Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af cellulært Stress og Inflammation i diskrete Oxytocin-secernerende hjernen kerner i Neonatal rotten før og efter første råmælk fodring

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere hjernen kerner i neonatal rotte hjernen sammenholdt med første råmælk fodring. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af næringsstof insufficiens stress i hjernen som moduleres af enterocyte signalering.

Abstract

Målet med denne protokol er at isolere oxytocin-receptor rige hjernen kerner i neonatal hjernen, før og efter første råmælk fodring. Udtryk for proteiner kendt til at reagere på metabolisk stress blev målt i hjernen-kerner isolater ved hjælp af Western blotting. Dette blev gjort for at vurdere, om metabolisk stress-induceret næringsstof insufficiens i kroppen udløste neuronal stress. Vi har tidligere vist, at næringsstoffer insufficiens i nyfødte fremkalder metabolisk stress i tarmen. Derudover modulerer råmælk oxytocin cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og efter første foder. Signalering protein markører tilknyttet endoplasmatiske reticulum stress [ER anstandsdame bindende immunoglobulin protein (BiP), eukaryote oversættelse indledningen faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase Rasmussen (p-PKR)], samt to betændelse-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) og hæmmer κB (IkB)], blev målt i nyfødte hjernen kerner [kernen i den ensomme tarmkanalen (NTS), paraventricular kerne (PVN), supra-optik kernen (søn), cortex (CX), striatum kerner (STR), og mediale preoptic kernen (MPO)] før den første foder (unprimed af råmælk) og efter starten af sygepleje (primes af råmælk). Udtryk for BiP/GRP78 og p-eIF2a blev upregulated i unprimed og downregulated i PRIMES NTS væv. NF-kB blev bevaret (høj) i CX, STR og MPO cytoplasma, hvorimod NF-kB var lavere og uændret i NTS, PVN og søn i begge betingelser. Den kollektive BiP og p-eIF2 resultater er i overensstemmelse med en stressrespons. eIf2a var fosforyleret af dsRNA afhængig kinase (p-PKR) i søn, CX, STR og MPO. Men i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a var fosforyleret af en anden kinase, generel kontrol nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mekanismer tidligere observeret i nyfødte gut enterocytes synes at blive spejlet i nogle OTR-rige hjerneregioner. NTS og PVN kan udnytte en anden fosforylering mekanisme (under næringsmangel) fra andre regioner og er refraktære over for virkningen af næringsstof insufficiens. Kollektivt, tyder disse data på, at hjernen svar til næringsstof insufficiens stress er opvejet af signalering fra colostrum-pulverlak enterocytes.

Introduction

I modsætning til vores forståelse af tidlige hjernens udvikling forekommer i løbet af dage-til-uger postpartum er relativt lidt kendt om utal af dynamiske forandringer i de første timer af livet i rotter. En central udfordring har været den lille størrelse af neonatal rotte hjernen og et krav om high-tech redskaber til at isolere diskrete hjerneregioner eller enkelte celler. Undersøgelser vurdere ofte gen transskription og ikke oversættelse1,2, som ikke giver en fast forståelse af funktionelle niveauer af aktiverede signaling molekyler. Andre undersøge udtryk ved hjælp af Immunhistokemi reference hjernen regioner, som ikke tillader for kvantificering af udtryk niveau3. Ingen undersøgelse til dato har undersøgt aktivering af signalering veje tilknyttet rats' første colostrum feed i diskrete hjerneregioner, som kræver hurtig isolation og offer og måling af protein udtryk og protein fosforylering ved hjælp af Western blotting. Mens hjernen microdissection udføres på ældre og større hjerner, har vi ikke identificeret reference udfører en ikke-encellede hjernen punch i en P0 hjerne. Dette paper præsenterer en protokol til at isolere begrænset regioner af neonatal hjernen ved hjælp af en forholdsvis lavteknologisk punch teknik og en Western blotting-procedure til at måle protein udtryk i relativt små prøver. Denne protokol kan være egnet til forskningsspørgsmål, der kræver vurdering af protein udtryk og posttranslationelle modifikationer (fx., fosforylering) i relativt begrænsede områder af små hjerner af enhver art, forudsat at den brugeren kan visuelt identificere området af hjernen af interesse med et atlas og identificerbare milepæle.

Denne teknik blev udviklet for at forstå forandringer i hjernen som følge af den neonatale rats' første colostrum feed, som er rig på oxytocin (OT). OT har længe været kendt for sin evne til at stimulere mælk nedløb og uterin sammentrækning. Dog er OT nu kendt for at spille en bred vifte af roller i reguleringen af mange kropsfunktioner og adfærd4. For eksempel, OT modsætter sig stress og inflammation i forbindelse med adaptive affiliative adfærd5, forsinkelser, gastrisk tømning, og bremser intestinal transit. OT receptorer (OTR) er blevet identificeret i enteriske neuroner og intestinale epitel6,7,8. Gastrointestinale virkningerne af OT er særligt vigtige for barnet i den tidlige postnatale periode. For eksempel, amning er forbundet med levering af betydelige mængder af OT til neonatal gut9,10, og data viser, at OTR stærkt overexpressed i duodenal villi under mælken pattegris periode8.

In vitro- eksperimenter ved hjælp af en gut cellelinie har demonstreret på cellulært niveau at oxytocin modulerer vigtige molekyler i stress signalering vej11,12 og en regulerende rolle i oversættelse af proteiner 12. disse undersøgelser tyder på, at komponenterne i mælken, herunder eksogene oxytocin fra moderen, er vigtige i udfoldet protein respons i nyfødte at reducere cellulært stress13.

