Summary
I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.
Abstract
Cancro alla vescica è un problema significativo per la salute. Si stima che più di 16.000 persone moriranno quest'anno negli Stati Uniti dal cancro alla vescica. Mentre il 75% dei cancri alla vescica sono non-invasivo e rischiano di riprodurrsi per metastasi, circa il 25% progredire ad un modello di crescita dilagante. Fino a metà dei pazienti con i tumori invasivi si svilupperà letale ricaduta metastatica. Così, la comprensione del meccanismo della progressione invasiva nel cancro alla vescica è fondamentale prevedere gli esiti dei pazienti e prevenire le metastasi letale. In questo articolo, presentiamo un modello di invasione del tridimensionale che permette l'incorporazione delle cellule del tumore e componenti stromal di imitare in vivo le condizioni che si verificano nel microambiente del tumore della vescica. Questo modello offre l'opportunità di osservare il processo invasivo in tempo reale usando la formazione immagine di time-lapse, interrogare le vie molecolari coinvolte utilizzando composti immunofluorescenti confocal di formazione immagine e schermo con il potenziale di invasione di blocco. Mentre questo protocollo si concentra sul cancro della vescica, è probabile che simili metodi potrebbero essere utilizzati per esaminare l'invasione e la motilità in altri tipi di tumore.
Introduction
L'invasione è un passaggio fondamentale nella progressione del cancro, che è richiesto per la metastasi ed è associata con la bassa sopravvivenza e prognosi in pazienti. Nel cancro alla vescica umano, la neoplasia più comune dell'apparato urinario che provoca circa 165.000 morti all'anno in tutto il mondo, la fase di cancro, il trattamento e la prognosi sono direttamente correlati alla presenza o all'assenza di invasione1. Circa il 75% dei casi di cancro alla vescica sono non muscolo-invasivo e sono gestiti con resezione locale. Al contrario, i tumori della vescica muscolo-invasivo (circa il 25% dei casi) sono tumori aggressivi con gli alti tassi metastatici e sono trattati con terapia aggressiva di multimodality2,3. Di conseguenza, capire le vie molecolari che attivano l'invasione è essenziale per caratterizzare meglio il rischio di progressione invasiva e sviluppare interventi terapeutici che possono impedire la progressione invasiva.
Progressione invasiva del tumore si verifica in un ambiente complesso tridimensionale (3D) e comporta l'interazione delle cellule del tumore con altre cellule del tumore, stroma, membrana basale e altri tipi di cellule compreso le cellule immuni, fibroblasti, cellule muscolari e vascolari cellule endoteliali. Supporto permeabile (ad es., Transwell) sistemi di dosaggio sono comunemente impiegati per quantificare il cancro delle cellule invasione4, ma questi sistemi sono limitati perché non consentono al microscopio di monitoraggio del processo di invasione in tempo reale e la recupero dei campioni per ulteriori macchiatura e l'analisi molecolare è impegnativo. Sviluppo di un sistema di sferoide di tumore della vescica 3D per studiare invasione è auspicabile perché permette l'incorporazione di componenti microambientali definiti con la convenienza di sistemi in vitro .
In questo protocollo, descriviamo un sistema per interrogare i processi invasivi delle cellule di cancro alla vescica umano usando un'analisi di invasione di sferoide 3D che incorporano le matrici gel a base di collagene e microscopia confocale per consentire ai ricercatori di monitorare la motilità cellulare e invasione in tempo reale (Figura 1A). Questo sistema è versatile e può essere modificato per interrogare le varie impostazioni/tumore stromal. E ' possibile incorporare la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica o tumori della vescica primario e altre cellule stromal come cancro associato fibroblasti e cellule del sistema immunitario5,6,7. Questo protocollo descrive una matrice composta da collagene di tipo 1, ma può essere modificato per incorporare altre molecole quali fibronectina, laminina o altre proteine di collagene. Processi invasivi possono essere seguiti per 72 h o più a seconda della capacità del sistema utilizzato e microscopio. Fissazione e colorazione di immunofluorescenza del tumore incorporato nella matrice 3D, prima, durante e dopo l'invasione permette l'interrogatorio di sovraregolati proteine in cellule invasive, fornendo così informazioni cruciali che solitamente assenti o difficili da raccogliere utilizzo di altri modelli 3-d cultura. Questo sistema può essere utilizzato anche per composti di schermo che bloccano l'invasione e delineare vie di segnalazione colpite da tali composti.
