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Neuroscience

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58340

Summary

Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.

Abstract

Zwei-Photon Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die in-Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn von Säugetieren. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von in Vivo bildgebende Verfahren für die Prüfung des Hirngewebes live Neugeborenen Säugetiere. Hier fassen wir ein Protokoll zur Aufnahme einzelner kortikaler Neuronen in lebenden Neugeborenen Mäusen. Dieses Protokoll enthält die folgenden beiden Methoden: (1) der Supernova-System zur spärlich und helle Beschriftung der kortikalen Neuronen in das sich entwickelnde Gehirn und (2) ein chirurgischer Eingriff für die fragile neonatale Schädel. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung des zeitlichen Veränderungen der einzelnen kortikalen Neuriten in neonatale Phase mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Beschriftete Zelle-spezifischen gen-silencing und Knockout können auch erreicht werden, indem die Supernova mit RNA-Interferenz und CRISPR/Cas9 gen Schnittsysteme. Dieses Protokoll kann so verwendet werden, für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen zu kontrollieren.

Introduction

Die genaue Verdrahtung von neuronalen Schaltkreisen in der Großhirnrinde ist unerlässlich für die höheren Hirnfunktionen wie Wahrnehmung, Kognition, und lernen und Gedächtnis. Kortikale Schaltungen werden während der postnatalen Entwicklung dynamisch verfeinert. Studien haben den Prozess der kortikalen Schaltung Bildung mit histologischen und in-vitro- Kultur-Analysen untersucht. Allerdings hat die Dynamik der Schaltung Bildung in lebenden Säugetieren meist unerforscht.

Zwei-Photonen-Mikroskopie hat für die in Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn Erwachsener Mäuse1,2verbreitet worden. Aufgrund technischen Herausforderungen, haben jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Studien neuronale Schaltkreis Bildung bei Neugeborenen Mäusen angesprochen. Carrillo Et Al. durchgeführt zum Beispiel die Zeitraffer-Bildgebung des Kletterns Fasern im Kleinhirn im zweiten postnatalen Woche3. Tür-Cailliau Et Al. berichteten die Bildgebung der Axone in kortikalen Schicht 1 in der ersten postnatalen Woche4. In der vorliegenden Studie fassen wir ein Protokoll für die Beobachtung der Schicht 4 kortikalen Neuronen und ihre Dendriten bei Neugeborenen Mäusen. Ergebnisse, die durch die Anwendung dieses Protokolls, die zwei Methoden umfasst, werden in unseren jüngsten Veröffentlichung5gemeldet. Erstens verwenden wir die Supernova Vektor System5,6 zur Kennzeichnung einzelner Neuronen im neonatalen Gehirn. Im Supernova System fluoreszierende Proteine verwendet für die neuronale Kennzeichnung sind austauschbar und beschriftete Zelle-spezifischen gen-Knockdown und Bearbeitung/ko Analysen sind ebenfalls möglich. Zweitens, beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff für die Vorbereitung der kranialen Fenster in fragilen Neugeborenen Mäusen. Zusammen ermöglichen diese Methoden die in Vivo -Beobachtung von einzelnen Neuronen im neonatalen Gehirn.

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Protocol

Experimente sollten gemäß den Tierschutz-Richtlinien vorgeschrieben durch den Experimentator Institution durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Welpen für die Bildgebung

Anmerkung: Welpen mit spärlich beschrifteten kortikale Neuronen in Utero Elektroporation (IUE) Supernova Vektoren5,6erhalten Sie durch. Das Supernova-System besteht aus den folgenden beiden Vektoren: TRE-Cre und CAG-LoxP-STOP-LoxP-Gene X-Ires-tTA-WPRE. In diesem System setzt die spärlich Kennzeichnung auf TRE Leckage. In einem dünn besiedelten transfizierten Neuronen treibt TRE den schwachen Ausdruck von Cre und tTA. Anschließend wird nur in diesen Zellen die Expression des Gens X durch ein positives Feedback der tTA-TRE Zyklen erleichtert. Die erzielten spärlich und hellen Kennzeichnung ermöglicht die Visualisierung der morphologischen Details von einzelnen Neuronen in Vivo. Einzelheiten des Verfahrens IUE nicht beschrieben werden an anderer Stelle beschrieben dieses Protokoll, da diese wurden7,8,9,10,11.