In vivo og ex vivo studier har vist, at colostrum OT modulerer cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider væsentlig cellulært stress på deres luminale side når tarmen er samtidig udsat for mikrobiota fra moderen i colostrum14,15 og mange proteiner, herunder hormoner som OT9 , 10 , 16.

OT indvirkning på hjernen har været undersøgt17. OT signaling mekanismer demonstreret i tarmen i de tidlige postnatale periode er imidlertid ikke blevet undersøgt i hjernen. I dette papir, er en metode til at isolere diskrete hjernen kerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus ved hjælp af elektroforese bruges til at profilere enkeltstående hjerneregioner. Det overordnede mål med denne metode er at fange tilstanden af celle signalering i hjernen områder så tæt som muligt til fødsel, før og efter den første mælk diegivning i hjernevæv med den laveste glial/neuronal indeks. Begrundelsen for udviklingen af denne teknik er at det giver mulighed for hurtige isolering af begrænset, mikroskopiske hjerneregioner i neonatal unger med en mere homogen samling af neuroner for ex vivo undersøgelser ved hjælp af en automatiseret Western blotting metode, giver særdeles ensartede resultater på forholdsvis små dissekeret prøver. En mangel ved forudgående arbejde omfatter mere grov dissektion (hjernen skiver eller hele hjernen) og ældre dyr18,19. Hjerner af unge unger er utroligt dynamisk, featuring bølger af glial differentiering efter fødslen. For at studere ændringer i hjernen påvirket af pups' første fodring, er studerer begrænset neuronal kerner med reproducerbare dissektion nødvendige.

Mælk foder er normalt analyseret for sit immunologiske og ernæringsmæssige indflydelse på helbred eller gene udtryk (eksempelvis i enterocytes20,21), der henviser til, at dens virkning på hjernen områder under hjernens udvikling er sjældent undersøgt. Effekten af mælk transit i tarmen på hjernefunktion blev analyseret i forhold til gut cholecystokinin receptorer vagus relæ til hjernestammen kerner, men ikke til intracellulær signalering veje22. Der er en omfattende litteratur om sårbarhed af udvikle nyfødte hjernen til fejlernæring af mødre under graviditet23, men stress og inflammation signalerne er ikke behandlet. Vigtigere er, udnytter den nuværende metode et fænomen i dag-nul rotte nyfødte, der isolerer blod-født colostrum stimuli fra vagus relæ af visceral stimuli. Dette er den såkaldte stress hypo-lydhørhed periode præget af umodne kernen tractus solitarius (NTS)-hypothalamus kredsløb umiddelbart efter fødslen24,25 , som begrænser NTS, paraventricular kerne (PVN), og supraoptic kerne (søn) signaler til blod-født stimuli.

Denne metode er nyttig for analyse af flere signaling veje og begrænset relativt til neuronale celler, forudsat at hjernevæv er høstet på postnatal dag-0 i rotter, ud over om mødre er blevet anfægtet eller ikke af nogen form for behandling under graviditet. Kuld kan analyseres for virkningerne af colostrum feed versus pre fodring signalering. Når man sammenligner signaler mellem hjernen områder med fattige versus rig protein udbytte, denne metode gør det muligt i-kapillær bestemmelse af total protein af polypeptid bands i kapillærer løber parallelt med immun-kvantitering af protein antigener. Denne metode gør det muligt for kvantitativ sammenligning, ved hjælp af arbitrære enheder, af resultaterne af den samme antistof uden standard kvantitative kurver og med henvisning til total protein pr. kapillær. Sammenligne resultaterne af forskellige antistoffer er muligt, kun ved hjælp af kvantitative standard kurver.

Denne metode er tilladt for vurdering af tovejs signalering mellem tarmen og hjernen, og som kan påvirke funktion i begge organer26. Association mellem indtag af oxytocin og fødevarer, som er blevet grundigt undersøgt i de seneste år27, understøtter en sammenhæng mellem øget oxytocin signalering og næringsstoftilgængelighed. Disse undersøgelser støtter også begrebet converse energi underskud er kombineret med reduktioner i hypothalamus oxytocin signalering.

Tidligere undersøgelser af effekten af OT på hjerneaktivitet viste, at induceret gut betændelse fremkaldt økonomichefer transskription i hypothalamus PVN, amygdala og piriform cortex, som er refraktære over for vagotomy28. Systemisk infusion af OT med sekretin faldt imidlertid hjernen økonomichefer svar på den provokeret betændelsesreaktion i gut28. Dette foreslog, at effekten af eksogene OT blev udført af ruter end vagus relæer, eventuelt via blodbårne signaling molekyler transporteres gennem område postrema6,29.

I denne undersøgelse, blev cellulært stress signaling veje, der har tidligere observeret i tarmen vurderet i hjernen. Hypotesen var at mælkebestanddele kan beskytte eller udskyde effekten af betændelse på gut permeabilitet til mikrobiel og andre metabolitter, og til gengæld effekter på hjernens funktion. De klare antagonistiske forskelle i IkB versus BiP signalering fundet i villi, før og efter priming af colostrum13, foreslog, at hjerner af nyfødte, stadig i færd med at udvikle, kan fornemme signalerne colostrum-induceret gut.

Signaling protein markører, der anvendes i tidligere gut eksperimenter, der er forbundet med endoplasmatiske reticulum stress blev målt. De omfatter ER anstandsdame BiP, oversættelse indledningen faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaktion integrator30), eIF2a kinase p-PKR, og to betændelse-signalering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).