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Protocol
1. crescente cancro sferoidi
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Crescita da linee cellulari
- Cellule di cancro alla vescica umane cultura sotto aderente convenzionale delle condizioni di coltura di cellule e mantengono in incubatore a 37 ° C, fornito con 5% CO2. Mantenere le cellule a < confluency di 90%.
Nota: mezzi di coltura utilizzati è di Dulbecco modificato supporto essenziale minimo (DMEM) contenente 4,5 g/L D-glucosio, L-Glutammina, piruvato di sodio di 110 mg/L e fornito con 10% siero bovino fetale (FBS) in tutto questo protocollo. - Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, tripsinizzano (utilizzando 0,25% tripsina-EDTA) quantificare la concentrazione cellulare di cellule e distribuire 1 x 106 cellule in 3 mL di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso.
- Incubare le cellule in condizioni di attacco basso a 37 ° C per ≥ 16 h. Questo dovrebbe consentire tempo sufficiente per celle da aggregare in sferoidi per la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica.
Nota: La formazione di sferoidi possa essere osservata al microscopio invertito campo luminoso. La dimensione ottimale e il numero di sferoidi può dipendere da diversi esperimenti, ma troviamo che sferoidi con diametri da 50 µm a 150 µm sono generalmente adatti per time-lapse imaging utilizzando un obiettivo X 20. - Per incorporare i tipi di cellule supplementari, come fibroblasti o cellule immuni in sferoidi, mescolare le cellule desiderate con le cellule tumorali al rapporto desiderato (1:1, 01:10, ecc.) in un allegato di ultra-basso piastra e incubare a 37 ° C per ≥ 16 h permettere la formazione di sferoidi di tipo misto delle cellule.
- Cellule di cancro alla vescica umane cultura sotto aderente convenzionale delle condizioni di coltura di cellule e mantengono in incubatore a 37 ° C, fornito con 5% CO2. Mantenere le cellule a < confluency di 90%.
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Crescita da tumori primari
Nota: Tumore sferoidi possono anche essere derivati dal tumore primario della vescica fonti quali i tumori sviluppati da indotto da agente della vescica tumore modelli8. Ad esempio, i tumori della vescica generati dai topi nutriti con N-butilico - N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamina (BBN), possono essere raccolte e tritato in piccoli pezzi (circa 0,5 mm3) utilizzando strumenti chirurgici sterili. Digerito campioni primari della vescica umana cancri possono essere studiati anche in questo sistema.- Raccogliere e lavare i 0,5 mm3 pezzi di tumore in tampone fosfato salino di 5 mL ghiacciata (PBS). Centrifugazione a 200 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta.
- Raccogliere i pezzi del tumore mediante centrifugazione a 200 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e aggiungere 5 mL di DMEM contenente 10% FBS. Trasferite il composto di tumore sferoide e media ad una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso. Incubare a 37 ° C per ≥ 16 h prima di incorporare nella matrice del collagene (Vedi punto 2.3).
2. preparazione della camera 3D cultura
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Diluire il collagene di tipo 1 (derivato dalla coda di topo) in DMEM contenente 10% FBS per fare una miscela di 2 mg/mL secondo le istruzioni del produttore.
- Insomma, mix collagene con adeguate quantità di soluzione di NaOH N 1 e DMEM pipettando delicato basate su istruzioni del produttore per raggiungere il pH fisiologico.
- Dopo la miscelazione del collagene e DMEM, rapidamente ricoprire i pozzi della diapositiva da camera (per la maggior parte delle applicazioni, diapositive di camera con un vetro di copertura numero 1.5 è ottimale) con la miscela di collagene-DMEM prima di solidificazione (200 µ l/pozzetto). Lasciar camera rivestita all'essere fermo a temperatura ambiente per 15 min.
