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Immunology and Infection

Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn in Verbindung mit der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Diese Technik erlaubt die Studie von Nährstoff-Insuffizienz Stress im Gehirn wie von Enterozyten Signal moduliert.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist, Oxytocin-Rezeptoren reichen Gehirn Kerne im neonatalen Gehirn vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Die Expression von Proteinen reagieren auf metabolischer Stress bekannt wurde im Gehirn-Kerne Isolate mit Western blotting gemessen. Dies wurde getan, um festzustellen, ob metabolischen Stress-induzierte Nährstoff Mangel im Körper neuronalen Stress ausgelöst. Wir haben bereits gezeigt, dass Nährstoff Insuffizienz bei Neugeborenen metabolischer Stress im Darm entlockt. Darüber hinaus moduliert Kolostrum Oxytocin zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten vor und nach ersten Feed. Signalisierung von Protein-Marker, die mit dem endoplasmatischen Retikulum Stress [ER Chaperon Immunglobulin Bindeprotein (BiP), eukaryotic Übersetzung Einleitung Faktor 2A (eIF2a), und eIF2a-Kinase Proteinkinase R (p-PKR)], sowie zwei Entzündung-Signalisierung Proteine [nuklearer Faktor κB (NF-kB) und Inhibitor κB (IkB)], wurden in Neugeborenen Gehirn Kerne gemessen [Kern des einsamen Trakt (NTS), paraventrikulären Nukleus (PVN), supra-Optik Kern (Sohn), Kortex (CX), Striatum Kerne (STR), und mediale präoptischen Kern (MPO)] vor der ersten Feed (entschärften von Kolostrum) und nach dem Start der Krankenpflege (grundiert von Kolostrum). Ausdruck des BiP/GRP78 und p-eIF2a wurden hochreguliert in ungestrichenen und herunterreguliert in grundiert NTS Gewebe. NF-κB wurde (hoch) in das Zytoplasma CX, STR und MPO beibehalten, während NF-κB niedriger und im NTS, PVN und Sohn unter beiden Bedingungen unverändert war. Die kollektiven BiP und p-eIF2 Erkenntnisse stehen im Einklang mit einer Stress-Reaktion. eIf2a war der Sohn, CX, STR und MPO durch DsRNA abhängige Kinase (p-PKR) phosphoryliert. Allerdings wurde in der NTS (und in geringerem Maße in PVN), eIf2a von einem anderen Kinase, allgemeine Kontrolle-Nonderepressible-2-Kinase (GCN2) phosphoryliert. Die Stress-modulierende Mechanismen zuvor beobachtet in Neugeborenen Darm Enterozyten erscheinen in einigen OTR-reiche Gehirnregionen gespiegelt werden. Die NTS und PVN kann einen unterschiedlichen Phosphorylierung-Mechanismus (unter Nährstoffmangel) aus anderen Regionen zu nutzen und refraktär gegenüber den Auswirkungen der Nährstoff-Insuffizienz. Diese Daten zufolge Kollektiv Gehirn Reaktionen auf Nährstoff-Insuffizienz Stress durch Signalisierung von Kolostrum grundiert Enterozyten ausgeglichen sind.

Introduction

Im Gegensatz zu unserem Verständnis der frühen Entwicklung des Gehirns im Laufe von Tagen bis Wochen nach der Geburt auftreten, ist relativ wenig über die Vielzahl von dynamischen Veränderungen in den ersten Stunden des Lebens in Ratten bekannt. Eine zentrale Herausforderung wurde die geringe Größe des Gehirns neonatalen Ratte und eine Voraussetzung für High-Tech-Werkzeuge, diskrete Hirnregionen oder einzelne Zellen zu isolieren. Studien beurteilen oft gen Transkription und keine Übersetzung1,2, die kein festes Verständnis der funktionalen Ebenen der aktivierten Signalmoleküle geben. Andere untersuchen Ausdruck verwenden Immunohistochemistry, Referenz Hirnregionen, die für die Quantifizierung der Ausdruck Level3nicht zulässt. Keine Studie bis heute hat die Aktivierung der Signalwege verbunden mit Ratten erste Colostrum ernähren sich in diskreten Hirnregionen, die erfordert schnelle Isolierung und Opfer und Messung der Proteinexpression und Protein-Phosphorylierung mit westlichen untersucht beflecken. Während auf älteren und größeren Gehirn Gehirn Mikrodissektion durchgeführt wird, haben wir keinen Verweis durchführen einen Single-Cell Gehirn Schlag in einem P0 Gehirn identifiziert. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Isolierung von eingeschränkter Hirnregionen Neugeborenen mit einer relativ Low-Tech-Punch-Technik und ein Western-Blot-Verfahren zur Proteinexpression in relativ kleinen Proben zu messen. Dieses Protokoll möglicherweise geeignet für Forschungsfragen, die die Beurteilung der Proteinexpression und post-translationalen Modifikationen erfordern (z. B.., Phosphorylierung) in relativ begrenzten Regionen kleine Gehirne aller Arten, sofern die Benutzer kann die Hirnregion des Interesses mit Atlas und identifizierbaren Wahrzeichen optisch identifizieren.

Diese Technik wurde entwickelt, um Veränderungen im Gehirn durch die Neugeborenen Ratten erste Kolostrum zu füttern, die ist reich an Oxytocin (OT) zu verstehen. OT ist seit langem bekannt für seine Fähigkeit, Milch Milchspendereflex und uterine Kontraktion zu stimulieren. OT ist jedoch jetzt bekannt, um eine Vielzahl von Rollen spielen bei der Regulation vieler Körperfunktionen und Verhaltensweisen4. Z. B. OT wendet sich gegen Stress und Entzündungen in Verbindung mit adaptive affiliative Verhaltensweisen5, verzögert die Magenentleerung und verlangsamt die Darmpassage. OT-Rezeptoren (OTR) wurden im enterischen Neuronen und Darmepithel6,7,8nachgewiesen. Die Magen-Darm-Wirkungen der OT sind besonders wichtig für das Kind während der frühen postnatalen Periode. Zum Beispiel stillen ist verbunden mit der Lieferung von erheblichen Mengen von OT zu den Neugeborenen Darm9,10, und Daten zeigen, dass die OTR während die Milch, die Periode8Spanferkel im Zwölffingerdarm Zotten stark überexprimiert ist.

In-vitro- Experimente mit einer Darm-Zelllinie haben auf zellulärer Ebene unter Beweis gestellt, dass Oxytocin moduliert wichtiger Moleküle in den Stress Weg11,12 -Signalisierung und spielt eine regulierende Rolle in der Übersetzung von Proteinen 12. diese Studien deuten darauf hin, dass Bestandteile der Milch, einschließlich exogener Oxytocin von der Mutter in unfolded Protein Response beim Neugeborenen zu zellulären Stresses13wichtig sind.