Seks hjerneregioner baseret på deres evne hos voksne udskiller eller besvare OT blev valgt. NTS, beliggende på den øvre medulla, er den første relæ af visceral input og modtager direkte signalering fra vagus sensoriske neuroner i tarmen31 og eventuelt blod-født cytokiner, toksiner og hormoner via den tilstødende område postrema32. PVN, supraoptic kerne (søn), striatum kerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kerne (MPO) modtager signaler fra tarmen via NTS.

Resultaterne viste, at den cellulære stressrespons i umiddelbar postnatale periode forud for colostrum priming og umiddelbart efter første fodring er forskellige i NTS i forhold til PVN og søn. Signalering i CX, afveg STR og MPO fra PVN og søn, så godt. Af OT vist tidligere at modulere cell stress og betændelse i tarmen særskilt beskyttende funktioner er sandsynligvis sanses af nogle områder af hjernen. Kollektivt, viser dataene, at på cellulært niveau, i de første timer efter fødslen, hjernen reagerer på metabolisk stress forbundet med næringsstoffer insufficiens. Dataene viser også, at omfang og retning af modulerende virkningerne af colostrum feed er region-afhængige og, i nogle regioner, de spejl OT effekter vist tidligere i tarmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Columbia University og New York State psykiatriske Institute.

1. væv forberedelse

  1. Bestil timet gravide rotter fra kreditor.
  2. Følg timet gravide rotter ved at observere deres voksende underliv i ugerne efter deres ankomst og efterfølgende på udkig unger på den forventede leveringsdato ved inspektion af buret hver 2 h indtil levering begynder.
  3. Fjerne unger med behandskede hånd af deres hale før deres første foder til unprimed unger (ingen hvid mælk bugen er synlige, når du ser maven) eller efter det første foder til PRIMES unger (på hvilket tidspunkt en hvid mave vil være synlige på deres underliv) som beskrevet i timeli ne (Figur S1).
    Bemærk: Den første colostrum foder er betegnes som grunding pup; en hvalp er således unprimed indtil det første foder, hvorefter de er colostrum-pulverlak.
  4. Hurtigt halshugge sig hvalpen ved hjælp af skarpe, rene kirurgisk saks.
  5. Fjerne hjernen ved at skære huden ned midterlinjen og oversiden af kraniet til næsen. Derefter bruge pincet, forsigtigt lirke væk knoglen for at afsløre hjernen (figur 1A) og lokalisere bregma, markerer det med en pen, som knogleplader er fjernet (figur 1B).
  6. Hurtigt placere hele hjernen i en polymethyl methacrylat hjernen skimmel ved stuetemperatur for koronale udskæring ved stuetemperatur (figur 1 c).
  7. Uden forsinkelse, gøre 500 mm tykke skiver ved hjælp af en frisk barberblad. Læg skiverne rostralt for caudale i en petriskål at bevare retningen af sektioner (figur 2).
  8. Hurtigt tilføje kunstige cerebrospinalvæske (ACSF, 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6 H2O) uden glukose og inkuberes skiver i 60 min på 28-30 ° C, konstant omrøring på en orbitalryster metabolisk og varierende udfordre den unprimed versus colostrum-pulverlak væv.
  9. Identificere de hjerne kerner, der er nødvendige for at punch ved hjælp af en hjerne atlas33 og anatomiske landemærker på afsnittet væv. Placer denne skive med kerner af interesse i en petriskål og flytte det til at dissekere mikroskop.
  10. Når visualiseres, hurtigt punch ud 4 af 6 forskellige kerner ved hjælp af en coring værktøj, at vælge størrelsen, der bedst punch den pågældende kerne og konsekvent mellem prøver (figur 2).
    Bemærk: Den resterende hjernen skive har nu et hul hvor hjernevæv blev fjernet. I denne undersøgelse, vi skåret ud af følgende kerner ved hjælp af den nedenfor koordinater. Alle forreste/bageste (A / P) koordinater er fra Bregma (undtagen NTS, som er med henvisning til Calamus Scriptorius). Alle dorsale/ventral (D/V) koordinater er fra overfladen af cortex (undtagen NTS, som er fra overfladen af medulla). Følgende koordinater omfatter A / P, mediale/lateral (M/L) og D/V i mm: 1) ensomme tarmkanalen kernen (NTS, A / P, 0,4 til 0,8; LARSEN, ± 0,2; D/V, 0,3 (fra overfladen af medulla), 2) paraventricular kerne (PVN,-0.8, ± 0,2; 0), 3) supra-optik kernen (søn, -1,1; ± 1.4; 4.3), 4) cortex (CX, delvis cortex område 1,-2.8; ± 1,5; 0,6), 5) striatum kerner (STR,-0.0; ± 1.6; 1.8), og 6) mediale preoptic kerne (MPO,-0.6, ± 0,2; 4.2).
  11. Hurtigt fordybe de udstansede kerner i 0,06 mL iskold, protein ekstraktionsbuffer indeholdende proteasehæmmere og fosfatase hæmmere i 60 minutter (Se trin 2.3).

2. protein udvinding

  1. Forberede protein ekstraktionsopløsning ved hjælp af protein lysis kit (Table of Materials) på dagen før forventede pup levering.
  2. Optø (på is) frosne (-20 ° C) vandig opløsning af protease og fosfatase hæmmere af lysis buffer kit og placere lysisbuffer og DMSO løsning af proteaser/fosfataser hæmmere på is.
  3. Tilføje 1.85 mL lysisbuffer ind i en ren, iskold 15 mL rør. Derefter tilføje 0,1 mL vandig opløsning af hæmmere og 0,05 mL af DMSO-opløst hæmmere. Endelig cap og kortvarigt vortex røret og holde det på-20 ° C indtil brug.
  4. Label 24 ren microcentrifuge rør (0,5 mL) til proceduren lysering. Indstillede 12 rør pr. hjerne for colostrum-unprimed gruppe (U) [6 venstre (L) og 6 højre (R) hjerne kerner], og etiketten i henhold kerner akronym, side og betingelse (fx., NTS-L-U, NTS-R-U, osv.). Mærke den anden gruppe af 12 rør colostrum-pulverlak prøverne.
  5. Label to ekstra sæt rør, som gjort i trin 2.4 for materiel protein ekstrakter (ved hjælp af 1,5 mL Eppendorf-stil rør) og det første sæt af Prøveforberedelse (ved hjælp af 0,5 mL rør). Holde disse rør i to separate, mærket indefrysning kasser (hver designet til 100 rør). Én boks vil blive brugt til unprimed prøver og den anden de PRIMES prøver.
  6. Tø lysis løsning på is på den dag, hvor hvalpene er leveret, og mens inkubere hjernen skiver i ACSF, alikvot 0,06 mL lysis løsning i proceduren lysis rør (fra trin 2.4) og tilføjer cellekerner slag og inkuberes i isbad i 60 min.
  7. Centrifugeres de indlagte lysed kerner i 30 min. i en kølet mini centrifuge på 14000 rpm (10.000 x g) og omhyggeligt Aspirér 0.055 mL af supernatanten med en korrekt sæt pipette. Overføre supernatanten til pre afkølede 1,5 mL stock rør (fra trin 2,5) og læg dem på is. Før nedfrysning (ved-20 ° C) protein stock rør, overføre 0.012 mL af supernatanten til 0,5 mL pre afkølede rør til den første Prøveforberedelse (fra trin 2,5) og efterlade dem på is.

3. Prøvetilberedning for i-kapillær Protein måling

  1. Bruge et kit og forberede reagenserne til adskillelse efter producentens anvisninger. Tilføje 0,003 mL af master-mix reagens til hver af de 12 prøver i 0,5 mL mærket rør (fra trin 2,5) på is, der indeholder 0.012 mL af protein ekstrakter.
  2. Tænd den varme blok til 95 ° C og tilsættes 0.004 mL af reagenset forberedt i trin 3.1 til en biotinylated molekylvægt (MW) stige i et rør med 0,016 mL deioniseret vand. At denaturere stigen og prøver, placere stigen tube og de 12 prøver af unprimed protein ekstrakter i den varme blok ved 95 ° C i 5 min og gemme dem på 4 ° C indtil brug.
  3. Gentag trin 2.0 til 3.2, fra protein udvinding til prøveforberedelse, for kerner knytnæveslag fra colostrum-pulverlak rotter.

4. elektroforese forberedelse

  1. Tø biotin mærkning reagens (opbevares i dybfryser på-80 oC) på bænken og forberede protein detection kit på isen ved 4 ° C efter fabrikantens anvisninger.
  2. 0,15 mL af luminol blandes med 0,15 mL brintoverilte og indlæse 0,01 mL i 25 wells (række E, wells 1-25) af pladen til den automatiserede vestlige maskine. Indlæse 0,008 mL af Streptavidin-HRP fra kit i wells D1 til D25
  3. Indlæse 0,01 mL af antistof fortyndingsmiddel i wells C1 til C25 og B1.
  4. Spin 24 protein prøver og stige rør kort (2-3 sekunder) i en minicentrifuge til swimmingpool ned fordampet vand fra tube caps.
  5. Indlæse 0,003 mL 12 unprimed prøver i brønd A2 til A13, 0,003 mL 12 colostrum-PRIMES prøver til brøndene A14 til A25 og 0,005 mL af biotinylated stige til godt A1.
  6. Lade række F Tom og indlæse 0,45 mL vaskebuffer i hver af de 5 rum i hver af de 3 rækker under rækken F. dække pladen med plastik låg at undgå fordampning under de resterende procedurer.
  7. Kort vortex den optøede biotin mærkning reagens og tilføje 0,15 mL reagens til dets udpegede rør; derefter tilsættes til det 0,15 mL total protein rekonstitution agent og bland dem til ensartethed.
  8. Fjern dækslet fra pladen og indlæse 0,01 mL af agenter 1 og 2 i wells B2 til B25. Dække nummerpladen og centrifugeres det i 10 min ved 1000 x g du fjerner eventuelle luftbobler fra de forskellige løsninger. Bruge en tom plade i centrifugeres i balance.

5. elektroforese

  1. Mens pladen spinning, åbne en køre filen i den automatiserede vestlige maskine-attached computer ved angivelse på siden dropdown fra "fil" for at køre en total protein assay og klikke på det respektive sted.
  2. Anmærke prøver af godt i computeren. Fjern derefter pladen fra centrifuge Fjern dækslet og omhyggeligt skrælle aluminium cover fra adskillelse løsning rum.
  3. Pladen anbringes i den automatiserede vestlige instrument, skrælle dækning fra boksen kapillær patron, Indsæt blækpatronen i sin bestemte plads og lukke døren.
  4. Klik på knappen "RUN", og når du bliver bedt med typen af assay ("total protein"), skrive navnet på prøverne (for eksempel, "unprimed 2-13 og colostrum-pulverlak 14-25"). Klik på "OK", og når du bliver spurgt af aktiverede kørselsdato og id-nummer i filen køres, notere, hvornår flugt afsluttes.
  5. For enden af run (170 min efter start) åbne instrument døren, fjerne den kapillære patron og kassere det i klid bortskaffelse. Kassér pladen i biologisk materiale bortskaffelse.
  6. Klik på ikonet adskillelse kurver i siden analyse af køre filen, og kontroller, at alle prøver har køre ordentligt og viser flere protein kurver i alle kapillærer.