Nota: La composizione della matrice a base di collagene può essere modificata con l'aggiunta di altri ingredienti di matrice extracellulare, come fibronectina o laminina, secondo le finalità dell'esperimento.
- Delicatamente Dispensare 500 µ l di media che contengono sferoidi (o pezzi di tumore, se si utilizza un campione di tumore primario) dalla piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso in una microcentrifuga da 1,5 mL vuoto. Attendere 2 minuti per lasciare gli sferoidi depositano alla parte inferiore del tubo.
- Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Preparare un altro tubo di collagene di tipo 1 (2 mg/mL) mescolato con DMEM contenente 10% FBS e rapidamente aggiungere 500 µ l di questa miscela di sferoidi. Mescolare delicatamente le sferoidi e collagene pipettando lento.
- Aggiungere 250 µ l di miscela di sferoidi/collagene in un pozzetto di diapositiva di collagene pre-rivestite da camera. Consentire la matrice di collagene che contengono sferoidi a solidificare completamente (circa 30 min a 37 ° C).
- Dopo che la matrice del collagene è solidificata, aggiungere 1 mL di DMEM contenente 10% FBS in ciascun pozzetto (Figura 1B). Incubare il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C fino al momento per l'imaging in dotazione con 5% CO2 .
3. live Cell Imaging time-lapse
- Accendere il microscopio confocale seguendo le istruzioni del produttore e assicurarsi che la camera climatica raggiunge i 37 ° C e viene fornita con 5% CO2.
Nota: Il nostro microscopio e camera richiedono solitamente 1h per raggiungere l'equilibrio del sistema. - Trasferire con cautela la diapositiva di alloggiamento per l'adattatore di diapositiva collegato al microscopio.
- Individuare le sferoidi di interesse utilizzando un obiettivo di bassa potenza (ad es., 5x) e avviare imaging con l'obiettivo di potenza più elevato (in protocollo attuale, un obiettivo X 20 è usato per la maggior parte dell'imaging cellule vive per la sua qualità di immagine migliore).
Nota: Per i campioni di tumore primario della vescica, 5 X e 10 X gli obiettivi possono essere necessaria al fine di coprire la più grande area di imaging. Per il nostro Time-lapse imaging, l'intervallo di formazione immagine è impostato come 30 min e una pila di Z viene utilizzata per l'intero della sferoide di immagine. In genere la distanza tra le fette di Z è impostata a 4 µm per il 20X obiettivo e la distanza totale dell'asse Z è circa 200 µm. le immagini possono essere ottenute utilizzando DIC e con fluorescenza se cellule/tessuti harbor marcatori delle proteine fluorescenti. - Eseguire imaging time-lapse per 24-72 h.
Nota: La durata è determinata dal tipo di cella e le esigenze dell'esperimento.
4. preparazione del campione blocco contenente sferoidi di cancro per il taglio di tessuto congelato
- Sollevare con cautela il blocco di gel di collagene e sferoidi dalle diapositive camera usando il piccolo forcipe. Posizionare il blocco di gel di collagene in uno stampo di plastica istologia.
- Risciacquare il gel di collagene con 1x PBS brevemente e poi fissarlo con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
Attenzione: PFA è potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con cura. - Lavare il gel di collagene con 1,5 mL di PBS 1X su un agitatore per 15 min. Sostituisci il PBS e ripetere il passaggio precedente lavaggio 3 x.
- Applicare uno strato sottile (circa 3 mm) di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto per coprire il fondo di uno stampo di plastica istologia nuovo. Posto fisso e gel di collagene in cima il OCT. lavato composto, quindi accuratamente incorporare il gel tutto riempiendo lo stampo con OCT composto, evitando la formazione di bolle d'aria nello strumento di personalizzazione.
- Lasciare lo stampo a 4 ° C per 1 h.
- Posizionare lo stampo contenente il campione e l'OCT composto su una piastra Petri 100 mm flottante su azoto liquido. Lasciare il campione flash-congelare completamente.
- Memorizzare il blocco campione congelato a-80 ° C per un uso futuro.
5. immunofluorescenza Imaging per cancro sezionato congelati sferoidi
- Trasferimento il blocco campione congelato dal congelatore-80 ° C alla camera di-20 ° C di un criostato.
