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Cancer Research

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58345

Summary

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

Abstract

Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.

Introduction

Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven Multimodalität Therapie2,3behandelt. Daher ist es wichtig, um das Risiko der invasiven Progression besser charakterisieren und therapeutische Interventionen zu entwickeln, die invasive Fortschreiten verhindern können, Verständnis der molekularen Signalwege, die Invasion auslösen.

Invasive Tumorprogression tritt in einem komplexen Umfeld für dreidimensionale (3D) und beinhaltet Tumor Zelle Interaktion mit anderen Tumorzellen, Stroma, Basalmembran und andere Arten von Zellen wie Immunzellen, Fibroblasten, Muskelzellen und vaskuläre Endothelzellen. Durchlässige Unterstützung (z.B.Transwell) Assay-Systeme werden häufig eingesetzt, um Krebs Zelle Invasion4, aber diese Systeme quantitate sind begrenzt, weil sie nicht erlauben, mikroskopische Überwachung des Invasion in Echtzeit und die Entnahme von Proben für weitere Färbung und molekulare Analyse ist eine Herausforderung. Entwicklung eines 3-d-Blase Tumor Sphäroid Invasion zu studieren ist wünschenswert, weil dadurch die Aufnahme von definierten microenvironmental Komponenten mit dem Komfort einer in-vitro- Systeme.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein System, um die invasiven Prozesse der menschlichen Blase Krebszellen mit einem 3-d-Sphäroid Invasion Assay mit Kollagen-basierten Gel Matrizen und konfokalen Mikroskopie damit Ermittler Zelle Motilität überwachen zu verhören und Invasion in Echtzeit (Abb. 1A). Dieses System ist vielseitig und kann geändert werden, um verschiedene Stromatumoren Tumor/Einstellungen zu befragen. Es kann die meisten Blase Krebs-Zell-Linien oder primäre Blase Tumoren und zusätzliche Stromazellen Zellen enthalten, wie z. B. Krebs Fibroblasten und Immunzellen5,6,7verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine Matrix, bestehend aus Kollagen Typ 1, aber kann geändert werden, um andere Moleküle wie FIBRONEKTIN, Laminin oder andere Proteine Kollagen zu integrieren. Invasive Verfahren können für 72 h oder länger je nach der Fähigkeit, das Mikroskop und das verwendete verfolgt werden. Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung des Tumors in der 3-d-Matrix eingebettet, vor, während und nach dem Einmarsch ermöglicht das Verhör von Proteinen hochreguliert in invasive Zellen, wodurch wichtige Informationen, die normalerweise nicht vorhanden oder schwierig zu sammeln Verwendung von anderen 3-d-Kultur-Modellen. Dieses System kann auch genutzt werden, zu Bildschirm-Verbindungen, die Invasion zu blockieren und Signalwege, die solche Verbindungen betroffen abzugrenzen.

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Protocol

(1) wachsenden Krebs Sphäroide

  1. Anbau von Zelllinien
    1. Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz.
      Hinweis: Kulturmedien verwendet ist Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, modifiziert und mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in dieses Protokoll geliefert.
    2. Einen Tag vor Beginn des Experiments, trypsinize (mit 0,25 % Trypsin-EDTA) Zellen, Zellkonzentration zu quantifizieren und 1 x 106 Zellen in 3 mL Kulturmedien in jede Vertiefung eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte zu verteilen.
    3. Inkubieren Sie Zellen in niedrigen Anlage Bedingungen bei 37 ° C ≥16 h. Dies sollte ausreichend Zeit für die Zellen ermöglichen, Aggregat in Sphäroide für die meisten Blase Krebs-Zelllinien.
      Hinweis: Die Bildung der Sphäroide kann durch invertierte Hellfeld-Mikroskop beobachtet werden. Die optimale Größe und Anzahl der Sphäroide können auf einzelne Experimente abhängen, aber wir finden, dass Sphäroide mit Durchmessern von 50 µm bis 150 µm in der Regel für Zeitraffer-Bildgebung mit einem 20 X Objektiv geeignet sind.
    4. Weitere Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten oder Immunzellen in die Sphäroide integrieren mischen die gewünschten Zellen mit Krebszellen im gewünschten Verhältnis (1:1, 01:10, etc..) in einer ultra-niedrigen Anlage Platte und Inkubation bei 37 ° C ≥16 h Bildung ermöglichen gemischte Zelle Typ Sphäroide.
  2. Anbau von Primärtumoren
    Hinweis: Tumor Sphäroide auch primäre Blase Tumor abgeleitet werden können Quellen, wie z. B. Tumoren von karzinogen induzierten Blase Tumor Modelle8entwickelt. Zum Beispiel Blase Tumoren erzeugt von Mäusen gefüttert mit N-Butyl - N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosaminen (BBN), können geerntet und in kleine Stücke (ca. 0,5 mm3) mit sterilen chirurgischen Instrumenten zerkleinert. Verdaut Primärproben menschliche Blase Krebs auch in diesem System studiert werden können.
    1. Sammeln und 0,5 mm3 Tumor Stücke in 5 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen. Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie waschen einmal.
    2. Sammeln Sie Tumor Stücke durch Zentrifugation bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen den überstand und 5 mL DMEM mit 10 % FBS. Übertragen Sie Tumor Sphäroid/Medien Mischung auf eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C ≥16 h vor dem Einbetten in Kollagen-Matrix (siehe Punkt 2.3).