6. analyse af signalering proteiner

  1. I en mærket 1,5 mL tube, tilføje 0,003 mL kanin anti phospho-eIF2a (p-eIF2a) antistof og suspendere det i 0,3 mL (1: 100 fortynding) i antistof fortyndingsmiddel fra egnet opdagelse kit. Derefter holde det på is.
  2. Mærke et luminol rør og tilføje 0,15 mL luminol og 0,15 mL brintoverilte fra denne opdagelse modul kit og dispensere 0,01 mL i wells E1 til E25 af en frisk, automatiseret vestlige plade.
  3. Dispensere 0,01 mL af sekundært anti-kanin antistof i D25 brønde D2, og tilføje 0,01 mL af streptavidin-HRP fra kit til godt D1.
  4. Dispensere 0,01 mL af den primære antistof (fra trin 6.1) ind i wells C2 til C25, og tilføje 0,01 mL af antistof fortyndingsmiddel 2 brønde C1 og B1 til B25.
  5. Lade række F wells Tom og fylde 0,45 mL vaskebuffer i 3 rækker under rækken F 5 rum.
  6. Kort spin nedkølet prøverne til 3 s, og tilføje 0,003 mL af hver prøve til række A i samme rækkefølge, de blev tilføjet for total protein assay, startende fra A2 til A25. Tilføje 0,005 mL af biotinylated MW stige til godt A1 og dække pladen.
  7. Der centrifugeres pladen som gjort i trin 4.8. Mens pladen spinning, åbne (i automatiseret Western-associerede software og computer) en ny køre fil og angive på siden dropdown fra "Fil" for at køre en molekylær størrelse analysen ved at klikke på det respektive sted.
  8. Skriv navnene på prøve i hver kapillær i siden assay, så skriv navnet på den primære antistof i den tildelte spot og de sekundære anti-kanin antistof under den.
  9. I slutningen af centrifugering, Gentag trin 5.3-5.5, bortset fra navnet på filen køre denne gang bør være "p-eIF2a på unprimed 2-13 og colostrum-pulverlak 14-25".
  10. Tjek køre filen for immun-reaktivitet toppene af antigener på størrelser af 40 – 43 kDa efter separation elektroforese. Hvor MW af peaks dette størrelse er mangler, Højreklik under kurven og angive inde i dropdown listen for at tilføje MW til peak, som sikrer, at størrelse og vilkårlig kvantitet under kurven er registreret.

7. behandling af resultater

  1. Åbne en regnearksfil til total protein indkøre den automatiserede Western køre fil og give et id-nummer.
  2. Åbn filen køres af total protein analysen på siden analyse på tilstanden kurve og markere alle bjergtoppe i det enkelte kapillærer. Derefter kopiere og indsætte dem i regnearket og sum områder under kurven af alle toppe registreres i den hele kapillær.
  3. I en separat kolonne, skal du arrangere den samlede mængde af protein for hver kolonne med kapillar numre, navne på de respektive hjerne kerner, og id-numre for at køre filer.
  4. Åbn et regneark til p-eIF2a-antigen, og i en enkelt kolonne, optage arealet under kurven fra hver kapillær side om side med dens respektive kapillær nummer, navn af hjernen kerne, og id-nummeret for at køre filen.
  5. Kopiere kolonnen total protein (parallel til p-eIF2a kurve mængder) til en tredje regneark og beregne p-eIF2a:total protein nøgletal i en tredje kolonne.
  6. Indsamle resultater fra trin 4 til 6 for hver hjerne kerne, arrangere dem i grupper af kerner og generere et søjlediagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative bands af immunoreactivity i forhold til total protein viser, at der er hjernen kerner med meget lav høstede protein. Dette kræver brug af automatiserede vestlige skamplet teknik, som er meget følsomme i forhold til den kanoniske vestlige skamplet. Denne tilgang kan køres med fortyfold mindre protein pr. kapillær i forhold til pr. vognbane i Western blotting.

Differential virkningerne af colostrum priming på BiP niveauer i hjernen kerner

Koronale sektioner af rotte hjerner blev høstet før den første råmælk fodring (unprimed) og efter den første fodring (primes). Prøver var fraktioneret af kapillær elektroforese (på WES), og proteiner var kvantificeres ved hjælp af kit for i-kapillær total protein farvning (se protokollen). Yderligere immun kapillær fraktionering på de automatiserede Western forudsat identifikation af de respektive protein antigener. Figur 3Avises repræsentative BiP protein udtryk i det øverste panel, med den tilsvarende total protein vist nedenfor. BiP er en ER anstandsdame protein. I figur 3Bpræsenteres quantitated immunoreactivities af søjlediagrammer i forhold til den tilsvarende total protein.

Inden for unprimed vævsprøver, BiP niveauer i NTS var betydeligt højere end for alle andre regioner (p < 0,05, n = 4 kerner). Priming af gut væv med colostrum havde en modsat effekt i NTS, sammenlignet med øget BiP i andre regioner, i forhold til unprimed væv (figur 3B). Priming faldt BiP i NTS (figur 3B) og havde ingen effekt på PVN og SOPT. Priming steg imidlertid BiP i CX, STR og MPO i forhold til unprimed væv. Disse data antyder, at BiP niveauer i forskellige testet hjernen kerner reagerer forskelligt på gut priming og at der ikke endnu alle demonstreret cross-talk mellem de forskellige kerner testet.

Differential virkningerne af colostrum priming på ElF2a og p-elF2a niveauer i hjernen kerner

Hjernen vævsprøver blev udarbejdet, analyseret og kvantificeres som vist i figur 3A og 3B. Som med BiP niveauer (figur 3B), elF2a og p-elF2a blev niveauer i NTS forhøjet i den unprimed tilstand i forhold til andre kerner (figur 4B og 4 C). Som påvist med BiP niveauer, var svar i NTS til priming af gut væv med colostrum modsat, at i andre kerner. Niveauer af både elF2a og p-elF2a i NTS blev reduceret i forhold til unprimed væv. I alle andre testede kerner, priming øget niveauer i elF2a og p-elF2a i forhold til unprimed væv (figur 4B og 4 C).

Fosforylering af elF2a af kinase GCN2 i NTS og PVN efter colostrum priming

Hjernen vævsprøver blev udarbejdet, analyseret og kvantificeres som vist i figur 3. Priming afdøde p-PKR i PVN (χ2 p = 0,025), i modsætning til alle andre regioner, hvor det blev øget. I modsætning til p-elF2a resultater (figur 4 c), niveauer af p-PKR var lav i unprimed prøver i forhold til PRIMES prøver i NTS (figur 5A). Fosforylering af elF2a er normalt katalyseret af dens kinase PKR som svar på virus34 og af OT i tarmen, som tidligere påvist11. Det faktum, at p-PKR niveauet var meget lavt i unprimed versus PRIMES NTS (i forhold til andre kerner, figur 5A) kraftigt antyder imidlertid, at en anden kinase skal inddrages i phosphorylating elF2a (fig. 4 c). Derfor blev GCN2 niveauer testet i NTS og PVN, fordi det er også en kendt kinase elF2a35. Niveauer af p-GCN2 (aktive form) var højere i unprimed prøver i forhold til PRIMES prøver i NTS og PVN (figur 5B) og GCN2 (inaktive form), i forhold til p-GCN2, blev omvendt udtrykt i PVN (figur 5 c). pGCN2 i NTS (figur 5 c) blev udtrykt omvendt til pPKR (figur 5A) i både unprimed og primet NTS. I PRIMES væv, p-eIF2a var betydeligt lavere i NTS end i alle andre områder af hjernen [PVN (p < 0,01), søn (p < 0,01), CX (p < 0,01) og MPO (p = 0,02)]. Dette indikerer, at pGCN2 i stedet for pPKR, var ansvarlig for eIF2 hæmning i NTS.

Colostrum priming hæmmer NF-kB i CX, STR og MPO

Figur 6A viser at IkB niveauer var betydeligt højere i søn unprimed prøver vs PRIMES prøver. IkB niveauer i søn, CX, STR og MPO trended højere i samme retning. I figur 6 cvar NF-kB niveauer i CX, STR og MPO betydeligt højere i primet versus unprimed væv. NF-kB niveauer var imidlertid væsentligt lavere i PRIMES NTS væv, hvilket tyder på, at colostrum havde en særskilt anti-inflammatoriske effekt på dette område af hjernen. Cytosole NF-kB var højere (beholdes) i unprimed NTS prøver, mens dens hæmmer IkB var lav og uændret i PRIMES prøver. Dette tyder på, at en særskilt anti-inflammatoriske mekanisme regulering af NF-kB i NTS. Dette næringsstof insufficiens stress effekt er i overensstemmelse med nuværende undersøgelsesresultater, at stress markører BiP og p-eIF2a er både reguleret af tilstedeværelsen af colostrum priming (figur 3 og 4, henholdsvis), også vist i forrige BiP og p-elF2a resultaterne10. Årsagen til IkB og NF-kB i NTS sammenlignet med CX, STR og MPO tydelig reaktion er endnu ikke fuldt forstået. Men det er i overensstemmelse med den iagttagelse, at NTS, som transmitterer signaler fra tarmen til hjernen, kan spille en afgørende rolle i reagerer entydigt og oppositely versus andre områder af hjernen i forhold til perifere betændelse36. IkB i CX, STR og MPO var lav (figur 6A), sammenlignet med høje niveauer af NF-kB i de samme områder (figur 6 c). Mens denne konstatering i tilsyneladende modstrid med den forudsætning at IkB bindende og bevare NFkB i cytosol, forskellige beregning af de data, som kombinerer og sammenligner alle PRIMES prøver i CX, STR og MPO ved hjælp af regression analyse viser at NF-kB meget korrelerer med IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figur 1: dissekeret neonatal rotte hjernen. (A) dissekeret hjernen er vist med knogler fjernet rostralt for bregma. (B) hjernen er vist efter en linie trukket på bregma, hvorefter de resterende knogleplader blev fjernet. (C) hjernen er vist i en polymethyl-methacrylat hjernen støber lige før at blive skåret med et barberblad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: hjerne skiver arrangeret fra rostralt for caudale med slag (røde cirkler). Forkortelser: CX: cortex, isselappen; MPO: mediale preoptic område; NTS: kernen tractus solitaries; PVN: paraventricular kernen; SØN: supraoptic kernen; og STR: striatum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: BiP/GRP78 svar i NTS er inverteret end andre kerner. (A) repræsentant BiP protein udtryk i det øverste panel i forhold til den samlede protein præsenteret i panelet nedenfor. Bemærk at den samlede protein tæthed i de forskellige kapillærer er heterogene, og disse bruges til at udligne de respektive BiP udtryk pr. protein i panelet B. (B) vises er den gennemsnitlige BiP i forhold til total protein i hjernen kerner af unprimed prøver ( blå) versus colostrum-PRIMES prøver (brun). Stjerner af respektive farver udpege væsentlige forskelle (p < 0,05, n = 4 kerner) mellem BiP i NTS versus BiP i andre kerner. BiP udtryk i unprimed versus PRIMES prøver i NTS betydeligt inverteres til dem i STR (χ2 p = 0.028, n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: aktive og inaktive eIF2a (p-eIF2a) svar til colostrum priming versus unprimed prøver i NTS inverteret end andre kerner. (A) repræsentative eIF2a og p-eIF2a protein udtryk er vist i de øverste paneler. Total protein baner præsenteres på nederste panel. (B) vises er den gennemsnitlige eIF2a af 4 prøver udtrykt i forhold til total protein (fra nederste panel A) i hjernen kerner af unprimed prøver (blå) versus colostrum-PRIMES prøver (brun), og (C) den inaktive form af eIF2a (p-eIF2a). Stjerner af respektive farver udpege væsentlige forskelle (p < 0,05, n = 4 kerner) mellem begge eIF2a former i NTS versus respektive udviklingsniveauer i andre kerner. Aktive eIF2a udtryk i unprimed versus PRIMES prøver i NTS betydeligt inverteres CX, STR og MPO (χ2 p < 0,05 versus alle tre kerner, n = 4). Fejllinjer udgør standard fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: NTS udtrykker eIF2a kinase p-GCN2 i overensstemmelse med p-eIF2 niveau og omvendt til p-PKR niveau. (A) niveauet af p-PKR (aktiveret dsRNA kinase af eIF2a) er udtrykt i unprimed versus colostrum-pulverlak NTS omvendt til 1) niveau af p-PKR i PVN (χ2 p = 0,025) og 2) sin forventede målrettet substrat eIF2a efter sin fosforylering (til p-eIF2a, fig. 2 c). Bemærk at mønster af p-PKR i søn, CX, STR og MPO af unprimed versus colostrum-PRIMES prøver passer de respektive mønstre af p-eIF2a fra figur 2 c. (B) aktiveret eIF2a kinase (p-GCN2) i unprimed versus PRIMES NTS prøverne følger et lignende mønster af p-eIF2a udtryk fra figur 2 c og en invers mønster af pPRK udtryk fra figur 3A (χ2 p = 0.028). C = gennemsnitlig niveauer af inaktive GCN2. Fejllinjer udgør standard fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: cytoplasmatisk udtryk for NF-kB og IkB i hjernen kerner fra unprimed og colostrum-pulverlak gut prøver. (A) betyder cytoplasmatisk udtryk for IkB i forhold til total protein (fra panelet C) på angivne hjernen kerner. (B) repræsentative cytoplasmatisk bands IkB protein er præsenteret i overpanelet og total protein tæthed i respektive baner i nederste panel. (C) betyder cytoplasmatisk udtryk for NF-kB i forhold til total protein (fra panelet D) på angivne hjernen kerner. (D) repræsentative cytoplasmatisk bands af NF-kB bands bliver præsenteret i øverste panel og samlede cytoplasmatiske protein tæthed i respektive baner i nederste panel. Farvede stjerner udpege væsentlige forskelle mellem anførte prøver (p < 0,05, n = 4). Bemærk at cytoplasmatisk NF-kB niveauer højere i colostrum-pulverlak CX, STR og MPO end i hypothalamus kerner NTS, PVN og søn i uenighed med niveauer af NF-kB inhibitor (IkB). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: skematisk sammenligne hypotese OT signalering i colostrum-pulverlak gut og hjernen regioner. (A) Colostrum OT i enterocytes aktiverer sin receptor via direkte interaktion med OTR, reducere inflammation via øget IkB downstream signalering. Protein oversættelse er hæmmet af stigende p-PKR, hvilket mindsker elF2a aktivitet gennem fosforylering. Homeostase er genoprettet via øget BiP gen expression13,37. (B) Neuronal eller kredsløbssygdomme OT aktiverer sin receptor i hjernen, CS, STR og MPO regioner downregulating betændelse og protein oversættelse via de samme molekyler som tarmen (Se panel A). (C) den hypotetisk effekter af colostrum priming i NTS region af hjernen er adskilte og modsatte fra dem i paneler A og B. GCN2, som er følsomme over for aminosyre forsyning, øger både eIF2a og protein oversættelse. Samtidig tillade lave niveauer af IkB NF-kB at indtaste kernen og fremkalde betændelse. Bemærk, at BiP fungerer på samme måde for at genoprette homøostase i tarmen og i NTS i hjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure
Tillægs figur 1: skematisk viser protokollen tidslinjen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En teknik til microdissection af diskrete OTR-rige hjernen kerner i neonatal rotte hjernen er præsenteret i dette papir. Det er almindeligt anerkendt, at neuroner er højt specialiserede, selv inden for godt karakteriseret kerner i hjernen. Denne meget reproducerbare tilgang til at isolere bestemte OTR-rige kerner giver mulighed for robust hypotesetest. Ved hjælp af automatiserede Western blotting, blev konsistens og reproducerbarhed af resultaterne yderligere forbedret. Mens en begrænsning af denne teknik er fortsat beskedne hjerne punch variabilitet; denne teknik er et fremskridt over encellede, hele hjernen eller hjernen skive tilgange. Encellede tilgange er kompliceret ved at levere meget begrænsede snap shots. Ved hjælp af hele hjernen, kan alle resultater være fortyndet hvis virkningen er begrænset til et område af hjernen eller neuronal undertype. Hjernen skive tilgange uden microdissection kan indføre gennemgribende variation i resultaterne inden for blotte mikron i en skive, der er specielt problematisk for hypothalamus i denne undersøgelse, på grund af stramme klynger af forskellige kerner. Bruger en standardiseret punch og bistand fra et mikroskop, blev variation i protein målinger reduceret.