In Vivo und ex Vivo -Studien haben gezeigt, dass Kolostrum OT die zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten moduliert. Neugeborenen Enterozyten erleiden erhebliche zellulären Stresses auf ihrer luminalen Seite wenn Darm Microbiota gleichzeitig von der Mutter in Kolostrum14,15 und zahlreichen Proteinen, einschließlich der Hormone wie OT9 ausgesetzt ist , 10 , 16.

Die Auswirkungen der OT auf das Gehirn wurden studierte17. Die OT Signalisierung Mechanismen im Darm während der frühen postnatalen Periode nachgewiesen wurden jedoch nicht im Gehirn untersucht. In diesem Papier wird eine Methode zur Isolierung von diskreten Gehirn Kerne in der neonatalen Ratte Hirnstamm und Hypothalamus mit Elektrophorese verwendet, isolierte Hirnregionen zu profilieren. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, den Zustand der Zelle signalisieren in Hirnareale so nah wie möglich an Geburt, vor und nach der ersten Milch saugen, im Hirngewebe mit dem niedrigsten Glia/neuronale Index zu erfassen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Technik ist, dass es für die schnelle Lokalisierung der eingeschränkt, mikroskopische Gehirnregionen bei neugeborenen Welpen mit einer homogeneren Sammlung von Neuronen für ex-Vivo -Studien mit einer automatisierten Western blotting Methodik, bietet sehr konsistente Ergebnisse auf relativ kleine seziert Proben. Ein Manko der vorherige Arbeit beinhaltet mehr Brutto Dissektion (Gehirnscheiben oder ganze Gehirn) und ältere Tiere18,19. Die Gehirne von jungen Welpen sind unglaublich dynamisch, mit Wellen von Gliazellen Differenzierung nach der Geburt. Um Veränderungen im Gehirn beeinflusst durch der Welpen erste Fütterung zu studieren, ist das Studium beschränkt neuronalen Kerne mit reproduzierbaren Dissektion notwendig.

Milch-Feed wird in der Regel für ihre Ernährungs- und immunologische Auswirkungen auf Gesundheit oder gen-Ausdruck (z. B. im Enterozyten20,21), analysiert, während seine Wirkung auf Hirnareale während der Entwicklung des Gehirns ist kaum untersucht. Die Wirkung der Milch Transit im Darm auf die Gehirnfunktion wurde in Anlehnung an Darm Cholecystokinin Rezeptoren vagalen Relais Hirnstamm Kerne, aber nicht auf intrazelluläre Signal-Wege22analysiert. Gibt es eine umfangreiche Literatur auf das sich entwickelnde Gehirn Neugeborene Anfälligkeit für Unterernährung der Mütter während der Schwangerschaft23, aber der Stress und Entzündungen Signale werden nicht angesprochen. Die aktuelle Methode nutzt vor allem ein Phänomen bei Tag Null Ratte Neugeborenen, das Blut geboren Kolostrum Reize von vagalen Relais des viszeralen Reize isoliert. Dies ist die so genannte Hypo-Reaktionsfähigkeit Stressphase geprägt von unreifen Nucleus Gowersbündel Solitarius (NTS)-Hypothalamus Schaltung unmittelbar nach der Geburt24,25 , die NTS, paraventrikulären Nukleus (PVN), einschränkt und supraoptischen Kern (Sohn) Signale auf Blut geboren Reize.

Diese Methode ist nützlich für die Analyse von mehreren Signalwege und relativ auf neuronalen Zellen beschränkt, sofern Hirngewebe bei postnatalen Tag-0 bei Ratten geerntet wird, neben ob Mütter in Frage gestellt haben, indem Sie jede Art von Behandlung während der Schwangerschaft. Würfe können für die Wirkungen von Kolostrum feed versus Pre füttern Signalisierung analysiert werden. Beim Vergleich von Signalen zwischen den Hirnarealen mit Armen im Vergleich zu reiche Proteinausbeute ermöglicht diese Methode in der Kapillare Bestimmung des Gesamt-Protein der Polypeptid-Bands in Kapillaren, die parallel zur immun-Quantifizierung der Protein-Antigene. Diese Methode ermöglicht den quantitativen Vergleich, mit willkürlichen Maßeinheiten, Ergebnisse, die durch die gleichen Antikörper ohne quantitative Standardkurven und unter Bezugnahme auf Gesamt-Protein pro Kapillare. Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Antikörpern ist möglich nur mit quantitativen standard Kurven.

Diese Methode erlaubt für die Beurteilung der bidirektionalen Signaltechnik zwischen Darm und Gehirn und dass Funktion in beiden Organen26auswirken kann. Die Zuordnung zwischen Oxytocin und Nahrungsaufnahme, die in den letzten Jahren27ausführlich studiert hat, unterstützt einen Zusammenhang zwischen erhöhten Oxytocin Signal- und Nährstoffverfügbarkeit. Diese Studien auch unterstützen das Converse-Konzept diese Energie, die Defizite mit Reduzierung des Hypothalamus Oxytocin Signalisierung gekoppelt sind.

Frühere Studien über die Wirkung von OT auf Aktivität des Gehirns gezeigt, dass induzierte Darm Entzündung cFos Transkription im Hypothalamus PVN, Amygdala und Piriform Rinde löste die refraktär gegenüber Vagotomie28war. Systemische Infusion von OT mit Sekretin sank jedoch die Gehirn cFos Reaktion provoziert entzündliche Reaktion in der Darm-28. Dies suggeriert, dass die Wirkung von exogenen OT durch Strecken außer vagalen Relais, möglicherweise durch Blut übertragbare Signalmoleküle, durchgeführt durch die Area Postrema6,29durchgeführt wurde.

In dieser Studie wurden die zellulären Stresses Signalwege, die zuvor im Darm beobachtet haben im Gehirn bewertet. Die Hypothese war, dass Milchbestandteile können zu schützen oder die Wirkung von Entzündungen im Darm Durchlässigkeit für mikrobielle und andere Metaboliten zu verschieben, und wiederum, die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion. Die klare antagonistischen Unterschiede in der IkB versus BiP Signalisierung gefunden in Zotten, vor und nach dem Grundieren von Kolostrum13, vorgeschlagen, dass die Gehirne von Neugeborenen, noch in der Entwicklung, diese Signale Kolostrum-induzierte Darm spüren können.

Signalisierung Protein-Marker verwendet in früheren Darm-Experimente, die mit endoplasmatische Retikulum Stress verbunden sind, wurden gemessen. Dazu gehören das ER Chaperon BiP, Übersetzung Einleitung Faktor eIF2a (dient als eine Stress-Reaktion Integrator30), eIF2a-Kinase p-PKR, und zwei Entzündung-Signalisierung Proteine (NF-kB und die IkB-Hemmer).

Sechs Regionen des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit bei Erwachsenen absondern oder reagieren auf OT wurden ausgewählt. NTS, befindet sich in der oberen Medulla, ist das erste Relais der viszeralen Eingabe und erhält direkte Signalisierung von vagalen sensorischen Neuronen im Darm31 und möglicherweise Blut geboren Zytokine, Toxine und Hormone über die angrenzenden Bereich Postrema32. Der PVN supraoptischen Kern (Sohn), Striatum Kerne (STR), Großhirnrinde (CX) und mediale präoptischen Kern (MPO) erhalten aus dem Bauch heraus über die NTS-Signalisierung.

Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Stress-Reaktion während der unmittelbaren postnatalen vor Kolostrum Grundierung und unmittelbar nach der ersten Fütterung in NTS im Vergleich zum PVN und Sohn unterscheidet. Signalisierung im CX, unterschieden sich STR und MPO PVN und Sohn, sowie. Die unterschiedlichen Schutzfunktionen der zuvor gezeigten Zelle Stress und Entzündungen im Darm zu modulieren OT sind wahrscheinlich durch einige Bereiche des Gehirns spürte. Kollektiv, zeigen die Daten, dass auf zellulärer Ebene, während der ersten Stunden nach der Geburt, das Gehirn zu den metabolischen Stress mit Nährstoff-Insuffizienz reagiert. Die Daten zeigen auch, dass das Ausmaß und die Richtung der modulierenden Wirkungen der feed Kolostrum Region-abhängig sind und in einigen Regionen sie OT Effekte im Darm zuvor gezeigten spiegeln.

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Protocol

Diese Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der Columbia University und der New York State Psychiatric Institute genehmigt.

(1) Gewebe-Vorbereitung

  1. Bestellen Sie zeitgesteuerte trächtigen Ratten vom Hersteller.
  2. Folgen Sie zeitgesteuerten trächtigen Ratten durch die Beobachtung ihrer wachsenden Bäuche in den Wochen nach ihrer Ankunft und anschließend auf der Suche nach Welpen auf den voraussichtlichen Liefertermin durch die Überprüfung des Käfigs alle 2 h bis Lieferung beginnt.
  3. Welpen mit einer behandschuhten Hand ihren Schwanz vor ihr erstes Futter für ungestrichenen Welpen (keine weiße Milch Bauch ergibt sich beim Bauch anzeigen) oder nach der ersten Fütterung für grundierte Welpen (an welcher Stelle ein weißen Bauch auf ihren Bauch sichtbar ist) zu entfernen, wie in der Timeli beschrieben Ne (Abbildung S1).
    Hinweis: Der erste Kolostrum-Feed wird als Grundierung der Welpe bezeichnet; Somit ist ein Welpe ungestrichenen bis das erste Futter, woraufhin Kolostrum grundiert sind.
  4. Enthaupten Sie schnell den unanesthetized Welpen mit scharfen, sauberen chirurgische Schere.
  5. Entfernen Sie das Gehirn durch Schneiden der Haut nach unten die Mittellinie und die Oberseite des Schädels an der Nase. Dann mit Pinzette, vorsichtig Hebeln Sie entfernt des Knochens um das Gehirn (Abbildung 1A) aufzudecken und zu lokalisieren Bregma, mit einem Stift markieren, da die Knochenplatten entfernt werden (Abbildung 1 b).
  6. Legen Sie das ganze Gehirn schnell in eine Polymethyl Methacrylat Gehirn Form bei Raumtemperatur für koronal schneiden bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
  7. Ohne Verzögerung machen Sie 500 mm dicke Scheiben mit einer frischen Rasierklinge. Legen Sie die Scheiben rostral zur kaudalen in einer Petrischale weiterhin Orientierung der Abschnitte (Abbildung 2).
  8. Schnell hinzufügen künstlicher Liquor cerebrospinalis (ACFS; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM Nahco33, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) ohne Glukose und inkubieren Sie die Scheiben für 60 min bei 28-30 ° C, ständig rühren, auf ein Orbitalschüttler metabolisch und differentiell versus Kolostrum-vorbereitete Gewebe die ungestrichenen herauszufordern.
  9. Die Gehirn-Kerne, die erforderlich sind, um Punsch mit einem Gehirn Atlas33 und anatomischen Landmarken auf Abschnitt Gewebe zu identifizieren. Legen Sie diese Scheibe mit den Kernen von Interesse in einer Petrischale und verschieben Sie ihn auf dem sezierenden Mikroskop.
  10. Sobald visualisiert, Stanzen Sie schnell 4 von 6 verschiedenen Kernen mit einem erbohrte Tool, Auswahl der Größe den Kern in Frage am besten Punsch und konsequent zwischen Proben (Abbildung 2 aus).
    Hinweis: Die übrigen Gehirn-Scheibe ein Loch haben nun dem Gehirngewebe entfernt wurde. In dieser Studie herausgeschnitten wir die folgenden Kerne mit den folgenden Koordinaten. Alle anterior/Posterior (A / P) Koordinaten sind von Bregma (mit Ausnahme von NTS, die unter Bezugnahme auf die Calamus Scriptorius ist). Alle dorsal/Ventral (D/V) Koordinaten sind von der Oberfläche des Kortex (mit Ausnahme von NTS, die von der Oberfläche der Medulla ist). Die folgenden Koordinaten enthalten A / P, Medial/Lateral (M/L) und D/V in mm: 1) einsame Trakt Kern (NTS, A / P, 0,4 bis 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0.3 (von der Oberfläche der Medulla), 2) paraventrikulären Nukleus (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) supra-Optik Kern (Sohn, -1,1; ± 1,4; 4,3), 4) Kortex (CX, teilweise Kortex Bereich 1,-2.8; ± 1,5; 0,6), 5) Striatum Kerne (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8), und 6) mediale Preoptic Kern (MPO, -0.6; ± 0,2; 4,2).
  11. Tauchen Sie schnell die gestanzten Kerne in 0,06 mL eiskaltes, Protein Extraktionspuffer mit Protease-Inhibitoren und Phosphatase-Inhibitoren für 60 Minuten (siehe Punkt 2.3).

(2) Proteingewinnung

  1. Bereiten Sie die Proteinlösung Extraktion mit dem Protein-Lyse-Kit (Table of Materials) am Tag vor der erwarteten Welpen Lieferung.
  2. Tauen Sie die gefrorenen (-20 ° C) wässrige Lösung der Protease und Phosphatase-Inhibitoren die Lyse-Puffer-Kit (auf Eis) und die Lyse Puffer und DMSO-Lösung der Proteasen/Phosphatasen Inhibitoren auf Eis.
  3. Fügen Sie 1,85 mL Lyse-Puffer in einer sauberen, eiskalte 15 mL-Tube. Fügen Sie 0,1 mL wässrige Lösung von Inhibitoren und 0,05 mL DMSO aufgelöst-Inhibitoren. Zu guter Letzt Kappe und kurz Vortex Rohr und halten Sie sie bei-20 ° C bis zur Verwendung.
  4. Beschriften Sie 24 sauber Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 mL) für die Lyse-Verfahren. Designierte 12 Tuben pro Gehirn für die Kolostrum entschärften Gruppe (U) [6 links (L) und 6 rechts (R) Gehirn Kerne] und Etikett nach Kernen Akronym, Seite und Zustand (z. B.., NTS-L-U, NTS-R-U, etc.). Beschriften Sie die zweite Gruppe von 12 Rohre für das Kolostrum-vorbereitete Proben.
  5. Beschriften Sie zwei zusätzliche Sets von Rohren, wie in Schritt 2.4 für die Lager Protein-Extrakte (mit 1,5 mL Eppendorf-Stil Rohre) und der erste Satz der Probenvorbereitung (mit 0,5 mL Röhrchen) getan. Halten Sie diese Rohre in zwei separate, beschriftete Einfrieren Boxen (jeweils für 100 Rohre ausgelegt). Ein Feld wird für die ungestrichenen Proben, die andere für die präparierten Proben verwendet werden.
  6. Tauen Sie die Lyse-Lösung auf dem Eis auf, auf den Tag, an dem die Welpen geliefert werden, und während der Inkubation Gehirnscheiben in ACFS, aliquoten 0,06 mL Lyse-Lösung in die Lyse Verfahren Röhren (von Schritt 2.4) und fügen Sie Kerne Schläge und im Eis 60 min inkubieren.
  7. Zentrifugieren Sie der inkubierten lysierten Kerne für 30 min in einer gekühlten Mini-Zentrifuge bei 14000 u/min (10.000 x g) und abzusaugen Sie sorgfältig 0,055 mL überstand mit einer richtig eingestellten Pipette. Den Überstand in die vorgekühlte 1,5 mL Lager Röhren (von Schritt 2.5) übertragen und auf Eis gelegt. Vor dem Einfrieren (bei-20 ° C) die Protein Lager Rohre übertragen Sie 0,012 mL Überstand in 0,5 mL vorgekühlte Rohre für die erste Probenvorbereitung (aus Schritt 2.5) und lassen sie auf dem Eis.

(3) Probenvorbereitung für die Messung In der Kapillare Protein

  1. Verwenden Sie eine Kit und bereiten Sie die Reagenzien für die Trennung nach Anweisungen des Herstellers. Fügen Sie 0,003 mL Reagenz Master-Mix hinzu, jeder der 12 Proben in der 0,5 mL beschriftet Röhren (von Schritt 2.5) auf dem Eis, die 0,012 mL der Protein-Extrakte enthalten.
  2. Schalten Sie den Heizblock bis 95 ° C und 0,004 mL Reagenz in Schritt 3.1 an eine biotinylierte Molekulargewicht (MW) Leiter in einem Rohr mit 0,016 mL entionisiertem Wasser zubereitet. Um die Leiter und Proben zu denaturieren, legen Sie die Leiter-Röhre und 12 Proben von ungestrichenen Protein-Extrakten in Heizblock bei 95 ° C für 5 min und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 2.0 bis 3.2 Proteingewinnung zur Probenvorbereitung für die Kerne von Kolostrum grundiert Ratten gestanzt.

4. Elektrophorese-Vorbereitung

  1. Tauen Sie das Biotin labeling Reagenz (gespeichert in der Tiefkühltruhe bei-80 oC) auf der Bank und bereiten Sie das Protein Detection Kit auf Eis bei 4 ° C nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Mischen Sie 0,15 mL von Luminol mit 0,15 mL Peroxid und laden Sie 0,01 mL in 25 Brunnen (Zeile E, Brunnen 1-25) der Platte für die automatische westlichen Maschine. Laden Sie 0,008 mL Streptavidin-HRP aus dem Kit in Brunnen D1, D25
  3. Laden Sie 0,01 mL diluent Antikörperlösung in Brunnen C1 C25 und B1.
  4. Spin die 24 Proteinproben und Leiter Rohre kurz (2-3 Sekunden) in einem Minicentrifuge zum Pool hinunter verdampfte Wasser von Rohr Kappen.
  5. Wells A2, A13, 0,003 mL 12 Kolostrum-vorbereitete Proben in Vertiefungen A14, A25 und 0,005 mL der biotinylierte Leiter in gut A1 bestücken Sie 0,003 mL 12 ungestrichenen Proben.
  6. Lassen Sie Reihe F leer und laden Sie 0,45 mL Waschpuffer in jeder der 5 Fächer in jeder der 3 Zeilen unter Zeile F. Cover der Platte mit Kunststoff Deckel um Verdunstung während der verbleibenden Verfahren zu vermeiden.
  7. Kurz die aufgetauten Biotin Wirbel Kennzeichnung Reagenz und 0,15 mL das Reagenz mit seiner ausgewiesenen Rohr; dann fügen Sie 0,15 mL Gesamtprotein Rekonstitution Agent hinzu und mischen sie zur Homogenität.
  8. Entfernen Sie die Abdeckung von der Platte und laden Sie 0,01 mL Agenten 1 und 2 in Vertiefungen B2 B25. Die Platte abdecken und für 10 min bei 1000 X g, Luftblasen aus den verschiedenen Lösungen zu entfernen zentrifugieren. Verwenden Sie einen leeren Teller in der Zentrifuge für Gleichgewicht.

(5) Elektrophorese

  1. Während sich die Platte dreht, öffnen Sie eine geführte Datei in der automatisierten westlichen Maschine angeschlossen Computer indem angibt, in der Dropdown-Liste-Seite von "Datei" zu einen Gesamt-Protein Assay laufen und auf den jeweiligen Ort.
  2. Beschriften Sie die Proben von Brunnen in den Computer. Dann entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge entfernen Sie die Abdeckung und ziehen Sie vorsichtig den Aluminium-Deckel aus die Trennung Lösung Fächer.
  3. Legen Sie die Platte in die automatisierte westlichen Instrument, ziehen Sie die Abdeckung von der Kapillare Patrone angezeigt, setzen Sie die Patrone in ihren vorgesehenen Platz und schließen Sie die Tür.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", und wenn Sie mit der Art des Tests ("Gesamt-Protein") aufgefordert werden, geben Sie den Namen der Proben (z. B. "entschärften 2-13 und Kolostrum grundiert 14-25"). Klicken Sie auf "OK", und wenn von aktivierten Laufdatum und ID-Nummer der Laufzeit-Datei aufgefordert werden, notieren Sie die Uhrzeit, zu der Flucht endet.
  5. Am Ende des Laufs (170 min nach dem Start) öffnen Sie die Tür des Instruments, entfernen Sie die Kapillare Patrone und entsorgen Sie es in der Kleie zur Verfügung. Entsorgen Sie die Platte in die biologische Materie zur Verfügung.
  6. Klicken Sie auf Trennung Kurven in der Seite "Analyse" der Laufzeit-Datei, und überprüfen Sie, dass alle Proben korrekt ausgeführt haben und verschiedene Protein-Kurven in alle Kapillaren zeigen.

6. Analyse von Signalproteinen

  1. Fügen Sie in einer beschrifteten 1,5 mL Tube 0,003 mL Kaninchen anti-Antikörper Phospho-eIF2a (p-eIF2a hinzu) und hängen Sie es in 0,3 mL (1: 100 Verdünnung) in Antikörper aus dem geeigneten Detection Kit Verdünnungsmittel. Dann halten Sie es auf dem Eis.
  2. Beschriften Sie ein Luminol-Rohr und fügen Sie 0,15 mL Luminol und 0,15 mL Wasserstoffperoxid aus dieser Erkennung Modul Kit und verzichten Sie 0,01 mL in Vertiefungen E1, E25 aus einer frischen, automatisierte westlichen Platte zu.
  3. Verzichten Sie 0,01 mL des sekundären anti-Kaninchen-Antikörper in Vertiefungen D2, D25 zu, und 0,01 mL Streptavidin-HRP aus dem Kit auf gut D1.
  4. 0,01 mL des primären Antikörpers (aus Schritt 6.1) in Vertiefungen C2, C25 zu verzichten, und Wells C1 und B1 bis B25 0,01 mL diluent 2 Antikörperlösung hinzufügen.
  5. Lassen Sie die Zeile F Brunnen leer und füllen Sie 0,45 mL Waschpuffer in die 5 Fächer 3 Reihen unterhalb der F-Reihe.
  6. Kurz drehen die gekühlten Proben für 3 s, und 0,003 mL jede Probe, Reihe A in der gleichen Reihenfolge, die sie für die Gesamt-Protein Assay, ab A2 bis A25 hinzugefügt wurden. Hinzugeben Sie 0,005 mL die biotinylierte MW Leiter auch A1 und die Abdeckplatte.
  7. Zentrifugieren Sie die Platte, wie in Schritt 4.8 getan. Während sich die Platte dreht, (in der automatisierten Western-assoziierte Software- und Computer) öffnen Sie eine neue run-Datei und geben Sie in der Drop-down-Seite von "Datei", um eine Molekülgröße Assay ausführen indem Sie auf den jeweiligen Ort.
  8. Geben Sie in der Test-Seite die Probennamen in jede Kapillare, dann geben Sie den Namen des primären Antikörpers in der zugewiesenen Stelle und der sekundären Anti-Kaninchen-Antikörper darunter.
  9. Am Ende der Zentrifugation wiederholen Sie Schritte 5,3-5,5, außer die Bezeichnung für die geführte Datei diesmal "p-eIF2a auf ungestrichenen 2 – 13 und 14 – 25 Kolostrum grundiert" sein sollte.
  10. Überprüfen Sie nach der Elektrophorese Trennung die geführte Datei für Immune Reaktivität Gipfeln der Antigene in Größen von 40 – 43 kDa. Wo MW der Gipfel dieser Größe fehlen, mit der rechten Maustaste unterhalb der Kurve und geben Sie in der Dropdown-Liste hinzufügen MW bis zum Gipfel, die sicherstellt, dass die Größe und beliebiger Anzahl unterhalb der Kurve aufgezeichnet werden.

7. Verarbeitung der Ergebnisse

  1. Eine Tabellenkalkulationsdatei für Gesamt-Protein führen in die automatisierte Western Open Datei ausführen und bieten eine ID-Nummer.
  2. Öffnen Sie die geführte Datei den Gesamt-Protein Assay auf der Seite "Analyse" auf die Kurve-Modus und markieren Sie alle Berge im einzelnen Kapillaren. Dann kopieren Sie und fügen Sie sie in der Kalkulationstabelle und Summe der Flächen unter der Kurve aller Peaks, die in der gesamten Kapillare aufgenommen.
  3. Ordnen Sie in einer separaten Spalte die Gesamtmenge an Protein für jede Spalte mit Kapillar-Nummern, Namen von den jeweiligen Gehirn Kernen und die ID-Nummern der geführten Dateien.
  4. Öffnen Sie eine Tabelle für das p-eIF2a-Antigen und in einer einzigen Spalte, nehmen Sie die Fläche unter der Kurve aus jede Kapillare Side-by-Side mit seinen jeweiligen Kapillare und Name des Gehirn Zellkern und ID-Nummer der Laufzeit-Datei auf.
  5. Die Gesamt-Protein-Spalte (Parallel zu den p-eIF2a-Kurve-Mengen) in eine dritte Tabelle kopieren und compute-p-eIF2a:total-Protein-Verhältnis in einer dritten Spalte.
  6. Erfassen Sie Ergebnisse aus Schritte 4 bis 6 für jedes Gehirn Kern, ordnen Sie sie in Gruppen von Kernen und generieren Sie ein Balkendiagramm zu.

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Representative Results

Die repräsentative Bands Immunoreactivity bezogen auf Gesamt-Protein zeigen, dass es Gehirn Kerne mit sehr niedrigen geschlagenem Eiweiß. Dies erfordert die Verwendung der automatisierten Western-Blot-Technik, die sehr empfindlich im Vergleich zu den kanonischen Western-Blot ist. Dieser Ansatz kann mit fortyfold weniger Protein pro Kapillare im Vergleich zu der pro-Spur in Western Blots ausgeführt werden.

Differentielle Effekte von Kolostrum Priming auf BiP-Niveaus im Gehirn Kerne

Koronalen Abschnitte der Ratte Gehirne wurden vor der ersten Kolostrum Fütterung (ungestrichenen) und nach der ersten Fütterung (grundiert) geerntet. Proben wurden durch Kapillarelektrophorese (auf WES) fraktioniert und Proteine wurden mit dem Kit für Gesamt-Protein in der Kapillare Färbung (siehe Protokoll) quantifiziert. Zusätzliche immun Kapillare Fraktionierung auf die automatisierte Western vorgesehen Identifizierung der jeweiligen Protein-Antigene. In Abbildung 3Azeigt repräsentative BiP-Protein-Expression im oberen Bereich, mit den entsprechenden Gesamt-Protein, siehe unten. BiP ist ein ER-Chaperon-Protein. Quantitated Immunoreactivities sind in Abbildung 3 bBalkendiagramme im Verhältnis zu den entsprechenden Gesamtprotein vorgelegt.

Innerhalb der ungestrichenen Gewebeproben BiP Niveaus in NTS waren signifikant höher im Vergleich zu allen anderen Regionen (p < 0,05, n = 4 Kerne). Grundieren der Darm Gewebe mit Colostrum hatte einen gegenteiligen Effekt in NTS, verglichen mit erhöhten BiP in anderen Regionen gegenüber ungestrichenen Gewebe (Abb. 3 b). Priming BiP in NTS (Abb. 3 b) abgenommen und hatte keinen Einfluss auf PVN und SOPT. Allerdings erhöht Priming BiP in CX, STR und MPO gegenüber ungestrichenen Gewebe. Diese Daten bedeutet, dass die BiP-Niveau in den verschiedenen getesteten Gehirn Kernen anders reagieren Darm Grundierung und dass es nicht noch nachgewiesene Übersprechen zwischen den verschiedenen Kernen getestet.

Differentielle Effekte von Kolostrum Grundierung auf ElF2a und p-elF2a Ebenen im Gehirn Kerne

Gehirn Gewebeproben wurden vorbereitet, analysiert und quantifiziert, wie in Abbildung 3A und 3 bgezeigt. Als waren mit BiP-Niveau (Abb. 3 b), elF2a und p-elF2a erhöhte Niveaus in NTS in der ungestrichenen Zustand im Vergleich zu anderen Kerne (Abbildung 4 b und 4 C). Wie mit BiP-Niveau gezeigt hat, war die Resonanz in NTS Grundieren der Darm Gewebe mit Colostrum gegenüber, die in anderen Kernen. ElF2a und p-elF2a in NTS waren gegenüber ungestrichenen Gewebe reduziert. In allen anderen getesteten Kernen Grundierung erhöhte elF2a und p-elF2a gegenüber ungestrichenen Gewebe (Abbildung 4 b und 4 C).

Phosphorylierung des elF2a durch Kinase GCN2 NTS und PVN nach dem Kolostrum grundieren

Gehirn Gewebeproben wurden vorbereitet, analysiert und quantifiziert, wie in Abbildung 3dargestellt. Grundierung verstorbenen p-PKR in PVN (χ2 p = 0,025), anders als in allen anderen Regionen, wo es wurde erhöht. Im Gegensatz zu p-elF2a Ebenen Befunde (Abbildung 4), p-PKR waren gering bei ungestrichenen Proben relativ grundiert Proben in NTS (Abb. 5A). Phosphorylierung des elF2a ist in der Regel durch die Kinase PKR als Reaktion auf Viren-34 und OT im Darm, wie zuvor gezeigt11katalysiert. Die Tatsache, dass p-PKR Ebenen sehr niedrig in im Vergleich zu grundiert NTS (bezogen auf andere Kerne waren, Abbildung 5A) stark entschärften zeigen jedoch, dass eine andere Kinase in elF2a Phosphorylierung einbezogen werden muss (Abbildung 4). Dementsprechend wurden GCN2 Ebenen in NTS und PVN getestet, da auch eine bekannte elF2a35-Kinase ist. P-GCN2 (aktive Form) waren höher bei ungestrichenen Proben im Vergleich zu präparierten Proben in NTS und PVN (Abbildung 5 b) und GCN2 (inaktiver Form), im Vergleich zu p-GCN2, drückte sich umgekehrt in PVN (Abbildung 5). pGCN2 in NTS (Abbildung 5) äußerte ungestrichenen und grundierte NTS umgekehrt zu pPKR (Abbildung 5A). Grundierte Gewebe, p-eIF2a war wesentlich geringer als in anderen Hirnregionen NTS [PVN (p < 0,01), Sohn (p < 0,01), CX (p < 0,01) und MPO (p = 0,02)]. Dies bedeutet, dass diese pGCN2, anstatt pPKR, eIF2 Hemmung in NTS verantwortete.

Kolostrum Priming hemmt NF-kB in CX, STR und MPO

Abbildung 6A zeigt, dass die IkB Ebenen waren signifikant höher in Sohn entschärften Proben Vs grundiert Proben. IkB-Ebenen in Sohn, CX, STR und MPO tendierte höher in die gleiche Richtung. In Abbildung 6waren NF-κB-Ebenen in CX, STR und MPO signifikant höher in gegenüber ungestrichenen Gewebe grundiert. NF-κB Ebenen waren jedoch grundiert NTS Gewebe, was darauf hindeutet, dass Kolostrum eine ausgeprägte entzündungshemmende Wirkung auf diese Region des Gehirns hatte deutlich geringer. Cytosolischen NF-κB war höher () in ungestrichenen NTS Rückstellmuster, während seine Inhibitor IkB niedrig und unverändert in präparierten Proben. Dies deutet darauf hin, dass ein ausgeprägter entzündungshemmende Mechanismus NF-kB in NTS regelt. Dieser Nährstoff Insuffizienz-Stress-Effekt steht im Einklang mit aktuellen Erkenntnissen, die Marker betonen BiP und p-eIF2a beide durch die Anwesenheit von Kolostrum Priming geregelt sind (Abbildungen 3 und 4, beziehungsweise), auch gezeigt in früheren BiP und p-elF2a Ergebnisse10. Der Grund für die unterschiedliche Reaktion der IkB und NF-κB in NTS verglichen mit CX, STR und MPO ist noch nicht vollständig geklärt. Jedoch steht es im Einklang mit der Beobachtung, die die NTS, die Signale aus dem Bauch heraus an das Gehirn weiterleitet, eine entscheidende Rolle bei der Reaktion eindeutig und entgegengesetzt im Vergleich zu anderen Gehirnregionen, die im Vergleich zu peripheren Entzündung36spielen können. Ebenen der IkB in CX, STR und MPO waren niedrig (Abb. 6A), gegenüber dem hohen Niveau von NF-kB in den gleichen Gebieten (Abbildung 6). Während dieser Befund offenbar die Prämisse widerspricht, dass IkB ist verbindlich und Beibehaltung NFkB in das Zytosol, unterschiedliche Berechnung der Daten, die kombiniert und vergleicht alle präparierte Proben in CX, STR und MPO mit Regression Analyse zeigt, dass NF-κB hoch korreliert mit IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Abbildung 1: neonatale Rattengehirn seziert. (A) sezierten Gehirns wird angezeigt mit Knochen entfernt, Bregma rostral. (B) das Gehirn wird angezeigt, nachdem eine Linie gezeichnet wurde am Bregma, wonach die restlichen Knochen-Platten entfernt wurden. (C) ist das Gehirn in einer Polymethyl Methacrylat Gehirn Form gezeigt, kurz vor mit einer Rasierklinge geschnitten werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Gehirn-Scheiben von rostral zur kaudalen mit Schlägen (rote Kreise) angeordnet. Abkürzungen: CX: Kortex, Scheitellappen; MPO: mediale präoptischen Bereich; NTS: Kern Gowersbündel Einsiedlern; PVN: paraventrikulären Nukleus; Sohn: supraoptischen Kern; und STR: Striatum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: BiP/GRP78 Antwort in NTS mit derjenigen anderer Kerne invertiert ist. (A) Vertreter BiP-Protein-Expression im oberen Bereich im Vergleich zu den Gesamt-Protein im Bedienfeld "unten" vorgestellt. Beachten Sie, dass die Gesamt-Protein-Dichte in den verschiedenen Kapillaren sind heterogen, und diese dienen zum Ausgleich des jeweiligen BiP Ausdrucks pro Protein im Bedienfeld "B. (B) gezeigt ist das durchschnittliche BiP bezogen auf Gesamt-Protein im Gehirn Kerne der ungestrichenen Proben ( (blau) im Vergleich zu Kolostrum-vorbereitete Proben (braun). Sternchen der jeweiligen Farben bezeichnen signifikante Unterschiede (p < 0,05, n = 4 Kerne) zwischen BiP in NTS versus BiP in den anderen Kernen. BiP-Ausdruck in ungestrichenen versus grundiert Proben in NTS sind denen in STR deutlich invertiert (χ2 p = 0,028, n = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: aktive und inaktive eIF2a (p-eIF2a) als Reaktion auf Kolostrum Priming gegenüber ungestrichenen Proben in NTS mit derjenigen anderer Kerne invertiert. (A) repräsentative eIF2a und p-eIF2a-Protein-Ausdrücke werden in den oberen Feldern angezeigt. Die Gesamt-Protein-Bahnen sind im unteren Bereich vorgestellt. (B) gezeigt ist die mittlere eIF2a von 4 Proben ausgedrückt bezogen auf Gesamt-Protein (vom unteren Schalttafel A) im Gehirn Kerne von ungestrichenen Proben (blau) im Vergleich zu Kolostrum-vorbereitete Proben (braun) und (C) die inaktive Form der eIF2a (p-eIF2a). Sternchen der jeweiligen Farben bezeichnen signifikante Unterschiede (p < 0,05, n = 4 Kerne) zwischen den beiden eIF2a Formen in NTS im Vergleich zu entsprechenden Ebenen in den anderen Kernen. Aktive eIF2a Ausdruck in ungestrichenen versus grundiert Proben in NTS sind deutlich in CX, STR und MPO invertiert (χ2 p < 0,05 gegen alle drei Kerne, n = 4). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: NTS drückt eIF2a Kinase p-GCN2 im Einklang mit p-eIF2 Ebene und umgekehrt zu p-PKR. (A) die Höhe der p-PKR (aktiviert DsRNA Kinase des eIF2a) ist ausgedrückt in entschärften versus Kolostrum grundiert NTS umgekehrt auf 1) die Höhe der p-PKR in PVN (χ2 p = 0,025) und 2) seine erwarten gezielte Substrat eIF2a nach seiner Phosphorylierung (zu p-eIF2a, Abbildung 2). Beachten Sie, dass das Muster der p-PKR in Sohn, CX, STR und MPO von ungestrichenen versus Kolostrum-vorbereitete Proben die jeweiligen Muster der p-eIF2a aus Abbildung 2passt. (B) aktivierte eIF2a Kinase (p-GCN2) in entschärften versus grundiert NTS Proben folgt ein ähnliches Muster des Ausdrucks der p-eIF2a aus Abbildung 2 und eine inverse Muster der pPRK Ausdruck von Abbildung 3A (χ2 p = 0.028). C = mittlere Ebenen der inaktiven GCN2. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: zytoplasmatischen Expression von NF-kB und IkB in Gehirn Kerne von ungestrichenen und Kolostrum grundiert Darm Proben. (A) mittlere zytoplasmatischen Ausdruck der IkB bezogen auf Gesamt-Protein (vom Panel C) am angegebenen Gehirn Kerne. (B) repräsentative zytoplasmatischen Bands der IkB Protein werden im oberen Panel und Gesamt-Protein-Dichte im jeweiligen Bahnen im unteren Fensterbereich dargestellt. (C) mittlere zytoplasmatischen Ausdruck des NF-κB bezogen auf Gesamt-Protein (aus D) angegebenen Gehirn Kerne. (D) repräsentative zytoplasmatischen Bands der NF-κB-Bands werden in die obere Leiste und zytoplasmatischen Gesamtprotein Dichte im jeweiligen Bahnen im unteren Fensterbereich dargestellt. Farbigen Sternchen bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen den angegebenen Proben (p < 0,05, n = 4). Beachten Sie, dass zytoplasmatischen NF-κB-Ebenen höher in Kolostrum grundiert CX, STR und MPO als im Hypothalamus Kerne NTS, PVN und Sohn im Widerspruch mit den Ebenen des NF-κB-Inhibitor (IkB). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: schematischer Vergleich die Hypothese OT Signalisierung in Kolostrum grundiert Darm und Gehirn Regionen. (A) Kolostrum OT in Enterozyten aktiviert seinen Rezeptor durch direkte Interaktion mit OTR, Verringerung der Entzündung über erhöhte IkB nachgelagerten Signalisierung. Protein-Übersetzung wird gehemmt durch die Erhöhung der p-PKR, die elF2a Aktivität durch Phosphorylierung abnimmt. Homöostase ist über erhöhte BiP gen Ausdruck13,37wiederhergestellt. (B) Neuronal oder Durchblutungsstörungen OT aktiviert seinen Rezeptor in den CS, STR und MPO Regionen des Gehirns, Downregulating Entzündung und Protein Übersetzung über die gleichen Moleküle als Darm (siehe Panel A). (C) die hypothetischen Wirkungen von Kolostrum Grundierung in der NTS-Region des Gehirns unterscheiden und Gegenteil von denen in Panels A und B. GCN2, die sensibel auf Aminosäure-Versorgung, eIF2a und Protein Übersetzung erhöht. Zur gleichen Zeit können niedrige Niveaus der IkB NF-κB, geben den Kern und induzieren Entzündungen. Beachten Sie, dass BiP ähnlich wirkt, um die Homöostase im Darm und in NTS im Gehirn wiederherzustellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure
Ergänzende Abbildung1: Schaltplan zeigt die Protokoll-Zeitleiste. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Eine Technik zur Mikrodissektion von diskreten, OTR-reiche Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn wird in diesem Papier präsentiert. Es ist bekannt, dass Neuronen hoch, sogar innerhalb von gut charakterisierten Kerne im Gehirn spezialisiert sind. Diese hoch reproduzierbare Herangehensweise an bestimmte OTR-reiche Kerne isolieren kann robuste Hypothesentests. Verwendung von automatisierten Western blotting, waren die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse weiter verbessert. Während eine Einschränkung dieser Technik bescheiden Gehirn Schlag Variabilität bleibt; Diese Technik stellt einen Vorschuss über einzellige, ganze Gehirn oder Gehirn Slice Ansätze. Einzellige Ansätze werden durch die Bereitstellung von sehr begrenzten Schnappschüsse erschwert. Über das ganze Gehirn, können keine Erkenntnisse verdünnt werden, wenn die Wirkung auf eine Region des Gehirns oder neuronale Subtyp beschränkt ist. Gehirn-Scheibe-Ansätze ohne Mikrodissektion können tiefgreifende Variabilität der Ergebnisse innerhalb bloße µm in einer Scheibe einzuführen, die besonders problematisch für den Hypothalamus in dieser Studie, durch die enge Bündelung von unterschiedlichen Kernen. Mit einem standardisierten Schlag und die Hilfe eines Mikroskops, verringerte sich die Variabilität der Protein-Messungen.

Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls. Dazu gehören die Einhaltung der Zeitpunkt der Ernte Gewebe in Bezug auf das erste Futter, mit einem minimalen Volumen von Protein Extraktionspuffer Inkubation von Gehirnscheiben in ACFS molekulare Inhibitoren oder Stimulanzien verwendet werden können und mit einem sensiblen immun-elektrophoretische Gerät. Mögliche Modifikationen umfassen die Wahl von Reagenzien zur Inkubation und die Dauer der Inkubation und Verlängerung der ungestrichenen verhungern, um Gehirne zu entsprechenden Zeiten zu vergleichen. Wichtige Einschränkungen sind das Vorhandensein von einigen nicht-neuronalen Zellen (auch in dieser sehr frühen Neonatalperiode) und eine begrenzte Anzahl von Proben, die aus einem Wurf von Neugeborenen an einem Tag zubereitet werden können. Darüber hinaus ist dieser Ansatz völlig abhängig, wenn die Welpen geboren sind. In Bezug auf bestehende Methoden ist Genexpression im Gehirn in diesem Alter in der Regel und bequemer auf transkriptioneller Ebene bewertet. Die Proteomik Ansatz von Kern Raum Arbeitsgerät ausgeführt ist jedoch für Zelle Signalisierung Analyse, teurer als die Desktop-automatisierte Instrumente. Die herkömmlichen Western-Blot-Methode erfordert viel mehr Protein, nimmt mehrere Tage in Anspruch, und umfasst mehrere Schritte der Manipulation durch das technische Personal. Dieser automatisierten Ansatz erfordert 0,8 µg Protein pro Kapillare, einmal in das Instrument geladen alles, was die Schritte, ohne ausgeführt werden menschliche Einmischung Hände und dauert 2 h und 50 min zur Vervollständigung der Strecke. Diese Technik kann verwendet werden, für das Studium der unmittelbare postnatale Gehirnentwicklung bei Ratten und breite Palette von genetisch manipulierten Mausmodellen.

Mit dieser Technik wurden die Auswirkungen der OT auf zellulärer Ebene, speziell in der sehr kritischen Zeit zwischen Geburt und Fütterung, untersucht, wenn das OTR maximal im Epithel8zum Ausdruck kommt. Die modulierende Wirkung von OT auf Zelle Signalmoleküle im Darm Zellen, sowohl in einer Zelle Zeile37 und in-vivo13, wurden zuvor demonstriert. In der vorliegenden Studie wurden die Effekte im Darm Zellen beobachtet in den Gehirnregionen, die reich an OTR bewertet. Die Expression des BiP/GRP78 und p-eIF2a war hochreguliert in ungestrichenen (in Übereinstimmung mit einer erwarteten Reaktion auf stress) und herunterreguliert in grundiert NTS Gewebe (in Übereinstimmung mit einer abgeschwächten Reaktion auf stress), NF-κB lag hoch und stabil unter beiden Bedingungen 38. Ausdrücke des BiP und NF-κB waren die gleichen in den anderen getesteten Regionen bei ungestrichenen und grundiert. eIf2a wurde von DsRNA abhängige Kinase (pPKR) in den Sohn, CX, STR und MPO phosphoryliert. Allerdings wurde in der NTS und in geringerem Maße in PVN eIf2a durch eine andere Kinase, allgemeine Kontrolle-Nonderepressible-2-Kinase (GCN2) phosphoryliert. Eine schematische Darstellung die Hypothese auf Unterschiede bei der Signalisierung im Gehirn und Darm hervorgerufen durch Kolostrum Exposition ist in Abbildung 7dargestellt.

Diese Mikrodissektion Technik macht es möglich, Hypothesen in Bezug auf die Auswirkungen der ersten Kolostrum ernähren sich von stressbedingten in diskreten OTR-reiche Kerne im neonatalen Gehirn signalisiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Stress modulierenden Mechanismen zuvor beobachtet in Neugeborenen Darm Enterozyten in bestimmten Gehirnregionen, die reich an OTR, gespiegelt werden, dargestellt durch erhöhte cytosolische Eigentumsvorbehalt NFKB (PVN Sohn CX, STR und MPO). Ergebnisse zeigen auch, dass NTS und PVN nutzen verschiedene Phosphorylierung Mechanismus aus den anderen Regionen, die refraktär gegenüber den Auswirkungen der Nährstoff Insuffizienz sein können. Kollektiv, zeigen die Daten, dass die Zelle Signalisierung im Gehirn Nährstoff und hormonelle Insuffizienz in den ersten Stunden zugeordnet, die folgenden Geburt Zelle im Darm unter den gleichen Bedingungen ähnlich ist. Diese Daten unterstützt die Bedeutung der Muttermilch zum Zeitpunkt der Geburt Stress Modulation im Darm und Gehirn. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit für die weitere Erforschung der Auswirkungen von Colostrum auf die Gehirnfunktion.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Protokolls Manon Ranger und Alexandra Schulz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 141 Nährstoff-Insuffizienz Kern Gowersbündel Solitarius (NTS) betonen Antwort allgemeine Kontrolle Nonderepressible 2 (GCN2) nuclear Factor-kB (NF-kB) eukaryotic Übersetzung Einleitung Faktor 2A (eIF2a)
Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum
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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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