2. Vorbereitung der 3-d-Kultur-Kammer

  1. Typ-1-Kollagen (abgeleitet von Rattenschwanz) in DMEM mit 10 % verdünnen FBS, eine Mischung von 2 mg/mL nach Herstellerangaben zu machen.
    1. Kurzum, Kollagen mit entsprechenden Menge 1 N NaOH-Lösung mischen und DMEM durch sanfte pipettieren basiert auf den Anweisungen des Herstellers, physiologischen pH-Wert zu erreichen.
    2. Nach dem Mischen Kollagen und DMEM schnell Beschichten der Brunnen von der Kammer-Folie (für die meisten Anwendungen, Kammer-Folien mit einem Deckglas Nummer 1.5 ist optimal) mit dem Kollagen-DMEM-Gemisch vor Erstarrung (200 µL/Well). Ermöglichen Sie die beschichteten Kammer Folie stationär bei Raumtemperatur 15 Minuten.
      Hinweis: Die Zusammensetzung des Kollagen-basierten Matrix kann geändert werden durch Zugabe von anderen extrazellulären Matrix Zutaten wie Fibronektin und Laminin, entsprechend im Sinne des Experiments.
  2. Sanft pipettieren 500 µL Medium mit Sphäroide (oder Tumor Stücke, wenn primäre tumorprobe verwendet wird) aus der 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte in eine leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Warten Sie 2 min der Sphäroide auf den Boden des Röhrchens abrechnen zu lassen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus der Tube. Bereiten Sie eine andere Röhre von Typ-1-Kollagen (2 mg/mL) gemischt mit DMEM mit 10 % FBS und schnell die Sphäroide 500 µL dieser Mischung hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig die Sphäroide und Kollagen durch langsame pipettieren.
  4. Geben Sie 250 µL Sphäroide/Kollagen-Mischung in eine Kammer Kollagen-Pre-beschichtete Folie. Lassen Sie die Kollagen-Matrix mit Sphäroide vollständig zu festigen (ca. 30 min bei 37 ° C).
  5. Nachdem die Kollagenmatrix erstarrt ist, fügen Sie 1 mL DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung (Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Kammer Folie in einem 37 ° C Inkubator bis bereit für die Bildgebung mit 5 % CO2 geliefert.

(3) Zeitraffer live Cell Imaging

  1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und sicherzustellen Sie, dass der Klimakammer 37 ° C erreicht und wird mit 5 % CO2geliefert.
    Hinweis: Unser Mikroskop und Kammer erfordern in der Regel 1 h System Gleichgewicht zu erreichen.
  2. Sorgfältig übertragen der Kammer-Folie auf die Folie-Adapter am Mikroskop befestigt.
  3. Suchen Sie die Sphäroide mit einem low-Power-Ziel (z. B.5 X) und starten Sie Imaging mit dem Ziel, höhere Macht (in aktuellen Protokoll 20 X Objektiv wird verwendet für die meisten das live Cell Imaging für die bessere Bildqualität).
    Hinweis: Für primäre Blase tumorproben, können 5 X und 10 X Ziele benötigt werden um größere imaging-Bereich zu decken. Für unsere Zeitraffer-Aufnahmen der bildgebende Intervall wird als 30 min festgelegt und ein Z-Stapel wird verwendet, um das ganze Sphäroid Bild. In der Regel ist der Abstand zwischen Z-Scheiben bis 4 µm eingestellt für die 20 X Objektive und die Gesamtstrecke der Z-Achse ist rund 200 µm. Bilder mit DIC gewonnen werden können und mit Fluoreszenz wenn Gewebe bzw. Zellen fluoreszierende Protein Marker Hafen.
  4. Durchführen Sie Time-Lapse Bildgebung für 24-72 h.
    Hinweis: Die Dauer richtet sich nach dem Zelltyp und die Bedürfnisse des Experiments.

4. Vorbereitung der Probenblock mit Krebs Sphäroide für gefrorenes Gewebe schneiden

  1. Heben Sie vorsichtig den Block der Kollagen-Gel und Sphäroide aus der Kammer Folien mithilfe von kleinen Zange. Platzieren Sie den Kollagen Gel Block in einer Kunststoff-Histologie-Form.
  2. Spülen Sie das Kollagen-Gel mit 1 X PBS kurz, und dann fix it mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
    Achtung: PFA potentiellen karzinogen und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
  3. Waschen Sie dem Kollagen-Gel mit 1,5 mL 1 X PBS auf einen Shaker für 15 min. ersetzen die PBS und wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt 3 X.
  4. Tragen Sie dünn auf (ca. 3 mm) der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung unten eine neue Form der Kunststoff Histologie abdecken. Legen Sie die feste und Betten Sie Kollagen Gel oben auf das Office-Anpassungstool zusammengesetzte gewaschen ein, dann sorgfältig das ganze Gel durch das Ausfüllen der Formwerkzeugs mit zusammengesetzten unter Vermeidung der Bildung von Luftblasen im Office-Anpassungstool OCT.
  5. Lassen Sie die Form bei 4 ° C für 1 h.
  6. Legen Sie die Form mit der Probe und OCT Verbindung auf einer 100 mm Petrischale schwimmend auf flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Probe vollständig Schockfrosten.
  7. Die gefrorenen probenblock bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

5. Immunfluoreszenz Imaging für gefrorene geschnittenen Krebs Sphäroide

  1. Übertragen Sie die gefrorenen probenblock von-80 ° C Gefrierschrank auf-20 ° C-Kammer von einem Kryostat.
  2. Führen Sie konventionelle gefrorenes Schneiden durch Festlegen des Intervalls Abschnitt bis 7 µm. Lufteinschlüsse oder geschnittenen Proben an der Glas-Folie ohne Falten befestigen lassen.
    1. Speichern Sie die Folien bei-80 ° C vor der Durchführung weiterer Färbung.
      Hinweis: Verschiedene Intervalle können zur experimentellen Anforderungen anpassen.
  3. Die Folien für 1 h bei Raumtemperatur Lufttrocknen.
  4. Permeabilize die Proben mit PBS mit 0,5 % Triton x-100 für 15 Minuten.
  5. Wash Proben 3 X mit PBS für 10 min pro Waschgang.
  6. Umschließen Sie die Proben auf der Folie mit hydrophoben Barrieren mithilfe eine hydrophobe Barriere-Pen.
  7. Behandeln Sie die Proben mit blockierenden Lösung (1 X PBS mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA)), für 1 h bei Raumtemperatur.
  8. Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL der primäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 100 Verdünnung der Primärantikörper).
  9. Inkubieren Sie die Folien in der primären Antikörper bei 37 ° C für 1 h oder bei Raumtemperatur über Nacht (Inkubationszeit und Bedingungen variieren je nach Primärantikörper).
  10. Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).
  11. Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL sekundäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 300 Sekundärantikörper Verdünnung).
  12. Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).
  13. Färben Sie die Proben mit Hoechst 33342 Lösung (1 µg/mL, verdünnt mit PBS-Puffer) bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie Proben mit PBS 5 min.
  14. Montieren Sie die Proben mit Eindeckmittel und bedecke sie mit entsprechend großen Deckel rutscht. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 h zu, und führen Sie dann konfokalen Mikroskopie.

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Representative Results

Erfolgreiche Gestaltung von invasiven Blase Krebs Tumor Sphäroid erfordert die Bildung von geeigneter Größe Tumor Sphäroide aus Zell-Linien oder Primärtumoren. Abbildung 2 A zeigt entsprechend dimensionierte Sphäroide aus vier menschliche Blase Krebszelllinien (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J und UM UC18) entwickelt. Abbildung 2 B zeigt ein Tumor Sphäroid von einem BBN generiert Maus Blase Tumor in Kollagen-Matrix eingebettet. Diese Sphäroide eingebettet waren, wie oben beschrieben und repräsentative Bilder wurden aufgenommen mit einem Mikroskop für live Cell Imaging ausgestattet. 20 X Objektiv wurde für die Belichtung UM-UC9, UM UC13, UM UC14 und UM UC18 Sphäroide verwendet, während mit 5 X und 10 X Objektivlinsen Maus Blase Tumor Sphäroide untersucht wurden.

Repräsentative Bilder der menschlichen Blase Zelle Zeile Sphäroide nach 24-72 h (Abb. 2A) und Maus BBN primäre Blase Tumor Sphäroide (Abbildung 2B) zeigen Blase Krebs Migration in die Kollagenmatrix. 253J, eine nicht-invasive Zelllinie bleiben weitgehend erhalten, mit wenig oder gar keine Migration (Abb. 2A). Videos 1, 2und 3 zeigen die Zeitraffer-Invasion Prozess für UM-UC9, UM UC13 und UM UC14 Sphäroide, beziehungsweise. Video 4 zeigt die Invasion Eigenschaften ein UM-UC18-Sphäroid. Video 5 zeigt die beiden Bereiche der Maus Blase Tumor aus 66 h, 87 h Post-Kollagen einbetten.

Um die Machbarkeit der Verwendung von Immunfluoreszenz Färbung der Protein-Marker in unsere invasiven Tumor Sphäroide zu demonstrieren, wurden sie fixiert und gefärbt in 24 oder 72 h. Abbildung 3 zeigt repräsentative Proben für Ataxia Telangiectasia Gruppe gebeizt D-assoziierten Protein (ATDC, auch bekannt als TRIM29), ein Protein, das spielt eine bedeutende Rolle in der Tumorgenese und Krebs Fortschreiten der menschlichen Blasen- und Bauchspeicheldrüsenkrebs9,10, Tubulins (α und β), die Mikrotubuli bilden und Spielen Sie eine Schlüsselrolle bei der Gestaltung der Zell- und zelluläre Bewegung11,12, Keratin 14 (KRT14), eine basale epitheliale Marker Invasion13und Vimentin (VIM), ein mesenchymalen Marker14,15beteiligt, 16. Diese Bilder zeigen, dass Visualisierung zellulärer und subzellulärer Strukturen mit dieser Methodik durchgeführt werden kann. Die höhere Vergrößerung Ansicht UM-UC14 zeigt filamentösen Färbung für ATDC(Abbildung 3). Die sehr invasiven Zellen verbreitet von UM-UC18 Sphäroide nach 24 h Invasion express hohe VIM, ein Marker für epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT, Abbildung 3B).

Einbeziehung der verschiedenen Zelltypen (Krebs-assoziierten Fibroblasten) in den Tumor Sphäroide ist machbar und bietet eine Möglichkeit, Heterologe Zell-Zell-Interaktionen (Abbildung 4 und Video 6) zu prüfen. In diesem Beispiel verwendeten wir rote Fluoreszenz-Protein (RFP)-beschrifteten menschlichen Fibroblasten und die 253J Blasenkrebs Zelllinie mit einem Vektor für den Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) ausgestrahlt. Diese Zellen waren gemischt, um Form Tumor Sphäroide und eingebettet in Kollagen. Die Invasion-Prozess von konfokalen Mikroskopie überwacht. Abbildung 4 zeigt, dass Interaktion mit Fibroblasten 253J invasive Verhalten modulieren kann.

Abbildung 5 zeigt das Dienstprogramm die Testsystem Inhibitoren der Invasion zu testen. Cytochalasin D ist ein bekannter Inhibitor der Zelle Migration und Invasion die wirkt durch die Blockade Aktin-Polymerisation17,18 und diente als Vorbild. Cytochalasin D Behandlung gehemmt, die Invasion der UM-UC9 Sphäroide (Abb. 5A). Die gleiche Konzentration an Cytochalasin D (0,2 µM) ist in der Lage, teilweise Invasion UM UC18 Sphäroide (Abb. 5B) hemmen. Da das System mehrere Brunnen und Tumor Organellen parallel Image verwendet werden kann, ist es offen für screening eine begrenzte Panel pharmakologische Wirkstoffe für Auswirkungen auf die Invasion.

Figure 1
Abbildung 1 : Setup für 3-d-Invasion-Assay mit live Cell Imaging. (A) schematische Übersicht für 3-d-live Cell Imaging und Immunfluoreszenz. (B) Deckglas Kammer mit Kollagen und Medien in diesem Experiment verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Blase Krebs Sphäroid Invasion. (A) Beispiele für menschliche Blase Krebs Zelle Zeile Sphäroide in eine Kollagen-Gel-Matrix eingebettet. Sphäroide werden zum Zeitpunkt der Einbettung (0 h, oberste Zeile) oder nach 72 h (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J) oder 24 h (UM-UC18) angezeigt. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Beispiele von BBN-induzierten Maus Blase Tumorinvasion in die Kollagenmatrix. Pfeile zeigen die invasiven Rand des Tumors Sphäroid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Immunfluoreszenz Analyse der invasiven Blase Krebs Sphäroide. (A) UM UC14 Tumor Sphäroid nach 72 h Invasion in Kollagen. Proben wurden durch konventionelle Immunfluoreszenz-Assay für ATDC (grün), Tubulin (violett) und Kerne (Hoechst Fleck blau) gefärbt. Weißes Quadrat gibt den Bereich mit höheren Vergrößerung Blick in die untere Zeile rechts zwei Verkleidungen gezeigt. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) UM UC18 Tumor Sphäroide gebeizt für KRT14 (grün), VIM (rot), ATDC (violett) und Kerne (Hoechst Fleck blau) nach 24 Stunden der Invasion in Kollagen. Maßstabsleiste = 50 µm. weiße Quadrat zeigt den Bereich mit höheren Vergrößerung Ansicht im unteren rechten Bereich angezeigt. Gestrichelte Linie zeigt grob die Grenze des ursprünglichen Tumors Sphäroid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Eindringmittel beschriftet Tumor Sphäroid Einbeziehung Fibroblasten. Invasion der GFP-Label 253J Blase Krebszellen allein (untere Verkleidungen) oder Co kultiviert mit RFP-Label Fibroblasten (Paneele) überwacht für 24 h Skala bar = 50 µm. Invasion wird durch Zugabe von Fibroblasten, das Kultursystem (Oberseite) verbessert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Effekt einer kleine Molekulare Droge targeting Aktin-Polymerisation Invasion. (A) UM-UC9 Tumor Sphäroid behandelt mit Cytochalasin D (0,2 µM) oder DMSO (Fahrzeugkontrolle) und überwacht für 72 h (B) UM UC18 Tumor Sphäroid mit Cytochalasin D oder DMSO für 24 h Skala behandelt bar = 50 µm. gestrichelte Linie zeigt die Grenze des Originals Sphäroid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Mögliches problem Empfohlene Lösung
Niedrige Anzahl der lebensfähigen Sphäroide • Erhöhung der Anzahl von Zellen in Suspension kultiviert
• Stellen Sie sicher > 90 % Zellen sind lebensfähig nach Typsinization
• Check-Zellen für die Kontamination
• Pflegen Zellen im logarithmischen Wachstums vor Typsinizing
• Optimierung von Zellkulturmedien
• Ändern der Kulturzeit in Suspension Zustand
• Versuchen Sie alternative Zelllinien
Sphäroide sind zu groß oder zu klein • Stellen Sie die Anzahl der Zellen hinzugefügt, um niedrige Befestigungsplatte
• Benutzen Sie sanfte pipettieren zu größeren Aggregaten der Zelle brechen
Schwer zu konzentrieren während der Vorstellung • Stellen Sie die Dicke der Kollagen-Gel. Versuchen Sie für Objektive mit kurzer Arbeitsabstand, das Kollagen dünner gel.
• Achten Sie darauf, dass die Kammer Folie oder Deckglas #1.5
• Optimierung die Größe der Sphäroide (50 – 150 µm im Durchmesser)
Die Zellen Wandern aus der imaging-Zone während der Invasion assay • Reduzieren Sie die Größe der Sphäroide
• Die bildgebende Zone alle 24 h neu zentrieren, bei Bedarf
• Einbindung Fliesen imaging-Technologie (falls zutreffend) größere Fläche zur Deckung
• Verwendung von alternativen Zelllinien
Die Kammer-Folie trocknet aus • Vergewissern Sie sich im Klima-Kammer-Setup gibt es keine Leckage
• Achten Sie darauf, dass die Feuchtigkeit Kontrollmechanismus funktionsfähig ist

Tabelle 1: Problembehandlung der 3-d-Invasion-Modell.

Movie 1
Video 1: Zeitraffer-video zeigt UM-UC9 Sphäroid kultiviert in Kollagen von 0 bis 72 h. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2
Video 2: Zeitraffer-Video zeigt kollektiven Migration von UM-UC13-Sphäroid kultiviert in Kollagen von 0 bis 72 h. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 3
Video 3: Zeitraffer-Video von UM-UC14-Sphäroid kultiviert in Kollagen von 0 bis 72 h. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 4
Video 4: Zeitraffer-Video von UM-UC18 Sphäroid kultiviert in Kollagen von 0 bis 24 Uhr Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 5
Video 5: Zeitraffer-Video von BBN-induzierten Maus Blase Tumoren 6684 h Post-Kollagen einbetten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 6
Video 6: Zeitraffer-Video zeigt Krebs Sphäroide gebildet von GFP-Label 253J Zellen gemischt mit RFP-Label menschlichen Fibroblasten (links) oder 253J GLP-markierten Zellen allein (rechts). Sphäroide wurden in Kollagen eingebettet und überwacht für 24 h Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien für die Prüfung der Signalwege, die Invasion Prozesse beeinflussen) erzeugt werden, und die Maus primären Tumoren (hier beschrieben). Es kann möglicherweise auch für menschliche Primärtumor Analyse angepasst werden. Je nach dem abbildenden System verwendet kann die Fluoreszenz in Echtzeit oder durch Fixierung und Färbung zu verschiedenen Zeitpunkten Immunfluoreszenz überwacht werden. Das System kann auch verwendet werden, um potentielle Inhibitoren der Invasion zu testen. Dadurch wird das System ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, um Blase Krebsbiologie zu beurteilen.

Der konfokalen Mikroskopie-System mit einer Klimakammer bietet Temperaturregelung, feuchteregulierung und CO2 -Versorgung ist ein wesentlicher Bestandteil der Ausrüstung für den Bau des Modells in diesem Protokoll beschrieben.

Es wurde weit berichtet worden, dass 3-d-Kulturen spezialisierte Mikroumgebungen bieten die nativen Gewebe für Zelle Biologie und Krebs Studien19,20besser nachahmen. Viele Studien setzen auf durchlässige Membran einfügen-Assays, die nicht die Bedingungen entsprechen unter der Invasion in Vivoauftritt. Des weiteren können diese konventionellen Studien einfache Überwachung des Prozesses in einer Echtzeit-Mode Invasion weder detaillierte Analyse der Proben während oder folgenden Invasion. Hierin beschrieben wir ein System, das ist nützlich für beide in Echtzeit und Endpunkt Verhör von invasiven Krebs-Biologie.

Kollagen ist ein wichtiger Bestandteil der extra-zellulären Matrix (ECM) und existiert in vielen Formen. Typ-1-Kollagen ist die vorherrschende Form der Fibrillären Kollagen Kollagen Typ-4 eine nonfibrillar Kollagen, aus denen die Basalmembran21. Krebszellen müssen der Basalmembran durchdringen und bewegen sich durch Typ-1-Kollagen während der Progression von nicht-invasive, invasive Tumoren22. Angesichts seiner allgegenwärtige Präsenz in der ECM, Typ-1-Kollagen dient als Matrix für den Bau von 3-d-Kulturen, die besser als die zweidimensionale Kultur Gericht5,6,23ECM zu imitieren. Während des hier beschriebenen Systems ist basiert auf eine Typ-1-Kollagen-Matrix, es kann geändert werden, um andere Stromazellen Bestandteile basierend auf experimentellen Frage enthalten und müssen.