  1. IUE timed-schwangeren Mäusen vorbereiten.
  2. Bereiten Sie eine DNA-Lösung für IUE. Für die spärliche Beschriftung mit RFP, verwenden Sie eine Lösung mit pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) und pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) oder einer Lösung, die pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) und pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
    Hinweis: Verschiedene Proteine können in den beschrifteten Neuronen mit unterschiedlichen Kombinationen von Vektoren ausgedrückt werden. Auch verschiedene Gene können angeliefert oder herausgetrennten speziell in beschrifteten Zellen5,6 (z. B.eine Reihe von Vektoren für die Supernova-System sind aus RIKEN BioResource Research Center und Addgene).
  3. Führen Sie regelmäßige IUE7,8,9,10,11 um kortikale Neuronen zu beschriften. Verwenden Sie für die Kennzeichnung der Schicht 4 Neuronen, embryonale 14. Tag Embryonen.
  4. Warten Sie auf Welpen Lieferung und Wachstum.

2. Operation

  1. Die postnatalen Tag 5 (P5) Welpen mit Isofluran Gas (1,0 %) zu betäuben. Durchführen Sie einen Tail-Prise Test überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie. Wenn der Welpe auf die Prise reagiert, die Isofluran Konzentration erhöhen (bis zu 2,0 %) oder warten, bis die Antwort verschwindet. Pflegen Sie die Pup Körpertemperatur während der Operation mit einem Heizkissen.
  2. Analgetikum (Carprofen, 5 mg/kg) subkutan zu injizieren.
  3. Der Welpe Haut des Schädels durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol dreimal zu sterilisieren.
  4. Entfernen Sie etwa 20 mm2 der Haut über den Schädel mit einer Schere mit 70 % igem Ethanol (Abbildung 1A) sterilisiert.
  5. Entfernen Sie die Faszie des Schädels mit sterilisierte Pinzette und ein sauberes, steriles Wattestäbchen (Abbildung 1A).
  6. Gewebe-Adhäsiv mit Beladung Tipps zur eingeschnittenen Hautoberfläche, um die Blutung zu stoppen. Gelten Sie Gewebe-Klebeband nicht für die imaging-Bereich (Abbildung 1 b), weil dies die Öffnung des Schädels erschwert.
  7. Der Welpe auf ein Heizkissen (37 ° C) und lassen Sie es aus der Narkose zu erholen. Warten Sie, bis die Gewebe-Klebeband ist getrocknet und verfestigt (ca. 30 min).
  8. Falls erforderlich, tragen Sie mehr Gewebe Klebstoff auf und warten Sie, bis es zu trocknen und zu festigen.

(3) kranialen Fenster Vorbereitung

  1. Betäuben Sie der Welpe mit Isofluran (1,0-2,0 %) zu und kontrollieren Sie die Narkose-Ebene Schweif kneiftest.
  2. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel mit einer sterilisierten Rasierklinge verlassen die Dura intakt (1 mm Durchmesser) (Abbildung 1). Verwenden Sie einen Schwamm Gelatine (in kleine Stücke schneiden, etwa 2 mm <3, mit einer sterilisierten Schere, und wenden Sie sie mit einer Pinzette) getränkt in Kortex Puffer12 (125 Mmol/L NaCl, 5 Mmol/L KCl, 10 Mmol/L Glucose, 10 Mmol/L HEPES, 2 Mmol/L CaCl2 , und 2 Mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; Raumtemperatur) um die Blutung zu stoppen. Wenn Sie den Schädel öffnen, gelten Sie einen Cortex-Puffer, um das Gehirn Oberfläche feucht zu halten.
  3. Entfernen Sie Puffer und Blut aus der duralen Oberfläche mit einem Gelatine-Schwamm. Gelten Sie eine dünne Schicht von 1,0 % niedriger Schmelzpunkt Agarose (aufgelöst im Kortex Puffer) mit gelben Tipps. Behalten Sie die Temperatur der Agarose-Lösung bei 42° C mit einer Wärme-Block-Maschine, bis Anwendung.
    Hinweis: Die Trockenlegung des Puffers und Blut muss seitens des Kraniotomie während die Pflege durchgeführt werden, das trockene Gelatine Schwamm nicht in Kontakt mit der Dura kommt. Andernfalls kann die Dura beschädigt werden.
  4. Eine Runde Glas-Deckglas (Nr. 1, 3 mm im Durchmesser) auf die Agarose-Gel-Schicht auftragen. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Deckglas und der Agarose-Gel-Schicht durch ein Übermaß an Agarosegel dazwischen Gießen. Entfernen Sie das überschüssige Gel hervorstehende unter dem Deckglas mit einer Pinzette (Abbildung 1 und 1E).
  5. Sichern Sie das Deckglas mit dental Zement (Abb. 1F).
  6. Mischen Sie das Zementpulver und Flüssigkeit Zement. Übernehmen Sie die Mischung mit gelben Spitzen, bevor es verfestigt wird. Gelten Sie dental Zement auf der Dura, nicht, da dies das Gehirn schädigen kann.
  7. Legen Sie eine sterile Titan bar (Sonderanfertigung, ca. 30 mg, siehe Abbildung 1) auf die Schädelknochen mit dental Zement. Richten Sie die Titan-Bar und das Deckglas (auf der Oberfläche der Dura) parallel, Bilder zu erfassen.
  8. Decken Sie den freigelegten Schädel mit dental Zement (Abbildung 1 H).
  9. Der Welpe aus der Narkose zu erholen. Halten Sie es auf eine Heizung (37 ° C), bis der dental Zement (1 h) erstarrt ist.

