Bare noen få eksempler på ytterligere programmer av denne metoden: Hvordan endrer dynamikken i cellen syklus i dyr celle syklus genet mutasjoner? Hvordan påvirker fysiologiske forhold celle syklusen stamceller, frekvensen av bakterie celle inntreden i meiotic prophase og frekvensen av bakterie celle fremdrift gjennom meiotic prophase? Hvordan endrer cellen syklus larvestadiet? Hvordan påvirker store signalnettverk veien forstyrrelser celle syklusen, i tillegg til endringer i celle skjebnen (for eksempel ektopisk spredning)? Dette systemet kan endres for å studere hva cellene gjør i mange forskjellige forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til E. coli lager center for MG1693; Wormbase; Caenorhabditis genetikk sentrum som er finansiert av den nasjonale institutter for helse Office av forskning infrastruktur programmer (P40OD010440) for stammer; Zach Pincus for statistiske råd; Aiping Feng for reagenser; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar og John Brenner for trening, råd, støtte og nyttig diskusjon; og Kornfeld og Schedl laboratorier for tilbakemelding på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 til KK, R01 GM100756 til TS] og en National Science Foundation predoctoral fellesskap [DGE-1143954 og DGE-1745038 til ZK]. National Institutes of Health verken National Science Foundation ikke hadde noen rolle i utformingen av studien, innsamling, analyse og tolkning av data, eller skrive manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 140 C. elegans EdU S-fase celle syklus Germline meiotic S-fase M-fase G2-fase
Cellen syklus analyse i <em>C. elegans</em> Germline med Thymidine Analog EdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter