Summary
हम इमेजिंग के लिए एक vivo दो फोटॉन इमेजिंग प्रोटोकॉल में मौजूद नवजात चूहों के मस्तिष्क प्रांतस्था । इस विधि cortical ंयूरॉंस की विकासात्मक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है, आणविक तंत्र है कि नियंत्रण के न्यूरॉन गतिशीलता, और रोग मॉडलों में न्यूरॉन गतिशीलता में परिवर्तन.
Abstract
दो-फोटॉन इमेजिंग में vivo विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है स्तनधारी मस्तिष्क में न्यूरॉन सर्किट. हालांकि, vivo इमेजिंग तरीकों में से एक सीमित संख्या में जीवित नवजात स्तनधारियों के मस्तिष्क ऊतक की जांच के लिए मौजूद हैं । साथ ही हम नवजात चूहों रहने में इमेजिंग व्यक्तिगत cortical ंयूरॉंस के लिए एक प्रोटोकॉल संक्षेप । इस प्रोटोकॉल में निंनलिखित दो तरीके शामिल हैं: (1) विकासशील मस्तिष्क में विरल और cortical न्यूरॉन्स के उज्ज्वल लेबलिंग के लिए सुपरनोवा प्रणाली, और (2) नाजुक नवजात खोपड़ी के लिए एक शल्य प्रक्रिया । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ नवजात चरणों के दौरान व्यक्तिगत cortical neurites के लौकिक परिवर्तन के अवलोकन की अनुमति देता है । लेबल सेल विशिष्ट जीन मुंह बंद करने और नॉकआउट भी आरएनए हस्तक्षेप और CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रणालियों के साथ सुपरनोवा के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल कर सकते हैं, इस प्रकार, cortical ंयूरॉंस की विकासात्मक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आणविक तंत्र है कि नियंत्रण के न्यूरॉन गतिशीलता, और रोग मॉडल में न्यूरॉन गतिशीलता में परिवर्तन.
Introduction
सेरेब्रल प्रांतस्था में न्यूरॉन सर्किट की सटीक तारों धारणा, अनुभूति सहित उच्च मस्तिष्क कार्यों के लिए आवश्यक है, और सीखने और स्मृति. Cortical सर्किट गतिशील जन्मोत्तर विकास के दौरान परिष्कृत कर रहे हैं । अध्ययनों ने ऊतकवैज्ञानिक का उपयोग करते हुए cortical सर्किट गठन की प्रक्रिया की जांच की है और इन विट्रो संस्कृति का विश्लेषण किया है । हालांकि, रहने वाले स्तनधारियों में सर्किट गठन की गतिशीलता ज्यादातर बेरोज़गार बनी हुई है ।
दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से वयस्क माउस मस्तिष्क1,2में न्यूरॉन सर्किट के vivo विश्लेषण में के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, तकनीकी चुनौतियों के कारण, केवल अध्ययनों की एक सीमित संख्या नवजात चूहों में न्यूरॉन सर्किट गठन को संबोधित किया है. उदाहरण के लिए, Carrillo एट अल. सेरिबैलम में दूसरे जन्मोत्तर सप्ताह3में फाइबर चढ़ाई के समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन किया । Portera-Cailliau एट अल. पहले जन्मोत्तर4सप्ताह में cortical परत 1 में axons के इमेजिंग की सूचना दी । वर्तमान अध्ययन में, हम 4 cortical न्यूरॉन्स और नवजात चूहों में उनके dendrites परत के अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल संक्षेप. इस प्रोटोकॉल है, जो दो के तरीके में शामिल है, आवेदन द्वारा प्राप्त परिणाम हमारे हाल ही में5प्रकाशन में सूचित कर रहे हैं । सबसे पहले, हम सुपरनोवा वेक्टर प्रणाली5,6 नवजात मस्तिष्क में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए का उपयोग करें । सुपरनोवा प्रणाली में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे है और विनिमय करने वाले सेल विशिष्ट जीन पछाड़ना और संपादन/पीटकर विश्लेषण भी संभव है । दूसरा, हम नाजुक नवजात चूहों में कपाल खिड़की तैयारी के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन । साथ में, इन तरीकों के नवजात दिमाग में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की vivo प्रेक्षण में अनुमति देते हैं ।
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Protocol
प्रयोगकर्ता संस्था द्वारा निर्धारित पशु कल्याण दिशानिर्देशों के अनुसार प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
1. इमेजिंग के लिए पिल्ले की तैयारी
नोट: के साथ पिल्ले विरल लेबल cortical न्यूरॉन्स द्वारा प्राप्त किया जा सकता utero electroporation (IUE) में सुपरनोवा वैक्टर5,6. सुपरनोवा प्रणाली में निम्नलिखित दो वैक्टर होते हैं: TRE-Cre और सीएजी-loxP-स्टॉप-loxP-जीन एक्स-आयरेस-tTA-WPRE. इस प्रणाली में, विरल लेबलिंग TRE रिसाव पर निर्भर करता है । transfected न्यूरॉन्स की एक विरल जनसंख्या में, TRE Cre और tTA की कमजोर अभिव्यक्ति ड्राइव. बाद में, केवल इन कोशिकाओं में, जीन एक्स की अभिव्यक्ति tTA-TRE चक्र की एक सकारात्मक प्रतिक्रिया द्वारा सुविधा है. प्राप्त विरल और उज्ज्वल लेबल vivo मेंव्यक्तिगत ंयूरॉंस के रूपात्मक विवरण के दृश्य की अनुमति देता है । IUE प्रक्रिया का विवरण इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है क्योंकि वे कहीं वर्णित किया गया है7,8,9,10,11।
- IUE के लिए समय पर गर्भवती चूहों तैयार.
- IUE के लिए डीएनए सॉल्यूशन तैयार करें । आरएफपी के साथ लेबलिंग स्पार्स के लिए, pK031 युक्त समाधान का उपयोग करें: TRE-Cre (5 एनजी/µ एल) और pK029: सीएजी-loxP-स्टॉप-loxP-आरएफपी-आयरेस-tTA-WPRE (1 µ g/µ l) या pK031 युक्त समाधान: TRE-Cre (5 एनजी/µ l) और pK273: सीएजी-loxP-रोक-loxP-CyRFP-आयरेस-tTA-WPRE (1 µ g/µ l).
नोट: विभिंन प्रोटीन वैक्टर के विभिंन संयोजनों का उपयोग कर लेबल ंयूरॉंस में व्यक्त किया जा सकता है । इसके अलावा, विभिन्न जीन खटखटाया जा सकता है-नीचे या खटखटाया-बाहर विशेष रूप से लेबल कोशिकाओं में5,6 (जैसे, सुपरनोवा प्रणाली के लिए वैक्टर की एक श्रृंखला आरआईकेईएन से उपलब्ध हैं संसाधन अनुसंधान केंद्र और Addgene से). - cortical न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए नियमित IUE7,8,9,10,11 निष्पादित करें । परत 4 ंयूरॉंस के लेबल के लिए, भ्रूण दिवस-14 भ्रूण का उपयोग करें ।
- पिल्ला वितरण और विकास के लिए रुको ।
2. सर्जरी
- Anesthetize जन्मोत्तर दिन-5 (P5) isoflurane गैस का उपयोग पिल्ला (१.०%) । संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करने के लिए एक पूंछ चुटकी परीक्षण प्रदर्शन. यदि पिल्ला चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया करता है, isoflurane एकाग्रता में वृद्धि (अप करने के लिए २.०%) या प्रतीक्षा जब तक प्रतिक्रिया गायब हो जाता है । एक हीटिंग पैड का उपयोग सर्जरी के दौरान पिल्ला के शरीर का तापमान बनाए रखें ।
- चमड़े के नीचे एक एनाल्जेसिक सुई (carprofen, 5 मिलीग्राम/
- यह ७०% इथेनॉल तीन बार के साथ पोंछते से खोपड़ी को कवर पिल्ला त्वचा निष्फल ।
- ७०% इथेनॉल (आंकड़ा 1a) के साथ निष्फल कैंची का उपयोग खोपड़ी को कवर त्वचा के लगभग 20 मिमी2 निकालें.
- निष्फल संदंश और एक साफ, बाँझ कपास झाड़ू (आंकड़ा 1a) का उपयोग कर खोपड़ी के प्रावरणी निकालें.
- लागू ऊतक चिपकने वाला incised त्वचा की सतह के लिए युक्तियां लदान का उपयोग कर रक्तस्राव को रोकने के । लागू नहीं ऊतक इमेजिंग क्षेत्र (आंकड़ा 1b) के लिए चिपकने वाला है क्योंकि यह खोपड़ी के उद्घाटन अधिक कठिन बना देता है ।
- एक हीटिंग पैड (३७ डिग्री सेल्सियस) पर पिल्ला प्लेस और यह संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देते हैं । रुको जब तक ऊतक चिपकने वाला सूख गया है और जम (लगभग 30 मिनट) ।
- यदि आवश्यक हो, लागू अधिक ऊतक चिपकने वाला है और यह शुष्क और जमना के लिए रुको ।
3. कपाल खिड़की की तैयारी
- Anesthetize isoflurane का उपयोग कर पिल्ला (१.०%-२.०%) और एक पूंछ चुटकी परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण स्तर की जांच करें ।
- ध्यान से एक निष्फल उस्तरा ब्लेड (व्यास में 1 मिमी) बरकरार छोड़ (चित्रा 1C) के साथ खोपड़ी खुला । एक जिलेटिन स्पंज का प्रयोग करें (छोटे टुकड़ों में कटौती, लगभग < 2 mm3, निष्फल कैंची का उपयोग कर, और उंहें चिमटी का उपयोग कर लागू) प्रांतस्था बफर में लथपथ12 (१२५ mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 10 mmol/l ग्लूकोज, 10 mmol/l HEPES, 2 mmol/l CaCl2 , और 2 mmol/L MgSO4; pH ७.४; ३०० mOsm/L; कमरे के तापमान) रक्तस्राव को रोकने के लिए । खोपड़ी खोलते समय, मस्तिष्क की सतह नम रखने के लिए एक प्रांतस्था बफर लागू करें ।
- ड्युल सतह से किसी भी बफर और रक्त एक जिलेटिन स्पंज का उपयोग कर निकालें । लागू करें १.०% कम पिघलने बिंदु agarose की एक पतली परत (प्रांतस्था बफर में भंग) पीले सुझावों का उपयोग कर । एक गर्मी ब्लॉक मशीन का प्रयोग, 42 डिग्री सेल्सियस पर agarose समाधान के तापमान को बनाए रखने के आवेदन तक ।
नोट: बफर और खून की निकासी के लिए craniotomy की तरफ से प्रदर्शन करना होगा जबकि ध्यान रहे कि ड्राई जिलेटिन स्पंज बाडी के संपर्क में न आए । ऐसा करने में नाकाम बाडी को नुकसान हो सकता है । - agarose जेल परत पर एक दौर ग्लास coverslip (व्यास में नंबर 1, 3 मिमी) लागू करें । coverslip और agarose जेल परत के बीच सभी बुलबुले निकालें उन दोनों के बीच agarose जेल की एक अतिरिक्त डाल द्वारा । चिमटी (चित्रा 1 डी और 1E) का उपयोग कर coverslip के नीचे से फैला हुआ अतिरिक्त जेल निकालें ।
- डेंटल सीमेंट (फिगर 1F) का उपयोग कर coverslip को सुरक्षित करे ।
- सीमेंट पाउडर और सीमेंट तरल मिलाएं । लागू पीले सुझावों का उपयोग कर मिश्रण से पहले यह जम जाता है । इस बाडी पर डेंटल सीमेंट को लागू न करें, क्योंकि इससे ब्रेन को नुकसान हो सकता है ।
- एक बाँझ टाइटेनियम बार देते हैं (कस्टम बनाया, लगभग 30 मिलीग्राम, चित्र 1Gदेखें) कपालीय हड्डी पर दंत सीमेंट का उपयोग कर. टाइटेनियम पट्टी और coverslip (बाडी की सतह पर) के समानांतर आसानी से छवियों पर कब्जा करने के लिए संरेखित करें ।
- दंत सीमेंट (चित्रा ज) के साथ उजागर खोपड़ी को कवर ।
- संज्ञाहरण से पिल्ला पुनर्प्राप्त । यह एक हीटर (३७ ° c) पर रखें जब तक दंत सीमेंट जम गया है (1 ज) ।
4. दो-फोटॉन इमेजिंग