4. zwei-Photon Imaging

Hinweis: Die in-Vivo -Bilder in Abbildung 2 erworben wurden mit einem zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Titan-Saphir-Laser (beam Durchmesser [1/e2]2: 1,2 mm).

  1. Legen Sie die zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge. RFP Erregung, Nutzung 1.000 nm (450 mW/mm2 400 µm Tiefe).
    Hinweis: Die Laserleistung sollte reduziert werden, als die Z-Position sich bewegt.
  2. Wischen Sie die Oberfläche des Deckglases mit 70 % Ethanol.
  3. Der Welpe mit Isofluran (1,5-2,0 %) zu betäuben und Anästhesie mit einem Heck-Pinch-Test überprüfen.
  4. Befestigen Sie die Welpen die Titanplatte am der bildgebenden Bühne mit einer Titan-Bar auf der Welpe Kopf (Abb. 2A und 2 b). Passen Sie den Kopf, so dass das Deckglas ist parallel zu der Objektivlinse mit Goniometer Stage (Abb. 2 b). Pflegen Sie die Körpertemperatur des Welpen mit einem Heizkissen (37 ° C).
  5. Legen Sie die Isofluran-Konzentration auf 0,7 % - 1,0 %.
    Hinweis: Eine sehr hohe Isofluran-Konzentration kann Unfalltod des Welpen während der Bildgebung führen.
  6. Legen Sie die bildgebende Bühne unter das Objektiv (20 X, NA 1.0) die zwei-Photonen-Mikroskop (Abb. 2 b und 2 C).
  7. Beantragen Sie einen Tropfen Wasser auf das Deckglas. Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz, um die fluoreszierenden Protein-Label Neuronen im Bereich zu finden, die Dura in Berührung kommt.
  8. Z-Stapel Bilder 1,4 µm Abständen zu erwerben. Schicht stellen 4 Neuron imaging, die Z-Breite von 150-300 µm, die gesamte dendritische Morphologie (Abb. 2D und 2E) Bild. Verwendung langsamer Scannen und im Durchschnitt um klare Bilder zeigen die neuronale Morphologie zu erhalten (Dies dauert in der Regel > 20 min, die gesamte dendritische Morphologie zu erwerben).
    Hinweis: Die folgenden Parameter sind für die Bildgebung empfohlen. Erregung Wellenlänge: 1.000 nm, Scanner: Galvanometer Typ, dichroitischen Spiegel: 690 nm, Emission Filter: 575-620 nm Bandpass, Detektor: GaAsP Typ Einstellung > 100 gewinnen, Bild-Größe > 512 x 512 µm, Sichtfeld > 600 x 600 µm, Pixel Auflösung < 1,2 µm.

(5) Erholung und Pflege

  1. Der Welpe von der bildgebenden Bühne zu lösen.
  2. Platzieren Sie den Welpen auf eine Heizung (37 ° C) und lassen Sie es zu erholen (15 min).
  3. Feed der Welpe warmen Milch mit einer Mikropipette in 2-h-Intervallen und sanft stimulieren den Magen um Ausscheidung zu ermöglichen. Bestätigen Sie, dass der Welpe Milch trinkt durch die Messung seines Körpergewichts.

(6) Re-imaging

  1. Der Welpe mit Isofluran (1,5-2,0 %), zu betäuben und Anästhesie mit einem Heck-Pinch-Test überprüfen. Die bildgebenden Stufe zuordnen.
  2. Suchen Sie die zuvor abgebildeten Neuronen und erwerben Sie eine Z-Stapel-Bild zu. Die Identifizierung von Neuronen ist einfach aufgrund ihrer spärlichen Etikettierung mit Supernova.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-6.2 bis Bildbearbeitung abgeschlossen ist. Hinweis: Der Welpe kann bis zu 18 h abgebildet werden, ohne Gewicht zu verlieren.

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Representative Results

Figuren-2D - 2F zeigen repräsentative Ergebnisse der zwei-Photonen Zeitraffer Bildgebung der Schicht 4 kortikale Neuronen unter Verwendung dieses Protokolls. Wählen Sie zum Zwecke der Analyse Neuronen mit klaren dendritischen Morphologie in der bildgebenden Epochen. Wir analysieren die dendritische Morphologie des abgebildeten Neuronen mit morphologischen Analysesoftware. Repräsentative dendritischen Morphologie Rekonstruktion zeigt Abbildung 2F. Neuronen zeigen getrennten Dendriten (Abbildung 2) von Analysen, ausgenommen werden sollten, da getrennte Dendriten Zelltod induziert durch Schäden während der Operation oder Bildgebung hindeuten. Darüber hinaus sollte Neuronen mit unscharfen dendritischen Tipps ausgeschlossen (z. B.das Neuron mit der Pfeilspitze in Abb. 2D).

Figure 1
Abbildung 1: Chirurgie, kranialen Fenster Vorbereitung und Befestigung der Titan Bar (A) dieses Panel zeigt die Entfernung von der Haut des Schädels. (B) dieses Panel zeigt die Fixierung der Kluft zwischen der Haut und der Schädel. Achten Sie darauf, dass Sie nicht das Band für die imaging-Bereich gelten. (C) Dies ist ein Bild der exponierten Dura. Eine Rasierklinge wurde zwischen dem Schädel und der Dura eingefügt, und der Schädel war offen für den Bereich links von der exponierten (Pfeilspitze) flatterte. Der Knochen kann dann mit Pinzette leicht entfernt werden. (D) ist eine schematische Design zeigt eine vertikale Ansicht des kranialen Fensters. Die Lücke zwischen dem Deckglas und die Dura ist mit einer dünnen Schicht aus Agarosegel. Das Deckglas ist der Schädel mit dental Zement befestigt. (E) ein rundes Deckglas befindet sich auf der Agarose-Gel-Schicht. (F) Dies ist ein Bild von der gesicherten Deckglas. (G) dieses Panel zeigt den Aufbau eines Titan-Bar. Die Titan-Leiste enthält zwei schraublöcher zur Befestigung an der bildgebenden Bühne (siehe Abbildung 2) und einem flachen, rechteckigen Teil, die der Welpe Kopf befestigt ist. (H) den rechteckigen Teil der Titan Bar ist die Pup Schädel mit dental Zement befestigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: In Vivo zwei-Photonen-Bildgebung der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen. (A) dieses Panel zeigt den Aufbau eines Titan-Platte. Die Titanplatte hat zwei Bohrungen für die Befestigung der Titan Bar und vier Bohrungen für die Befestigung der Goniometer-Phase, die auf der bildgebenden Bühne platziert ist. 2,5 mm (Durchmesser) x 2 mm (Länge) Schrauben dienen zur Fixierung. (B) ist ein repräsentatives Bild der Pup an der bildgebenden Bühne befestigt. Der Welpe Körpertemperatur bleibt mit einer Heizung. (C) der Welpen ist betäubt, Isofluran während der in-Vivo imaging-Verfahren zu verwenden. (D) dieses Panel zeigt ein repräsentatives Z-Stapel Zeitraffer Bild der Schicht 4 kortikale Neuronen eines P5-Welpen. Die Pfeilspitze zeigt das Neuron mit unscharfen Dendriten, die aus der Analyse entfernt werden sollte. (E) dieses Panel zeigt höhere Vergrößerung Zeitraffer Bilder des Neurons mit Pfeilen im Bedienfeld " D". Blaue Pfeilspitzen: dendritische Tipps, die in 4,5 h, gelbe Pfeilspitzen eingefahren werden: dendritische Tipps, die in 4,5 Stunden, kleine weiße Pfeilspitzen länglich sind: Axon einer benachbarten Zelle. (F) Dies ist ein 3-d-Modell der dendritischen Ablaufverfolgung des Neurons in der linken Abbildung der Platte E. Blaue Kreise geben die Position der Zellkörper. (G) zeigt dieses Panel repräsentativen Neuronen mit getrennten Dendriten, die nicht in die Analyse einbezogen werden. Die Beispieldaten in Platten D - G enthalten NR1 (eine wesentliche Untereinheit des Glutamat-Rezeptors NMDA-Typ) - ausgeschlagen - Neuronen (wegen der begrenzten Datenlage von den Autoren). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wichtige Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung:

Der wichtigste Schritt des Protokolls ist die Entfernung des Schädels (Protokoll Schritt 3.2). Beim einsetzen hält sich die Rasierklinge häufig an der Dura, durale Blutungen und Schädigung des Gehirns verursacht. Dies kann vermieden werden, durch Hinzufügen von einen Tropfen des Kortex Puffer auf den Schädel und Entfernen des Schädels im Kortex Puffer.

Blutungen aus der Dura und der Haut nach der kranialen Fenster Vorbereitung zur Okklusion des Fensters führt. Zu vermeiden, das Gewebe Klebe- und dental Zement verwendet darf vollständig trocken ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Mehrere Jungtiere mit einem kranialen Fenster sollte vorbereitet werden, da es schwierig ist, völlig Blutung zu vermeiden. Im Allgemeinen kann der kraniale Fenster klar und stabil für 2-3 Stunden nach der Operation bleibt, der Welpe für Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden.

Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/Alternative Methoden:

Hier haben wir eine Methode zur in Vivo zwei-Photon imaging des Neugeborenen Cortex beschrieben. Dieses Protokoll hat mehrere Vorzüge im Vergleich zu bereits gemeldeten Methoden. Diese werden wie folgt aufgelistet.

(1) kortikale Neuronen können dünn und hell durch Supernova Vektoren mit IUE transfecting beschriftet werden. IUE hat weit verbreitet für die Kennzeichnung der kortikalen Neuronen während Phasen zu entwickeln. Eine einfache IUE ist jedoch ungeeignet für die Darstellung der einzelnen Neuronen, da Neuronen zu dicht7,8,9,10beschriftet werden können. Darüber hinaus mit der Supernova-System, verschiedene Arten von fluoreszierenden Proteinen einsetzbar für die Kennzeichnung von geringer Dichte Populationen von Neuronen. Zum Beispiel mit Supernova-vermittelten spärlich Kennzeichnung eines genetisch codierte Kalzium-Indikators GCaMP13,14, wir haben vor kurzem durchgeführt eine funktionale Analyse einzelner Neuronen im entwickelnden Kortex Layer 4 (P3, P13) 15.

(2) die in dieser Studie beschriebene Methode eignet sich für die Aufklärung der molekularen Mechanismen neuronaler Schaltungsentwicklung. Das Supernova-System ermöglicht spärlich beschrifteten zellspezifische ko von jedem gen. Somit kann die Dynamik eines Neurons, enthält ein spezifisches gen Störungen beobachtet werden. Zu diesem Zweck wurden Genetik-basierten Systemen wie MADM16 und glatte17 zuvor gemeldet. Jedoch da die Zucht von Mauslinien für diese Systeme ist, benötigen sie viel Zeit und Kosten als das hier beschriebene Protokoll.

(3) Diese Studie nutzt eine Rasierklinge zum Schädel entfernen. Dies minimiert, Blutungen aus der Dura und ermöglicht das Öffnen des einen großen Bereich des Schädels (< 2 mm im Durchmesser). Bei diesem Verfahren war es möglich, die spontane Aktivität der Schicht 4 Neuronen im gesamten großen Fass Bereich innerhalb der somatosensorischen Cortex15beobachten.

Grenzen der Methode:

Ein Nachteil der in-Vivo Bildgebung des Neugeborenen Mäusegehirns, verglichen mit der Abbildung von transparenten Tiere wie zebrafischlarven und Xenopus Kaulquappen, ist die geringere räumliche und zeitliche Auflösung. Langsam Scannen und im Durchschnitt sollte für klare Bilder der neuronale Morphologie nachgeben, weil mehr Lichtstreuung in das Gehirn der Maus tritt durchgeführt werden. Lichtstreuung kann eventuell mit einer längeren Wellenlänge Laser für fluoreszierende Protein Erregung und Proteine mit längeren Wellenlängen der Fluoreszenz-Emission reduziert werden.

Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls könnte sein, dass die Operation zur Implantation der kranialen Fenster die Bildung einer normalen kortikalen Schaltung aufgrund Gehirn Entzündung12beeinträchtigen kann. Allerdings gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass in-Vivo Bildgebung mehr physiologische im Vergleich mit in-vitro- Bildgebung wie Zeitraffer Bildgebung der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung, die auch zu schweren Entzündungen durch Ischämie und schneiden führen sollte. Es wurde auch berichtet, dass wiederholte Exposition gegenüber Isofluran mehrere neuronalen Prozessen18auswirken kann. Experimente sollten durchgeführt werden, für die Überprüfung der Angemessenheit der Ergebnisse von in-Vivo Bildgebung. Bei unserer Darstellung der Schicht 4 Neuronen im somatosensorischen Cortex, haben wir eine normale Zunahme dendritischen Gesamtlänge und Übernahme der Ausrichtung Voreingenommenheit der dendritischen Projektionen der stacheligen stellate Neuronen5,20bestätigt.

Neuere Studien berichtet > 1 - mm-Tiefe Bildverarbeitung im Gehirn einer Erwachsenen Maus wobei die Dura wurde während der Operation19entfernt. Auf der anderen Seite waren wir in der Lage zu Berichten bis zu 400 µm Tiefe Bildgebung bei Neugeborenen5. Da die Dura nicht beim Neugeborenen entfernt werden und dies wiederum zu einer hohen Lichtstreuung führt, unseres Erachtens Tiefe Bildgebung beim Neugeborenen ist schwieriger als bei Erwachsenen. Zukünftige Verbesserung der fluoreszierende Sonden, Laser und Detektoren sollten tief im neonatalen Gehirn Bildgebung erlauben.

Bisher haben wir 18 Stunden Zeitraffer imaging mit dem vorliegenden Protokoll5berichtet. Vor kurzem, in 72 Stunden Zeitraffer Bildgebung gelingt es durch die Verbesserung der Protokoll-20. Wir werden weiterhin das Protokoll hier vorgestellten (z.B., längerfristige, höhere Zeit und/oder räumliche Auflösung) für die Preisgabe von dynamischen Mechanismen der neuronalen Schaltungsentwicklung verfeinern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken T. Sato, M. Kanbayashi und S. Kouyama für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP15K14322 und JP16H06143, der Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation und das kollaborative Forschung Projekt von Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) und unterstützt. KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, und JP15H04263 und Grant-in wissenschaftliche Forschung auf Innovationsfelder "Dynamische Regelung der Funktion des Gehirns von Schrott & Build-System" (JP16H06459) von MEXT (TI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pK031. TRE-Cre Authors - Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE Authors - Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE Authors - Available from authors
Isoflurane Wako 099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) Univentor 8323101
Vetbond (tissue adhesive) 3M 084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip) Sorenson 13810
Gelfoam (gelatin sponge) Pfizer 09-0353-01
Agarose Sigma A9793 Low melting point
Round-shaped coverslip Matsunami - Custom made
Unifast 2 (dental cement) GC -
Titanium bar Authors - Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen) Zoetis - Injectable
2-photon microscope Zeiss LSM7MP
Titanium-sapphire laser Spertra-Physics Mai-Tai eHPDS
Titanium plate Authors - Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro BITPLANE
Goniometer stage Thorlabs GN2/M

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References

  1. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  2. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
  3. Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
  5. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  6. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
  7. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
  8. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
  11. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  16. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  17. Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
  18. Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
  19. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
  20. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).

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Neurowissenschaften Ausgabe 140 Neugeborenes zwei-Photonen in Vivo Imaging einzellige Etikettierung Großhirnrinde Maus
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Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (140), e58340, doi:10.3791/58340 (2018).

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