Der er flere kritiske trin inden for denne protokol. Disse omfatter tilslutning til timingen af væv høst med hensyn til det første foder, ved hjælp af en minimal mængde af protein ekstraktionsbuffer, inkubation af hjernen skiver i ACSF, så de molekylære hæmmere eller stimulanser kan anvendes, og ved hjælp af en følsom immun-elektroforese enhed. Mulige ændringer omfatter valg af reagenser til udrugning og varigheden af inkubationen og udvide tid af unprimed sult for at sammenligne hjerner på tilsvarende gange. Vigtige begrænsninger omfatter tilstedeværelsen af nogle ikke-neuronale celler (selv i dette meget tidlige neonatale periode) og et begrænset antal prøver, der kan fremstilles af et kuld af nyfødte på én dag. Desuden, denne fremgangsmåde er helt afhængige af når hvalpene er født. Forhold til eksisterende metoder, er Gen-ekspression i hjernen i denne alder typisk og mere bekvemt vurderet på transkriptionel niveau. Men for celle signalering analyse, proteom tilgang henrettet af core facilitet udstyr er dyrere end de stationære automatiske instrumenter. Den konventionelle vestlige skamplet metode kræver meget mere protein, tager flere dage at fuldføre, og indebærer flere manipulation trin af den tekniske arbejdskraft. Denne automatiserede tilgang kræver 0,8 µg protein pr. kapillær, når indlæst i instrumentet alle trin er uden udført menneskelige hænder indblanding og tager 2 timer og 50 min at afslutte Kør. Denne teknik kan bruges til at studere den umiddelbare postnatal hjernens udvikling i rotter og bred vifte af genetisk manipulerede musemodeller.

Brug af denne teknik, undersøgte virkningerne af OT på cellulært niveau, specielt i den meget kritiske periode mellem fødsel og fodring, Kommissionen når OTR er maksimalt udtrykt i epitel8. OT modulerende virkning på celle signalering molekyler i gut celler, både i en celle linje37 og in vivo13, blev tidligere vist. I den foreliggende undersøgelse vurderet effekter observeret i gut celler i hjerneregioner rige på OTR. Udtryk for BiP/GRP78 og p-eIF2a blev upregulated i unprimed (i overensstemmelse med en forventede reaktion på stress) og downregulated i PRIMES NTS væv (i overensstemmelse med en svækket reaktion på stress), der henviser til, at NF-kB var høj og stabil i begge betingelser 38. udtryk af BiP og NF-kB var de samme i de øvrige testede regioner i både unprimed og primet betingelser. eIf2a var fosforyleret af dsRNA afhængig kinase (pPKR) i søn, CX, STR og MPO. Men i NTS, og i mindre grad i PVN, eIf2a var fosforyleret af en anden kinase, generel kontrol nonderepressible-2 kinase (GCN2). En skematisk skildrer hypotese forskelle i signalering i hjernen og gut fremkaldes ved colostrum eksponering er præsenteret i figur 7.

Denne microdissection teknik gør det muligt at teste hypoteser relateret til virkningen af den første colostrum feed på stress-relaterede signalering i diskrete OTR-rige kerner i neonatal hjernen. Disse data tyder på, at stress modulerende mekanismer tidligere observeret i nye født gut enterocytes spejles i specifikke hjerneregioner rige i OTR, som det fremgår af øget cytosole fastholdelse af NFKB (PVN, søn CX, STR og MPO). Resultaterne viser også, at NTS og PVN udnytte forskellige fosforylering mekanisme fra de andre regioner, der er refraktære over for virkningen af næringsstof insufficiens. Kollektivt, viser dataene, at celle signalering i hjernen forbundet med næringsstoffer og hormonelle insufficiens i de første timer følgende fødsel er magen til celle signalering i tarmen på samme betingelser. Denne data understøtter vigtigheden af modermælk på tidspunktet for fødslen for stress graduering i både gut og hjernen. Disse resultater understreger behovet for yderligere udforskning af virkningen af råmælk på hjernefunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Manon Ranger og Alexandra Schulz for deres bistand ved udarbejdelsen af denne protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 næringsstof insufficiens kernen tractus solitarius (NTS) stress respons generel kontrol nonderepressible 2 (GCN2) nuklear factor-kB (NF-kB) eukaryote oversættelse indledningen faktor 2A (eIF2a)
Vurdering af cellulært Stress og Inflammation i diskrete Oxytocin-secernerende hjernen kerner i Neonatal rotten før og efter første råmælk fodring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M.,… More

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter