Summary
膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の 3次元の文化を取り入れた膀胱がん浸潤モデルをご紹介します。侵襲的プロセスの機能を定義するため、治療薬のスクリーニングは、この手法が役に立ちます。
Abstract
膀胱癌は、重大な健康問題です。以上 16,000 人は膀胱癌から米国で今年を死ぬと推定されます。膀胱癌の 75% は非侵襲と転移する可能性は低い、約 25% は浸潤性増殖パターンに進行します。侵襲的な癌患者の半分までは致命的な転移再発を開発します。したがって、膀胱がんに侵襲的な進行のメカニズムを理解することは患者の転帰を予測して致死的な転移を防ぐために重要です。この記事では腫瘍細胞や膀胱腫瘍微小環境における発生する生体内の状態を模倣する間質成分の混入を可能にする三次元がん浸潤モデルを提案する.このモデルは、タイムラプス イメージングを使用してリアルタイムで侵襲的プロセスを観察し、ブロックの侵入する可能性のある共焦点蛍光イメージングと画面の化合物を使用して関与する分子経路を調査する機会を提供します。このプロトコルは、膀胱がんに焦点を当てて、侵略と他の腫瘍型で運動性を調べるための同様のメソッドが使える可能性が高いです。
Introduction
侵略は、癌の進行、転移に必要なより低い生存率と予後に関連付けられた重要なステップです。ひと膀胱癌、尿路、世界で年間約 165,000 死亡を引き起こす最も一般的な悪性腫瘍で癌の病期、治療、予後に直接関係侵略1の有無。膀胱癌症例の約 75% は、局所切除と非筋肉侵襲とに管理されます。対照的に、筋層浸潤性膀胱癌 (すべてのケースの約 25%) は転移率の高い強い腫瘍であり、積極的な集学的治療2,3と扱われます。したがって、侵略を誘発する分子経路を理解することはより侵襲的な進行のリスクを特徴付ける侵襲的な進行を防ぐことができる治療上の介在を開発するために不可欠です。
腫瘍浸潤進行複雑な三次元 (3 D) 環境で発生し、他の種類の免疫細胞、線維芽細胞、筋細胞を含む細胞の基底膜、実質他の腫瘍細胞と腫瘍細胞間相互作用を含むと血管血管内皮細胞。彼らはリアルタイムで浸潤過程の微視的監視を許可していないので、アッセイ系はよく癌細胞浸潤4、しかし、これらのシステムを量的に使用されて (例えばTranswell) 透過性のサポートは限られて、さらに染色し、分子解析のためのサンプルの取得は困難です。生体外でシステムの利便性と定義されたアイソレータケージ コンポーネントの定款をことができますので、侵略を勉強する 3-D 膀胱腫瘍回転楕円体システムの開発をお勧めします。
このプロトコルでは細胞運動を監視する研究者を許可するコラーゲン ベースのゲルのマトリックスと共焦点顕微鏡を組み込む 3-D 回転楕円体浸潤アッセイを用いたひと膀胱がん細胞の侵襲的なプロセスを調査するシステムについて述べるとリアルタイム (図 1A) に侵攻。このシステムは、汎用性と尋問/腫瘍間質のさまざまな設定を変更できます。それはようながんには、線維芽細胞と免疫細胞5,6,7が関連付けられているほとんどの膀胱癌セルラインまたは膀胱腫瘍とその他の間質細胞を組み込むことができます。このプロトコルは、タイプ 1 コラーゲンから成る行列を記述しますが、フィブロネクチン、ラミニン、他のコラーゲン蛋白質など他の分子を組み込むために変更できます。侵襲的なプロセスは顕微鏡と使用されるシステムの機能によって 72 時間以上続くことができます。固定と侵攻中、前後に 3-D マトリックスに埋め込まれた腫瘍の免疫蛍光染色により、したがって、通常不在または収集することは困難重要な情報を提供する侵襲的な細胞でタンパク質亢進の尋問他の 3次元培養モデルを使用します。このシステムは、侵入をブロック画面化合物、前記化合物によって影響を受けるシグナル伝達経路を線引きしたりするにも利用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. がん回転楕円体の成長
-
細胞からの成長
- 従来の付着の下で文化ひと膀胱がん細胞は細胞の培養条件と 5% CO2に付属している 37 ° C の定温器の維持します。細胞を維持 < 90% の confluency。
注: 使用培地はダルベッコ 4.5 g/L、D-グルコース ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L、L-グルタミンを含む最低限不可欠なメディア (DMEM) を変更し、10% 牛胎児血清 (FBS) このプロトコル全体に付属しています。 - 実験の開始前に 1 日 trypsinize (0.25% を使用して、トリプシン-EDTA) 細胞、細胞濃度を定量化し、6 も超低取り付けプレートの各ウェルに 3 mL の培地で 1 x 10 の6セルを配布。
- ≥16 h の 37 ° C で低接着条件のセルを孵化させなさい。これは細胞に十分な時間を許可する必要がありますほとんどの膀胱癌細胞のスフェロイドに集計します。
注: 回転楕円体の形成は、倒立明視野顕微鏡による観察できます。個々 の実験に最適なサイズおよび回転楕円体の数によって異なりますが、我々 は 150 μ m 50 μ m から径と回転楕円体が一般的に 20 X 対物レンズを用いたタイムラプス イメージングに適しているを見つけます。 - 追加の細胞の種類、線維芽細胞や免疫細胞に回転楕円体などを組み込むミックス任意のセルに任意の比率でがん細胞 (1:1、1:10など) 超低の添付プレートと 37 ° C の形成を許可する ≥16 時間インキュベート。混合細胞型回転楕円体。
- 従来の付着の下で文化ひと膀胱がん細胞は細胞の培養条件と 5% CO2に付属している 37 ° C の定温器の維持します。細胞を維持 < 90% の confluency。
-
原発腫瘍からの成長
注: 回転楕円体は、膀胱腫瘍に由来することができますも腫瘍源から発がん物質による膀胱腫瘍モデル8開発腫瘍など。たとえば、マウスから生成された膀胱腫瘍はうんざり N-ブチル - N-(4-ヒドロキシブチルメタクリ) ニトロソアミン (BBN) を収穫し、無菌の手術器具を使用して (約 0.5 mm3) 小さな断片にみじん切りすることができます。ひと膀胱癌は、このシステムで学ぶことができますの一次サンプルを消化しました。- 収集し、5 mL の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.5 mm3腫瘍部分を洗います。4 ° C で 5 分間 200 × gで遠心分離この洗浄工程をもう一度繰り返します。
- 4 ° C で 10 分間 200 × gで遠心分離して腫瘍部分を収集します。上澄みを除去し、5 mL の 10% を含む DMEM を追加 FBS。6 ウェル超低取り付けプレートに腫瘍回転楕円体/メディア混合物を転送します。コラーゲン マトリックスを埋め込む前に h ≥16 の 37 ° C で孵化させなさい (手順 2.3 を参照してください)。
2. 3次元培養室の準備
-
10% を含む DMEM でタイプ 1 コラーゲン (ラットの尾から派生) を希釈に製造元の指示に従って 2 mg/mL の混合物を作る FBS。
- 一言で言えば、穏やかなピペッティング生理学的 pH を達成するために製造元の指示に基づいて、1 N の NaOH 溶液と DMEM の適切な量のコラーゲンをミックスします。
- コラーゲンと DMEM を混合後すぐにチェンバー スライドの井戸を (ほとんどのアプリケーション数 1.5 カバーガラスとチャンバー スライドが最適) のコート凝固 (200 μ L/ウェル) 前にコラーゲン DMEM の混合物。15 分間室温で静止するようにコーティングされたチェンバー スライドを許可します。
注: マトリックスのコラーゲン ベースの組成は、実験の目的に応じてフィブロネクチンやラミニンなどの他の細胞外マトリックス成分を追加することによって変更することができます。
- 優しくピペット 500 μ L、空の 1.5 mL 遠心チューブに 6 も超低取り付けプレートから回転楕円体 (または腫瘍部分、原発腫瘍のサンプルを使用する場合) を含むメディアの。回転楕円体の管の底に沈殿させて 2 分待ちます。
- チューブから上澄みを慎重に取り外します。タイプ 1 コラーゲン (2 mg/mL) の 10% を含む DMEM を混ぜて別の管を準備 FBS すばやくスフェロイドを 500 μ L のこの混合物を追加。優しくゆっくりピペッティング回転楕円体とコラーゲンをミックスします。
- コラーゲン塗布前のチェンバー スライドの井戸に回転楕円体/コラーゲン混合物の 250 μ L を追加します。完全に固化する回転楕円体を含むコラーゲン マトリックス (37 ° C で約 30 分) を許可します。
- コラーゲン マトリックスを凝固させる為、1 mL の 10% を含む DMEM を追加 FBS も (図 1B)。チェンバー スライド画像の準備ができるまで 5% CO2に付属している 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
3. 生細胞タイムラプス イメージング
- 製造元の指示に従って共焦点顕微鏡および気候室が 37 ° C に達する 5% CO2が付属していることを確認します。
注: 顕微鏡、商工会議所にはシステムの平衡に到達する 1 h 通常必要があります。 - 慎重にチェンバー スライドを顕微鏡に接続されているスライド アダプターに転送します。
- (例えば5 X) 目的で低消費電力を使用して興味の回転楕円体を選択してより高い電力を目的とイメージングを起動 (現在のプロトコルの 20 × 対物内容が、その優れた画像品質のための生きているセルイメージ投射のほとんどの使用です)。
注: 膀胱腫瘍サンプルの 5 X、10 X の目標は必要かもしれない大きな撮像面積をカバーするために。当社のタイムラプス イメージング、イメージングの間隔は 30 分として設定され、Z スタックは、全体の回転楕円体のイメージに使用されます。通常 Z スライス間の距離は設定 4 μ m に客観的、かつ Z 軸の総距離 X 20 は約 200 μ m の範囲の画像は、DIC を使って取得でき、蛍光細胞/組織蛍光蛋白質のマーカーを抱く場合。 - 24-72 時間タイムラプス イメージングを実行します。
注: 期間は、電池の種類や実験のニーズによって決定されます。
4. 凍結組織切片の癌を回転楕円体を含むサンプル ブロックの準備
- 小鉗子を使用して、コラーゲン ・ ゲルとチャンバー スライドから回転楕円体のブロックを持ち上げながら。組織学のプラスチック金型にコラーゲン ゲルのブロックを配置します。
- 1x PBS でコラーゲン ・ ゲルを簡単に、リンスに固定し、4% パラホルムアルデヒド (PFA)、PBS で室温で 30 分間。
注意: PFA は、潜在的な発がん性物質注意して処理する必要があります。 - PBS 15 分置換シェーカー 1 × PBS の 1.5 mL でコラーゲン ・ ゲルを洗浄し、前の洗濯手順 3 倍を繰り返します。
- 最適な切削温度 (10 月) 新組織学プラスチック金型の底をカバーする化合物の薄層 (約 3 mm) を適用します。固定配置し、全体のゲルを OCT OCT で空気の泡の形成を回避しながらコンパウンド金型充填によって慎重に埋め込む OCT 上にコラーゲン ・ ゲルの化合物を洗浄します。
- 1 h の 4 ° C で型を残しなさい。
- サンプルと 10 月液体窒素に浮かぶ 100 mm シャーレに化合物を含む金型を配置します。完全にフラッシュ凍結サンプルを許可します。
- 将来の使用に備えて-80 ° C で凍結サンプル ブロックを格納します。
5. 凍結切片の癌回転楕円体のため蛍光イメージング
- -80 ° C のフリーザーからクライオスタットの-20 ° C チャンバーに冷凍サンプル ブロックを転送します。
-
従来凍結するセクションの間隔を 7 μ m 以下に設定すると、区分を実行します。断面サンプルしわなしのガラス スライドに添付または空気を閉じ込められています。
- さらに染色を行う前に、-80 ° C でスライドを保存します。
注: 実験ニーズに合わせて異なる間隔を使用可能性があります。
- さらに染色を行う前に、-80 ° C でスライドを保存します。
- 空気は、室温で 1 時間スライドを乾燥させます。
- 0.5% を含む PBS でサンプルを permeabilize トリトン X-100 15 分。
- 洗浄は、PBS で洗浄あたり 10 分の 3 x をサンプリングします。
- 疎水性障壁のペンを使用して疎水性の障壁とスライドのサンプルを取り囲みます。
- 室温で 1 時間ブロッキング液 (1 x 5% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む)、PBS のサンプルを扱います。
- スライドの各サンプルに 40 μ L の一次抗体含有溶液 (1 x PBS の一次抗体の 1: 100 希釈で 5 %bsa を含む) を適用します。
- スライド 37 ° C 1 時間以上 (インキュベーション時間と条件は一次抗体によって異なります)、室温を一晩で一次抗体の孵化させなさい。
- 洗浄 (洗浄) あたり 15 分の PBS で 3 倍をサンプルします。
- スライドの各サンプルに二次抗体含有溶液 (1: 300 二次抗体希釈 BSA の 5% を含む 1 x PBS) の 40 μ L を適用します。
- 洗浄 (洗浄) あたり 15 分の PBS で 3 倍をサンプルします。
- ヘキスト 33342 液 (1 μ g/mL、PBS で希釈した) とサンプルを 10 分間室温で染色します。PBS で 5 分間のサンプルを洗います。
- サンプルはメディアをマウントをマウントし、適切なサイズのカバー スリップでそれらをカバーします。常温 24 時間暗闇の中でスライドを残すし、共焦点の顕微鏡検査を行います。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
浸潤性膀胱癌腫瘍回転楕円体の作成に成功した細胞または原発腫瘍から適切に大きさで分類された腫瘍スフェロイドの形成が必要です。図 2Aは、4 つのひと膀胱癌細胞株 (UM UC9、UM UC13、UM UC14、253J、および UM UC18) から開発された適切に大きさで分類された回転楕円体を示しています。図 2Bは、コラーゲン マトリックスに埋め込まれた BBN で生成されたマウス膀胱腫瘍から腫瘍の回転楕円体を示しています。前述のようにこれらの球体が埋め込まれた、代表的な画像は、ライブセル イメージングのための顕微鏡を使用してキャプチャされました。イメージング UM UC18 スフェロイド UM-UC14、UM UC13 UM UC9 マウス膀胱腫瘍回転楕円体は、5 倍と 10 倍の対物レンズを使用して検討したに対し、20 X 対物レンズが使われました。
ひと膀胱細胞ライン回転楕円体 (図 2A) 24-72 時間後の代表的な画像とマウス BBN 膀胱腫瘍回転楕円体 (図 2B) コラーゲン マトリックスに膀胱癌の移行を示しています。253J、非侵襲的な細胞ラインのまま主とほとんど、あるいはまったく移行 (図 2A)。動画 1 2、および3それぞれ UM UC9、UM-UC13 UM UC14 回転楕円体にタイムラプス浸潤過程を示しています。動画 4は、UM UC18 楕円体の侵略プロパティを示します。ビデオ 5では、87 h 後コラーゲン埋め込む 66 h からマウス膀胱腫瘍の 2 つの領域を示しています。
私たちの腫瘍浸潤の回転楕円体の蛋白質のマーカーの免疫蛍光染色を使用しての可能性を示すために、彼らは固定し、24 または 72 h.図 3ショー毛細血管拡張性運動失調グループの代表的なサンプル染色で染色D 関連タンパク質 (ATDC、TRIM29 として知られている)、ひと膀胱と膵癌9,10小管 (α および β) 微小管を形成する腫瘍と癌の進行に重要な役割を果たしているタンパク質と細胞と細胞運動11,12, ケラチン 14 (KRT14)、基底上皮性マーカーの侵入13、およびビメンチン (VIM)、間葉系のマーカー14,15に関与の形成に重要な役割を再生します。 16。これらのイメージを示す細胞および細胞レベル下の構造の可視化は、この手法を使用して実行できます。糸状の染色 ATDC (図 3A) の UM UC14 の高い拡大を示しています。非常に侵略的セルを侵略の 24 h が VIM、上皮-間葉転換 (EMT、図 3B) のマーカーの高レベルを表現した後、UM UC18 回転楕円体から播種します。
異なる種類の細胞 (癌関連付けられている線維芽細胞) の腫瘍の回転楕円体への取り込みが可能である (図 4およびビデオ 6) の異種細胞間相互作用を検討する方法を提供しています。この例では赤い蛍光性タンパク質 (RFP) を用いて-緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現用ベクターを導入標識ひと線維芽細胞と 253J 膀胱癌細胞します。これらの細胞は、フォーム腫瘍回転楕円体に混合され、コラーゲンに埋め込まれています。共焦点顕微鏡による監視侵入プロセス。図 4は、線維芽細胞との相互作用が 253J の侵襲的な動作を調節することが示しています。
図 5は、侵略の阻害剤をテストするためのアッセイ システムの有用性を示しています。サイトカラシン D の細胞の遊走・浸潤アクチン重合17,18をブロックすることによって機能し、例として使用された知られている阻害剤です。サイトカラシン D 治療は、UM UC9 回転楕円体 (図 5A) の浸潤を抑制しました。サイトカラシン D の同じ濃度 (0.2 μ M) は UM UC18 回転楕円体 (図 5B) の侵入を部分的に抑制することができます。複数の井戸と並行して腫瘍オルガノイドのイメージをシステムを使用することができます、ので、侵入に及ぼす影響に関する薬理学的薬剤の限られたパネルをスクリーニングを受けやすいです。
図 1: 生細胞イメージングによる 3次元浸潤能の測定のためのセットアップ。(A) 3次元ライブセル イメージングと蛍光抗体法の図式的な概観。(B) Coverslip はコラーゲンとこの実験で使用されたメディア商工会議所します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 膀胱癌回転楕円体浸潤します。(A) ひと膀胱癌細胞ライン回転楕円体、コラーゲン ・ ゲル ・ マトリックスに埋め込まれた事例回転楕円体は、時刻 (0 h、一番上の行) を埋め込むまたは後 72 時間 (UM UC9、UM UC13、UM UC14、253J) または 24 h (UM UC18) に表示されます。スケールバー = 50 μ m。 (B) の例の BBN 誘発マウス膀胱浸潤コラーゲン マトリックスに。矢印は、腫瘍の回転楕円体の侵襲性のエッジを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 回転楕円体浸潤性膀胱癌の免疫蛍光分析します。(A) コラーゲンへの侵入の 72 時間後 UM UC14 腫瘍回転楕円体。サンプルは、ATDC (緑), (バイオレット)、チューブリンと核 (ヘキスト染色ブルー) の従来の蛍光抗体で染色。白い四角は、下行右の 2 つのパネルに表示される上位の倍率表示の領域を示します。スケールバー = 50 μ m。 (B) UM UC18 腫瘍回転楕円体染色 KRT14 (緑)、VIM (赤), ATDC (バイオレット) と核 (ヘキスト染色ブルー) コラーゲンへの侵入の 24 時間後。スケールバー = 50 μ m. ホワイト正方形下部右側のパネルに示すように高い倍率ビュー領域を示します。破線は大体元の腫瘍の回転楕円体の境界を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 腫瘍の蛍光標識した回転楕円体線維芽細胞を組み込むことです。GFP 標識 253J 膀胱がん細胞だけ (底面) の浸潤または RFP ラベル線維芽細胞 (トップ パネル) 24 時間スケールの監視との共培養バー = 50 μ m. の侵略、文化システム (最上位のパネル) に線維芽細胞添加で改良します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 小分子ターゲティングの侵攻でアクチン重合の効果。(A) UM UC9 腫瘍回転楕円体は、サイトカラシン D で処理 (0.2 μ M) や DMSO (車両管理) 72 h (B) UM UC18 腫瘍回転楕円体サイトカラシン D または DMSO を投与 24 時間スケールは監視とバー = 50 μ m の範囲の破線は元の境界を示して回転楕円体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 可能な問題 | 推奨される解決方法 |
| 実行可能な回転楕円体の数が少ない | • 懸濁液で培養された細胞の数を増加 • 確保 > 90% の細胞が typsinization 後実行可能 • 汚染チェック セル • Typsinizing 前に対数増殖で細胞を維持 • 細胞の培養基を最適化 • は、サスペンション状態で培養時間を変更します。 • 代替細胞をみてください。 |
| 回転楕円体は大きすぎるか小さすぎます。 | • 低取り付けプレートに追加されるセルの数を調整します。 • より大きい細胞凝集塊を打破するピペッティング穏やかな使用 |
| 想像中にフォーカスするは難しい | • は、コラーゲン ・ ゲルの厚さを調整します。短い作動距離の対物レンズ、ゲルの薄いコラーゲンを確認してください。 • は、チェンバー スライドまたは coverslip #1.5 であることを確認します。 • 回転楕円体 (直径 50-150 μ m) のサイズを最適化します。 |
| 細胞が浸潤能の測定中にイメージング ゾーンから移行します。 | • 回転楕円体のサイズを小さきます。 • 再センター イメージング ゾーンのすべての 24 h のために必要な場合 イメージング技術 (該当する場合) 面積をカバーするため • 魅力的なタイル • 代替細胞ラインの使用を考慮します。 |
| チェンバー スライドが乾く | • 気候室セットアップに漏れが無いことを確認します。 • 水分制御機構が機能を確保します。 |
表 1: トラブルシューティング三次元侵略モデルです。
ビデオ 1: タイムラプス ビデオ表示 UM UC9 回転楕円体 72 h 0 からコラーゲン培養してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2: 72 h 0 からコラーゲン培養 UM UC13 回転楕円体の集団移動を示す時間経過のビデオしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 3: 72 h 0 からコラーゲン培養 UM UC14 回転楕円体のタイムラプス ビデオしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 4: 24 h 0 からコラーゲン培養 UM UC18 回転楕円体のタイムラプス ビデオしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 5: BBN 誘発マウス膀胱腫瘍 66 のタイムラプス ビデオ-84 h 後コラーゲン埋め込み。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 6: GFP 標識 253J 細胞から形成されるがん回転楕円体を示す時間経過のビデオを混ぜて RFP ラベルひと線維芽細胞 (左) または GFP 標識 253J 細胞単独で (右)。回転楕円体は、コラーゲンに埋め込まれていたし、このビデオを表示するのにしてくださいここをクリックして 24 h.の監視します。(右クリックしてダウンロード)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで癌の進行および転移のために重大である膀胱癌の浸潤のリアルタイム観察を可能にする 3次元腫瘍回転楕円体モデルをについて説明します。このシステムは膀胱癌の浸潤が起こる組織微小環境良い要約する捜査官を許可するさまざまな間質および細胞コンポーネント定款に従う。膀胱がん回転楕円体細胞 (遺伝子組み換え細胞シグナル伝達経路の侵略プロセスに影響を与えるを検討を含む) などのさまざまなソースから生成することができます、プライマリ マウス腫瘍 (ここを参照)。それは可能性も人間の腫瘍の解析に適しています。使用してイメージング システム、に応じてリアルタイムまたは固定して様々 な時点で染色蛍光、蛍光を監視できます。システムは、侵入の潜在的な阻害剤をテストする使用できます。これはシステムを膀胱癌・細胞増殖を評価するために汎用性と強力なツールになります。
温度管理、水分制御、および CO2供給を提供する気候室と共焦点顕微鏡システムはこのプロトコルで記述されているモデルを構築するための機器の重要な部分です。
細胞生物学、癌研究19,20ネイティブの組織を模倣より特殊な微小を 3-D 文化に提供広く報告されています。多くの研究は、透過性の膜挿入アッセイする侵入体内発生条件を反映していないに依存します。さらに、これらの従来の研究は、リアルタイムで侵入プロセスの容易な監視も中にサンプルまたは侵入の後の詳細な分析を許可します。リアルタイムの両方のために適しているシステムの記載と浸潤癌生物学のエンドポイント尋問。
コラーゲンは細胞外マトリックス (ECM) の重要なコンポーネントであるし、多くの形で存在します。4 型コラーゲンは基底膜21を作る nonfibrillar コラーゲン、タイプ 1 コラーゲン、フィブリル型コラーゲンの支配的な形式です。癌細胞必要があります基底膜に浸透し、タイプ 1 コラーゲンを進行中に非侵襲的から侵襲腫瘍22に移動します。ECM でのユビキタスの存在を考えると、タイプ 1 コラーゲンとして使用されていますマトリックス 2次元培養皿5,6,23より ECM を模倣 3-D の文化を構築するため。中にここで説明したシステムがタイプ 1 コラーゲン マトリックスに基づいて実験の質問に基づく他の間質成分を含むように変更することができ、必要があります。
我々 は細胞から膀胱がん回転楕円体を生成する使用方法には低添付条件と細胞凝集の培養が含まれます。すべてのセルがこれらの培養条件に耐えることができる、いくつかはプロセスを埋め込みコラーゲン中に切り離して考える緩い集合体の形成やアポトーシスを受ける可能性があるとは限りません。培養時間の変更、携帯電話番号、または懸濁液中の他の細胞型を組み込むことは、予後を改善可能性があります。この試金のため選択した細胞は、実験の目的によって異なります。7/7 ユニークなひと膀胱がん細胞と正常にこのテクニックを使いました。しかし、それはいくつかの細胞がこの実験のセットアップに適したできない場合もあります。さらに、いくつかの細胞回転楕円体、および癌細胞タイムラプスの実験中に観測領域外に移動の早期解除につながる非常に侵襲的な表現型があります。細胞の一般的な動作を理解するためのパイロット実験研究の最高のタイム フレームを決定する勧めします。回転楕円体の生成とイメージングに関する一般的な問題のトラブルシューティングは、表 1に表示されます。
このシステムはブロック癌細胞侵入する潜在的な薬理学的化合物の限られたスクリーニングに適しています。ここサイトカラシン D、アクチン重合の細胞膜透過性阻害剤を使用この潜在的なアプリケーションの18を説明します。上図のように、サイトカラシン D の 0.2 μ M は効果的に UM UC9 と UM UC18 回転楕円体の侵攻を抑制します。複数チャンバー スライドと顕微鏡ステージの自動制御により、回転楕円体の腫瘍浸潤に及ぼす複数の化合物が可能です。
これらのアッセイは、侵襲的な挙動について詳しく説明に最適です、移行と浸潤の程度の定量化は可能でも。回転楕円体実験のさまざまな時点で、その後開始時の画像の取得画像 X の侵入の最も遠いの直線距離を測定する解析、Y または Z の方向は、侵襲的な回遊行動の定量化を提供できます。細胞を蛍光標識より高度な画像解析法を定義し、個々 のセルまたは実験的ニーズや質問に応じてセル型の動作を量的にされる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、テクニカル サポートおよび提供する材料と本研究装置およびテクニカル サポートのためのアラン ・ ケレハー博士ハワード ・ クロフォード (ミシガン大学) の研究室に感謝したいと思います。
この作品は、ミシガン州 Rogel がんセンター コア付与 CA046592 26S3、NIH K08 CA201335 01A1 (PLP)、編 YIA (PLP)、NIH R01 CA17483601A1 (DMS) の大学からの補助金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