नोट: चित्र 2 में vivo छवियों में एक टाइटेनियम-नीलमणि लेजर (बीम व्यास [1/e2]2: १.२ मिमी) के साथ एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया ।
- दो-फोटॉन लेजर तरंग दैर्ध्य सेट करें । आरएफपी उत्तेजना के लिए, १,००० एनएम का उपयोग करें (४५० मेगावाट/mm2 गहराई के ४०० µm पर) ।
नोट: लेजर शक्ति के रूप में कम किया जाना चाहिए z-स्थिति ऊपर ले जाता है । - ७०% इथेनॉल के साथ coverslip की सतह पोंछ ।
- Anesthetize isoflurane (१.५%-२.०%) का उपयोग कर पिल्ला और एक पूंछ चुटकी परीक्षण का उपयोग संज्ञाहरण स्तर की जांच करें ।
- पिल्ला सिर पर एक टाइटेनियम पट्टी का उपयोग इमेजिंग मंच पर टाइटेनियम प्लेट के लिए पिल्ला संलग्न (चित्रा 2a और बी b). इस तरह के सिर को समायोजित करें कि coverslip goniometer मंच (चित्रा बी) का उपयोग उद्देश्य लेंस के समानांतर है । एक हीटिंग पैड (३७ डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर पिल्ला के शरीर का तापमान बनाए रखें ।
- ०.७%-१.०% करने के लिए isoflurane एकाग्रता सेट करें ।
नोट: एक बहुत उच्च isoflurane एकाग्रता इमेजिंग के दौरान पिल्ला के आकस्मिक मौत का कारण हो सकता है । - दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी और 2c) के उद्देश्य लेंस (20X, NA १.०) के तहत इमेजिंग चरण रखें ।
- coverslip पर पानी की एक बूंद लागू करें । इस क्षेत्र में जहां बाडी उजागर किया गया है फ्लोरोसेंट प्रोटीन-लेबल वाले न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए महामारी-प्रतिदीप्ति का प्रयोग करें ।
- १.४-µm के अंतराल पर z-स्टैक छवियां प्राप्त करना । परत के लिए 4 ंयूरॉन इमेजिंग, z-चौड़ाई सेट करने के लिए १५०-३०० µm छवि के लिए पूरे वृक्ष आकृति विज्ञान (चित्रा 2d और 2E) । धीमी गति से स्कैनिंग का प्रयोग करें और स्पष्ट छवियों को दिखाने के लिए औसत न्यूरॉन आकृति विज्ञान (यह आमतौर पर लेता है > 20 मिनट पूरे वृक्ष आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए).
नोट: इमेजिंग के लिए निम्न पैरामीटर्स अनुशंसित हैं । उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: १,००० एनएम, स्कैनर: गैल्वेनोमीटर प्रकार, dichroic मिरर: ६९० एनएम, उत्सर्जन फिल्टर: ५७५-६२० एनएम bandpass, डिटेक्टर: GaAsP प्रकार, लाभ सेटिंग > १००, छवि आकार > ५१२ x ५१२ µm, दृश्य के क्षेत्र > ६०० x ६०० µm, पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन < १.२ µm ।
5. रिकवरी और नर्सिंग
- इमेजिंग मंच से पिल्ला अलग ।
- एक हीटर (३७ डिग्री सेल्सियस) पर पिल्ला प्लेस और यह (15 मिनट) को ठीक करने की अनुमति ।
- 2-एच अंतराल पर एक micropipette का उपयोग करने और धीरे से उत्सर्जन की अनुमति के लिए पेट उत्तेजित करने के लिए पिल्ला गर्म दूध फ़ीड । पुष्टि करें कि पिल्ला अपने शरीर के वजन को मापने के द्वारा दूध पी रहा है ।
6. री-इमेजिंग
- Anesthetize isoflurane के साथ पिल्ला (१.५%-२.०%), और एक पूंछ चुटकी परीक्षण का उपयोग संज्ञाहरण स्तर की जांच करें । इसे इमेजिंग चरण में अनुलग्न करें ।
- पहले imaged ंयूरॉंस की स्थिति जानें और एक जेड-ढेर छवि प्राप्त । न्यूरॉन्स की पहचान सुपरनोवा के साथ लेबलिंग उनके विरल के कारण आसान है.
- चरण ५.१-६.२ इमेजिंग पूर्ण होने तक दोहराएँ । नोट: पिल्ला वजन खोने के बिना 18 घंटे तक imaged किया जा सकता है ।
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Representative Results
आंकड़े 2d - 2F दिखाने के प्रतिनिधि परिणाम दो-फोटॉन समय चूक परत के इमेजिंग 4 cortical वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग ंयूरॉंस । विश्लेषण के प्रयोजन के लिए, इमेजिंग अवधि के दौरान स्पष्ट वृक्ष आकृति विज्ञान के साथ न्यूरॉन्स का चयन करें. हम रूपात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि ंयूरॉंस के वृक्ष आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया । प्रतिनिधि वृक्ष आकृति विज्ञान पुनर्निर्माण चित्रा 2Fमें दिखाया गया है । न्यूरॉन्स दिखा डिस्कनेक्ट dendrites (चित्रा 2 जी) विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए, क्योंकि डिस्कनेक्ट dendrites सर्जरी या इमेजिंग के दौरान क्षति से प्रेरित कोशिका मौत का संकेत. इसके अलावा, धुंधले वृक्ष युक्तियों के साथ ंयूरॉंस को बाहर रखा जाना चाहिए (जैसे, चित्रा 2dमें arrowhead के साथ ंयूरॉन) ।
चित्रा 1: सर्जरी, कपाल खिड़की की तैयारी, और टाइटेनियम बार के लगाव । (क) इस पैनल खोपड़ी को कवर त्वचा को हटाने का पता चलता है । (ख) यह पैनल त्वचा और खोपड़ी के बीच अंतर के निर्धारण को दर्शाता है । इमेजिंग क्षेत्र में बांड को लागू नहीं करने के लिए सावधान रहें । (ग) यह अल्पायु बाडी की एक छवि है । एक उस्तरा ब्लेड खोपड़ी और बाडी के बीच डाला गया था, और खोपड़ी उजागर क्षेत्र (arrowhead) के बाईं ओर खुला फड़फड़ाया था । इसके बाद संदंश का इस्तेमाल कर हड्डी को आसानी से निकाला जा सकता है । (घ) यह एक योजनाबद्ध कपाल खिड़की के एक ऊर्ध्वाधर दृश्य दिखा डिजाइन है । कवर ग्लास और बाडी के बीच का गैप agarose जेल की पतली परत से भरा होता है । coverslip दंत सीमेंट का उपयोग खोपड़ी के लिए तय हो गई है । (ङ) एक गोल आकार का coverslip agarose जेल परत पर रखा गया है. (च) यह सुरक्षित coverslip की एक छवि है । (छ) यह पैनल टाइटेनियम बार के डिजाइन को दिखाता है । टाइटेनियम बार इमेजिंग चरण के लिए लगाव के लिए दो पेंच छेद शामिल है ( चित्रा 2देखें) और एक फ्लैट आयताकार हिस्सा है कि पिल्ला सिर से जुड़ा हुआ है । (ज) टाइटेनियम पट्टी का आयताकार भाग दंत सीमेंट के प्रयोग से पिल्ला की खोपड़ी से जुड़ा होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: vivo में दो-नवजात चूहों में cortical न्यूरॉन्स की फोटॉन इमेजिंग. (क) यह पैनल टाइटेनियम प्लेट के डिजाइन को दिखाता है । टाइटेनियम प्लेट goniometer चरण संलग्न करने के लिए टाइटेनियम पट्टी और चार पेंच छेद संलग्न करने के लिए दो पेंच छेद है, जो इमेजिंग मंच पर रखा गया है । २.५ मिमी (व्यास में) x 2 मिमी (लंबाई में) शिकंजा निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है. (ख) यह इमेजिंग मंच से जुड़े पिल्ला की एक प्रतिनिधि छवि है । पिल्ला शरीर का तापमान एक हीटर का उपयोग कर बनाए रखा है । (ग) पिल्ला anesthetized इमेजिंग प्रक्रिया में के दौरान isoflurane का उपयोग कर रहा है । (घ) इस पैनल के एक प्रतिनिधि Z-ढेर समय एक P5 पिल्ला की परत 4 cortical ंयूरॉंस की छवि को दर्शाता है । arrowhead धुंधला dendrites के साथ न्यूरॉन को इंगित करता है, जो विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए । (ङ) इस पैनल पैनल डीमें तीर के साथ ंयूरॉन के उच्च आवर्धन समय चूक छवियों से पता चलता है । ब्लू ऐरोहेड: वृक्ष टिप्स जो ४.५ ज, येलो ऐरोहेड में घटाई गई हैं: वृक्ष टिप्स जो ४.५ एच, स्माल वाइट ऐरोहेड: axon एक पड़ोसी कोशिका में लम्बित हैं । (च) पैनल ईके बाएं फिगर में न्यूरॉन के वृक्ष स्ट्रेस का यह 3-डी मॉडल है । नीला वृत कक्ष के शरीर की स्थिति को इंगित करता है । (छ) इस पैनल के साथ प्रतिनिधि ंयूरॉंस दिखाता है डिस्कनेक्ट dendrites, जो विश्लेषण में शामिल नहीं हैं । पैनल डी जी में नमूना डेटा NR1 (मोर्फिन प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर की एक अनिवार्य उपइकाई)-(लेखकों से उपलब्ध सीमित डेटा के कारण)-बाहर खटखटाया न्यूरॉन्स होते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
प्रोटोकॉल और समस्या निवारण में महत्वपूर्ण चरण:
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम खोपड़ी (प्रोटोकॉल चरण ३.२) को हटाने की है । प्रविष्टि पर, उस्तरा ब्लेड अक्सर बाडी का पालन करता है, ड्युल खून बह रहा है और मस्तिष्क को नुकसान के कारण । इस खोपड़ी पर प्रांतस्था बफर की एक बूंद जोड़ने और प्रांतस्था बफर में खोपड़ी को हटाने से बचा जा सकता है ।
बाडी और कपाल खिड़की की तैयारी के बाद त्वचा से खून बह रहा है खिड़की के रोड़ा की ओर जाता है । इससे बचने के लिए, ऊतक चिपकने वाला और दंत इस्तेमाल किया सीमेंट अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से शुष्क करने की अनुमति दी जानी चाहिए । एक कपाल खिड़की के साथ एकाधिक पिल्ले के बाद से यह पूरी तरह से रक्तस्राव से बचने के लिए मुश्किल है तैयार किया जाना चाहिए । आम तौर पर, यदि कपाल खिड़की स्पष्ट और स्थिर 2-3 एच पोस्ट सर्जरी के लिए रहता है, पिल्ला समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व:
यहां, हम के लिए एक विधि वर्णित है vivo दो-नवजात प्रांतस्था के फोटॉन इमेजिंग । इस प्रोटोकॉल पहले रिपोर्ट की गई विधियों के साथ तुलना में कई गुण है । ये निंनानुसार सूचीबद्ध हैं ।
1) Cortical न्यूरॉन्स transfecting सुपरनोवा वैक्टर IUE का उपयोग करके विरल और चमकीले लेबल किया जा सकता है. IUE व्यापक रूप से विकासशील चरणों के दौरान cortical ंयूरॉंस के लेबल के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, एक साधारण IUE अलग ंयूरॉंस के इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त के बाद से ंयूरॉंस भी घनी7,8,9,10लेबल किया जा सकता है । इसके अलावा, सुपरनोवा प्रणाली का उपयोग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विभिंन प्रकार के न्यूरॉन्स की विरल आबादी लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, सुपरनोवा-मध्यस्थता स्पार्स लेबलिंग का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड कैल्शियम सूचक GCaMP13,14, हम हाल ही में विकासशील प्रांतस्था परत 4 में व्यक्तिगत ंयूरॉंस के एक कार्यात्मक विश्लेषण किया है (पी 3 पी P13) 15.
2) इस अध्ययन में वर्णित विधि elucidating आणविक तंत्र अंतर्निहित न्यूरॉन सर्किट विकास के लिए उपयुक्त है । सुपरनोवा प्रणाली विरल किसी भी जीन के सेल विशिष्ट नॉकआउट लेबल की अनुमति देता है । इस प्रकार, एक विशिष्ट जीन व्यवधान युक्त ंयूरॉन की गतिशीलता मनाया जा सकता है । इस प्रयोजन के लिए, आनुवंशिकी आधारित प्रणालियों जैसे MADM16 और चालाक17 पहले सूचित किया गया है । हालांकि, क्योंकि माउस लाइनों के प्रजनन इन प्रणालियों के लिए आवश्यक है, वे अधिक समय और लागत प्रोटोकॉल से यहां वर्णित की आवश्यकता है ।
3) इस अध्ययन खोपड़ी हटाने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का इस्तेमाल करता है । इस बाडी से रक्तस्राव को कम करता है और खोपड़ी के एक विस्तृत क्षेत्र (व्यास में < 2 mm) के उद्घाटन की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया का प्रयोग, यह somatosensory प्रांतस्था15के भीतर पूरे बड़े बैरल क्षेत्र में परत 4 ंयूरॉंस की सहज गतिविधि का पालन संभव था ।
विधि की सीमाएं:
vivo इमेजिंग में माउस नवजात मस्तिष्क का एक नुकसान, ऐसे zebrafish लार्वा और Xenopus tadpoles के रूप में पारदर्शी जानवरों की इमेजिंग के साथ तुलना में, कम स्थानिक और लौकिक संकल्प है । धीमी गति से स्कैनिंग और औसत करने के लिए किया जाना चाहिए स्पष्ट छवियों के उपज के लिए ंयूरॉन आकृति विज्ञान क्योंकि अधिक प्रकाश बिखरने माउस मस्तिष्क में होता है. प्रकाश बिखरने संभवतः फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजना और अब प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रोटीन के लिए एक लंबी तरंग दैर्ध्य लेजर का उपयोग कम हो सकता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल की एक और सीमा हो सकता है कि कपाल खिड़की आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा के कारण मस्तिष्क की सूजन12एक सामांय cortical सर्किट के गठन को प्रभावित कर सकता है । हालांकि, वहां एक उच्च संभावना है कि vivo इमेजिंग में और अधिक के साथ की तुलना में शारीरिक है इन विट्रो इमेजिंग के रूप में मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी है, जो भी ischemia और टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा गंभीर सूजन को जंम देना चाहिए की समय चूक इमेजिंग । यह भी बताया गया है कि isoflurane को दोहराए जोखिम कई ंयूरॉंस प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है18। नियंत्रण प्रयोगों vivo इमेजिंग में द्वारा प्राप्त परिणामों की उपयुक्तता की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए । somatosensory प्रांतस्था में परत 4 न्यूरॉन्स के हमारे इमेजिंग के मामले में, हम कुल वृक्ष लंबाई और कंटीला तारामय न्यूरॉन्स5,20के वृक्ष अनुमानों के अभिविन्यास पूर्वाग्रह के अधिग्रहण में एक सामान्य वृद्धि की पुष्टि की.
हाल के अध्ययनों की रिपोर्ट > 1-mm-एक वयस्क माउस मस्तिष्क में गहराई इमेजिंग जिसमें सर्जरी के दौरान19को बाडी निकाली गई । दूसरी ओर, हम नवजात शिशुओं5में ४००-µm-गहराई इमेजिंग करने के लिए रिपोर्ट करने में सक्षम है । चूंकि बाडी को नवजात शिशुओं में नहीं हटाया जा सकता और यह, बदले में, एक उच्च प्रकाश बिखरने की ओर ले जाता है, हम मानते है कि नवजात शिशुओं में गहरी इमेजिंग वयस्कों की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है । फ्लोरोसेंट जांच, पराबैंगनीकिरण में भविष्य में सुधार, और डिटेक्टरों नवजात दिमाग में गहरी इमेजिंग की अनुमति चाहिए ।
इस प्रकार अब तक, हम 18 घंटे की समय चूक इमेजिंग वर्तमान प्रोटोकॉल5का उपयोग कर सूचित किया है । हाल ही में, हम प्रोटोकॉल20में सुधार के द्वारा ७२ घंटे की समय चूक इमेजिंग में सफल रहा है । हम यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को परिष्कृत करने के लिए जारी रहेगा (जैसे, अब अवधि, उच्च समय, और/या स्थानिक संकल्प इमेजिंग) न्यूरॉन सर्किट विकास के गतिशील तंत्र का खुलासा करने के लिए.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों ने अपनी तकनीकी सहायता के लिए टी. सातो, एम. Kanbayashi, और एस Kouyama का शुक्रिया अदा किया । यह काम JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP15K14322 और JP16H06143, टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन, उएहारा मेमोरियल फाउंडेशन, और नीगाटा विश्वविद्यालय ब्रेन रिसर्च इंस्टीट्यूट 2017-2923 (H.M.) के सहयोगी अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था और द्वारा KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, और JP15H04263 और अनुदान नवाचार क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान में "स्क्रैप और निर्माण प्रणाली द्वारा मस्तिष्क समारोह के गतिशील विनियमन" (JP16H06459) से MEXT (तिवारी) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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