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Eseguire la divisione surgelati convenzionale impostando l'intervallo di sezione a 7 µm. Lasciate che campioni sezionati allegare al vetrino senza rughe o intrappolata aria.
- Memorizzare le diapositive a-80 ° C prima di eseguire ulteriore colorazione.
Nota: Diversi intervalli possono essere utilizzati per adattarsi alle esigenze sperimentali.
- Memorizzare le diapositive a-80 ° C prima di eseguire ulteriore colorazione.
- Asciugare i vetrini per 1 h a temperatura ambiente.
- Permeabilize i campioni con PBS contenente 0.5% Triton X-100 per 15 min.
- Lavare i campioni 3 volte con PBS per 10 min a lavaggio.
- Circondano i campioni sulla diapositiva con barriere idrofobiche utilizzando una penna di barriera idrofoba.
- Trattare i campioni con soluzione bloccante (1x PBS contenente 5% albumina di siero bovino (BSA)), per 1 h a temperatura ambiente.
- Applicare 40 µ l di soluzione contenente anticorpo primario (1x PBS contenente 5% BSA con diluizione 1: 100 di anticorpo primario) per ogni campione sulla diapositiva.
- Incubare i vetrini in anticorpo primario a 37 ° C per 1 h o a temperatura ambiente durante la notte (il tempo di incubazione e le condizioni variano a seconda dell'anticorpo primario).
- Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).
- Applicare 40 µ l di soluzione contenenti anticorpi secondari (1x PBS contenente il 5% di BSA con diluizione di 1: 300 anticorpo secondario) per ogni campione sulla diapositiva.
- Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).
- Macchia con Hoechst 33342 soluzione (1 µ g/mL, diluito in PBS) i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Quindi lavare campioni con PBS per 5 min.
- Montare i campioni con mezzo di montaggio e coprirli con dimensioni appropriate vetrini coprioggetto. Lasciare le diapositive al buio a temperatura ambiente per 24 h e quindi eseguire la microscopia confocale.
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Representative Results
Creazione riuscita di sferoide di tumore cancro invasivo della vescica richiede la formazione di sferoidi di dimensioni del tumore da linee cellulari o tumori primari. Figura 2 A Mostra dimensioni appropriate sferoidi sviluppati da quattro linee di cellulari del cancro alla vescica umane in (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J e UM-UC18). Figura 2 B viene illustrato uno sferoide di tumore da un tumore della vescica BBN-generato del mouse incorporato nella matrice del collagene. Questi sferoidi sono stati incorporati come descritto sopra e immagini rappresentative furono catturati utilizzando un microscopio equipaggiato per l'imaging di cellule vive. La lente dell'obiettivo X 20 è stata utilizzata per l'imaging di UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 e UM-UC18 sferoidi, mentre sferoidi di tumore della vescica del mouse sono stati esaminati usando 5 X e 10 X lenti dell'obiettivo.
Immagini rappresentative di sferoidi di linea cellulare umana della vescica dopo 24-72 h (Figura 2A) e del mouse BBN primario della vescica tumore sferoidi (Figura 2B) dimostrano la migrazione di cancro alla vescica nella matrice del collagene. 253J, una linea cellulare non invasivo, rimangono in gran parte intatta con poca o nessuna migrazione (Figura 2A). Video 1, 2e 3 illustrano il processo di invasione time-lapse per UM-UC9, UM-UC13 e sferoidi UM-UC14, rispettivamente. Video 4 vengono illustrate le proprietà di invasione di uno sferoide di UM-UC18. Video 5 Mostra le due aree del tumore della vescica di mouse da 66 h 87 h post-collagene incorporamento.
Per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di colorazione di immunofluorescenza di proteine marker in nostro sferoidi di tumore invasivo, essi erano fissi e macchiati a 24 o 72 h. figura 3 Mostra campioni rappresentativi hanno macchiati per l'Atassia-Telangiectasia gruppo D-Associated Protein (ATDC, noto anche come TRIM29), una proteina che svolge un ruolo significativo nella progressione nella tumorigenesi e cancro della vescica umana e cancri del pancreas9,10, tubuline (α e β), che formano i microtubuli e un ruolo chiave nel plasmare la cella e il movimento cellulare11,12, la cheratina 14 (KRT14), un marker epiteliale basale coinvolte nell'invasione13e il vimentin (VIM), un marcatore mesenchymal14,15, 16. Queste immagini dimostrano che la visualizzazione delle strutture cellulare e subcellulare possa essere eseguite utilizzando questa metodologia. La vista di ingrandimento maggiore di UM-UC14 Mostra filamentosa macchiatura per ATDC (Figura 3A). Le cellule altamente invasive diffusione da UM-UC18 sferoidi dopo 24 h di invasione express elevato livello di VIM, un marcatore di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT, Figura 3B).
Incorporazione di diversi tipi di cellule (fibroblasti del cancro-collegata) in sferoidi del tumore è fattibile e fornisce un modo per esaminare le interazioni cellula-cellula eterologa (Figura 4 e Video 6). In questo esempio abbiamo usato proteina fluorescenza rossa (RFP)-fibroblasti umani con etichettati e il cancro alla vescica 253J linea trasformata con un vettore per l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) cellulare. Queste cellule erano misti di sferoidi tumore forma e incorporate nel collagene. Il processo di invasione monitorato mediante microscopia confocale. Nella figura 4 viene illustrato che l'interazione con i fibroblasti possa modulare il comportamento invasivo di 253J.
Figura 5 dimostra l'utilità del sistema di prova per testare gli inibitori dell'invasione. Cytochalasin D è un noto inibitore della migrazione cellulare e invasione che agisce bloccando l'actina polimerizzazione17,18 ed è stato usato come un esempio. Trattamento Cytochalasin D hanno inibito l'invasione di UM-UC9 sferoidi (Figura 5A). La stessa concentrazione di Citocalasina D (0,2 µM) è in grado di inibire parzialmente l'invasione di UM-UC18 sferoidi (Figura 5B). Poiché il sistema può essere utilizzato per l'immagine più pozzi e tumore organoids in parallelo, è favorevole a un gruppo limitato di agenti farmacologici per effetto sull'invasione di screening.
Figura 1 : Programma di installazione per l'analisi 3D invasione con formazione immagine di cellule vive. (A) descrizione schematica per 3D live cell imaging e immunofluorescenza. Vetrino coprioggetti (B) dell'alloggiamento con collagene e supporti utilizzati in questo esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : L'invasione della vescica cancro sferoide. (A) esempi di vescica umana del cancro cella linea sferoidi incorporati in una matrice di gel di collagene. Sferoidi sono mostrati al momento di incorporare (h 0, riga superiore) o dopo 72 h (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) o 24 h (UM-UC18). Barra della scala = 50 µm. (B) esempi di BBN-indotta del mouse tumore l'invasione della vescica nella matrice del collagene. Le frecce indicano il bordo dilagante della sferoide di tumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di immunofluorescenza di sferoidi cancro invasivo della vescica. (A) UM-UC14 sferoide di tumore dopo 72 h di invasione in collagene. I campioni sono stati macchiati dall'immunofluorescenza convenzionale per ATDC (verde), tubulina (viola) e nuclei (Hoechst macchia blu). Quadrato bianco indica l'area con vista di ingrandimento più alto indicato nel pannello di destra due fila inferiore. Barra della scala = 50 µm. (B) UM-UC18 tumore sferoidi macchiati per KRT14 (verde), VIM (rosso), ATDC (viola) e nuclei (Hoechst macchia blu) dopo 24 h di invasione in collagene. Barra della scala = 50 µm. bianco quadrato indica l'area con vista di ingrandimento più alto indicato nel pannello destro inferiore. Linea tratteggiata indica approssimativamente il limite della sferoide del tumore originale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Sferoide di tumore con etichetta fluorescente che incorporano fibroblasti. Invasione delle cellule tumorali della vescica 253J GFP-etichettata da solo (pannello inferiore) o co-coltivate con fibroblasti RFP-etichettati (pannello superiore) monitorati per 24 h. scala bar = 50 µm. invasione è migliorata con aggiunta dei fibroblasti al sistema cultura (pannello superiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Effetto di un farmaco molecolare piccolo polimerizzazione dell'actina in invasione di targeting. (A) UM-UC9 sferoide di tumore trattati con Citocalasina D (0,2 µM) o DMSO (controllo del veicolo) e monitorati per sferoide di h. 72 (B) UM-UC18 tumore trattati con Citocalasina D o DMSO per 24 h. scala bar = 50 µm. linea tratteggiata indica il limite dell'originale sferoide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Possibile problema | Soluzione consigliata |
| Basso numero di sferoidi vitali | • Aumento del numero delle cellule coltivate in sospensione • Garantire > 90% di cellule sono vitali dopo typsinization • Controllo celle per contaminazione • Mantenere le cellule in crescita logaritmica prima typsinizing • Ottimizzare i terreni di coltura delle cellule • Modificare il tempo di cultura in condizione di sospensione • Provare a linee cellulari alternativi |
| Sferoidi sono troppo grandi o troppo piccole | • Regolare il numero di celle aggiunte alla piastra di attacco basso • Uso delicato di pipettaggio per abbattere più grandi aggregati cellulari |
| Difficile mettere a fuoco durante immaginando | • Regolare lo spessore del gel di collagene. Degli obiettivi a breve distanza di lavoro, provare a fare il collagene gel più sottile. • Assicurarsi che la camera diapositiva o il vetrino coprioggetto sia #1.5 • Ottimizzare le dimensioni di sferoidi (50 – 150 µm di diametro) |
| Le cellule migrano dalla zona di imaging durante l'analisi di invasione | • Ridurre le dimensioni di sferoidi • Ricentrare la zona imaging ogni 24 ore, se necessario • Coinvolgere piastrellatura tecnologia di imaging (se applicabile) per coprire l'area più ampia • Considerare l'uso di linee cellulari alternativi |
| La diapositiva di camera si asciuga | • Assicurarsi che non vi siano perdite nel setup di alloggiamento del clima • Assicurarsi che il meccanismo di controllo dell'umidità sia funzionale |
Tabella 1: Risoluzione dei problemi il modello 3-d invasione.
Video 1: video time-lapse che mostra UM-UC9 sferoide coltivata in collagene da 0 a 72 h. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2: video time-lapse che mostra la migrazione collettiva di UM-UC13 sferoide coltivata in collagene da 0 a 72 h. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 3: video time-lapse di UM-UC14 sferoide coltivata in collagene da 0 a 72 h. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 4: video time-lapse di UM-UC18 sferoide coltivata in collagene da 0-24 h. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 5: video time-lapse dei tumori della vescica del mouse indotta da BBN 66–84H post-collagene embedding. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 6: video time-lapse che mostra sferoidi tumorali formate da cellule GFP-etichettato 253J mescolato con RFP-labeled fibroblasti umani (a sinistra) o cellule GFP-etichettato 253J da solo (a destra). Sferoidi sono stati incorporati nel collagene e monitorati per 24 h. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Qui descriviamo un modello di sferoide di tumore 3D che permette l'osservazione in tempo reale di invasione di cancro della vescica, che è critica per metastasi e progressione del cancro. Questo sistema è favorevole all'incorporazione di varie componenti stromal e cellulare per consentire ai ricercatori di riepilogo meglio il microambiente del tessuto dove si svolge l'invasione del cancro della vescica. Sferoidi di cancro della vescica possono essere generati da varie fonti quali linee cellulari (compreso linee cellulari geneticamente utili per l'esame delle vie che influenzano i processi di invasione di segnalazione) e il mouse primari tumori (descritti qui). Potenzialmente può anche essere adattato per analisi umane del tumore primario. A seconda del sistema di imaging utilizzato, la fluorescenza può essere monitorata in tempo reale o di fissazione e di immunofluorescenza colorazione a vari intervalli di tempo. Il sistema è utilizzabile anche per testare potenziali inibitori dell'invasione. Questo rende il sistema uno strumento versatile e potente per valutare la biologia del cancro della vescica.
Il sistema di microscopia confocale con una camera climatica che fornisce il controllo della temperatura, controllo dell'umidità e alimentazione di CO2 è un pezzo fondamentale di attrezzature per costruire il modello descritto in questo protocollo.
Ampiamente è stato segnalato che culture 3D forniscano microambienti specializzati che meglio imitano tessuti nativi per cellula biologia e cancro studi19,20. Molti studi si basano su analisi di inserto di membrana permeabile che non riflettono le condizioni in cui l'invasione avviene in vivo. Ulteriormente, questi studi convenzionali consentono facile monitoraggio del processo di invasione in una moda in tempo reale, né analisi dettagliata dei campioni durante o seguente invasione. Qui abbiamo descritto un sistema che è utile per entrambi in tempo reale ed endpoint interrogatorio di biologia del cancro invasivo.
Il collagene è una componente importante della matrice extracellulare (ECM) ed esiste in molte forme. Collagene di tipo 1 sono la forma predominante di collagene fibrillare, mentre il collagene tipo-4 è un nonfibrillar collagene che compongono la membrana dello scantinato21. Le cellule tumorali devono penetrare la membrana dello scantinato e spostarsi tra collagene di tipo 1 durante la progressione da non-invasiva a tumori dilaganti22. Data la presenza ubiquitaria in ECM, collagene di tipo 1 sono stata utilizzata come matrice per la costruzione di colture 3-d, che mimano l'ECM meglio la cultura bidimensionale piatto5,6,23. Mentre il sistema qui descritto è basato su una matrice di collagene di tipo 1, può essere modificato per includere altri componenti stromal basati sulla questione sperimentale e bisogno.
La metodologia che utilizziamo per generare sferoidi di cancro della vescica da linee cellulari coinvolge coltura cellulare in condizioni di basso-allegato e l'aggregazione delle cellule. Non tutte le cellule in grado di tollerare queste condizioni di cultura e alcuni possono subire apoptosi o formazione di inerti sfusi che dissociano durante il processo di incorporamento di collagene. Modificare il tempo della coltura, il numero di cellulare o l'incorporazione di altri tipi di cellule in sospensione può migliorare il risultato. Le linee cellulari selezionate per questo test dipendono l'obiettivo dell'esperimento. Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica con linee cellulari di cancro di vescica umana unica di 7/7. Tuttavia, è possibile che alcune linee cellulari potrebbero non essere adatti per questa messa a punto sperimentale. Inoltre, alcune linee cellulari hanno un fenotipo molto invasivo, che conduce alla dissociazione precoce di sferoidi e cellule tumorali trasferirsi di fuori della zona di osservazione durante l'esperimento di time-lapse. Esperimenti pilota per comprendere il comportamento generale di linee cellulari sono altamente raccomandati per determinare i tempi migliori per gli studi. Risoluzione dei problemi per problemi comuni con generazione di sferoide e imaging è elencato nella tabella 1.
Questo sistema è adatto per lo screening limitato di composti farmacologici con potenziale di invasione delle cellule tumorali di blocco. Qui abbiamo usato Citocalasina D, un cellula-permeabile inibitore della polimerizzazione dell'actina, per illustrare questo potenziale applicazione18. Come mostrato sopra, 0,2 µM di Citocalasina D inibisce efficacemente l'invasione di sferoidi UM-UC9 e UM-UC18. Utilizzando multi-chambers diapositive e controllo automatizzato fase microscopica, l'effetto di molteplici composti sull'invasione del tumore sferoide è fattibile.
Anche se questi test sono più adatti per descrivere qualitativamente il comportamento invasivo, quantificazione della portata della migrazione e l'invasione è anche fattibile. Acquisizione di immagini di sferoidi all'inizio dell'esperimento e in vari momenti e successiva analisi per misurare la distanza lineare più lontana dell'invasione in X dell'immagine, Y o Z direzioni possono fornire quantificazione del comportamento migratorio dilagante. Più avanzate analisi di immagine utilizzando fluorescente etichettati cellule potrebbe essere utilizzato per definire e quantificare la singola cella o comportamento di tipo di cella a seconda della necessità sperimentali o domanda.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il laboratorio del Dr. Howard Crawford (Università del Michigan) per supporto tecnico e fornire materiali e attrezzature per questo studio e Alan Kelleher per il supporto tecnico.
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), bè YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