Die Methodik, die wir nutzen um Blase Krebs Sphäroide aus Zell-Linien erzeugen beinhaltet Zellkultur in niedrig-Anlage Bedingungen und Zelle Aggregation. Nicht alle Zellen verträgt diese Kulturbedingungen und einige unterziehen kann Apoptose oder Bildung von lose Aggregate, die während der Kollagen Einbettung Prozess zu distanzieren. Ändern der Kulturzeit, kann Handy-Nummer oder andere Zelltypen in der Schwebe integrieren das Ergebnis verbessern. Die Zelllinien für diesen Test ausgewählt, das Ziel des Experiments hängt. Wir haben diese Technik erfolgreich mit 7/7 einzigartige menschliche Blase Krebs-Zelllinien verwendet. Es ist jedoch möglich, dass einige Zelllinien möglicherweise nicht geeignet für diesen Versuchsaufbau. Darüber hinaus haben einige Zelllinien einen sehr invasiven Phänotyp, führt zu frühen Dissoziation der Sphäroide und Krebszellen während des Time-Lapse-Experiments aus der Überwachungsbereich bewegt. Pilotprojekte für das Verständnis des allgemeinen Verhaltens von Zelllinien sind dringend empfohlen, die beste Zeitrahmen für Studien zu bestimmen. Fehlerbehebung für häufig auftretende Probleme mit Sphäroid Generation und Bildgebung ist in Tabelle 1aufgeführt.

Dieses System eignet sich für begrenzte Screening pharmakologische Verbindungen mit Potenzial, Block Krebs ZELLINVASION. Hierin haben wir Cytochalasin D, eine Zelle durchlässig Inhibitor der Aktin-Polymerisation, diese potenzielle Anwendung18veranschaulichen. Wie oben gezeigt, hemmt 0,2 µM Cytochalasin D effektiv die Invasion von UM-UC9 und UM UC18 Sphäroide. Durch die Verwendung von Multi-Kammern Folien und automatisierte mikroskopische Bühnensteuerung, ist die Wirkung von mehrere Verbindungen auf Sphäroid Tumorinvasion machbar.

Obwohl diese Tests am besten geeignet um invasive Verhalten qualitativ zu beschreiben sind, ist die Quantifizierung des Ausmaßes der Migration und Invasion auch machbar. Erwerb von Bildern der Sphäroide zu Beginn des Experiments und zu verschiedenen Zeitpunkten und anschließende Bildanalyse gemessen am weitesten Luftlinie Invasion in X, Y oder Z Richtungen bieten Quantifizierung der invasiven Wanderungsverhalten. Erweiterte Bild-Analyse mit Gewebekulturen gekennzeichnet Zellen könnte verwendet werden, zu definieren und quantitate einzelne Zellen oder Zellen Typ Verhalten in Abhängigkeit von der experimentellen Bedarf oder Frage.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM cell culture medium Thermo Fisher Scientific 11995065
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 26140079
Antibiotic-Antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific 15240062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3803
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4  Thermo Fisher Scientific 10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster  Corning 3471
Conventional inverted microscope  Carl Zeiss 491206-0001-000 General use for cell culture and checking spheroids
Collagen type 1 from rat tail, high concentration  Corning 354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155382
Confocal microscope  Carl Zeiss LSM800 A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function 
Cryostat micromtome Leica Biosystems CM3050 S
Zen 2 Image processing software  Carl Zeiss
Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories  H4000
O.C.T compound  Thermo Fisher Scientific 23730571
Hoechst 33342 solution  Thermo Fisher Scientific 62249
Anti-ATDC (Trim29) antibody Sigma-Aldrich HPA020053
Anti-Cytokeratin 14 antibody Abcam ab7800
Anti-Vimentin antibody Abcam ab24525
ProLong Diamond  Mounting medium

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Cancer Research Ausgabe 139 Blasenkrebs 3-d-Kultur Kollagen Invasion extrazelluläre Matrix Motilität
3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs
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Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D.More

Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D. M., Palmbos, P. L. 3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (139), e58345, doi:10.3791/58345 (2018).

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