Summary
Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.
Abstract
Cáncer de vejiga es un importante problema de salud. Se estima que más de 16.000 personas morirán este año en los Estados Unidos de cáncer de vejiga. Mientras que el 75% de los cánceres de vejiga son no invasivas y poco probable metástasis, alrededor del 25% progresar a un patrón de crecimiento invasivo. Hasta mitad de los pacientes con cánceres invasivos desarrollan letal recaída metastásica. Por lo tanto, comprender el mecanismo de progresión invasiva en el cáncer de vejiga es crucial para predecir los resultados del paciente y prevenir metástasis letal. En este artículo, presentamos un modelo de invasión del cáncer tridimensional que permite la incorporación de las células tumorales y los componentes stromal a imitar en vivo condiciones que ocurren en el microambiente del tumor de vejiga. Este modelo ofrece la oportunidad de observar el proceso invasivo en tiempo real usando proyección de imagen de Time-lapse, interrogar las vías moleculares implicadas confocales compuestos inmunofluorescentes de la proyección de imagen y pantalla con el potencial de invasión bloque. Aunque este protocolo se centra en el cáncer de vejiga, es probable que métodos similares podrían utilizarse para examinar la invasión y motilidad así como otros tipos de tumor.
Introduction
La invasión es un paso crítico en la progresión del cáncer, que se requiere para la metástasis y se asocia a menor supervivencia y pronóstico en los pacientes. En el cáncer de vejiga humano, la neoplasia más frecuente del tracto urinario, que causa unos 165.000 muertes por año en todo el mundo, pronóstico, tratamiento y etapa del cáncer se relacionan directamente con la presencia o ausencia de invasión1. Alrededor del 75% de los casos de cáncer de vejiga se no músculo invasivo y se manejan con resección local. Por el contrario, los cánceres de vejiga músculo invasivo (aproximadamente 25% de los casos) son tumores agresivos con altas tasas de metástasis y son tratados con terapia de multimodality agresivo2,3. Por lo tanto, entender las vías moleculares que desencadenan la invasión es esencial para caracterizar mejor el riesgo de progresión invasiva y para desarrollar intervenciones terapéuticas que pueden prevenir la progresión invasiva.
La progresión invasiva del tumor se produce en un entorno de (3D) tridimensional complejo e implica la interacción de tumor de la célula con otras células del tumor, estroma, membrana basal y otros tipos de células incluyendo las células inmunes, fibroblastos, células musculares y vasculares células endoteliales. Permeable al soporte (por ejemplo, Transwell) sistemas de ensayo se emplean comúnmente para cuantificar cáncer células invasión4, pero estos sistemas son limitados porque no permiten el seguimiento microscópico del proceso de invasión en tiempo real y la recuperación de muestras para coloración adicional y el análisis molecular es un reto. Desarrollo de un sistema de esferoide de tumor de vejiga 3-d para estudiar invasión es deseable porque permite la incorporación de componentes microambiental definidos con la conveniencia de sistemas in vitro .
En este protocolo, se describe un sistema para interrogar a los procesos de invasión de las células cancerosas de la vejiga humana mediante un ensayo de invasión esferoide 3D incorporación de matrices de gel de colágeno y la microscopia confocal para permitir a los investigadores controlar la motilidad celular y invasión en tiempo real (figura 1A). Este sistema es versátil y puede ser modificado para interrogar a varios ajustes del estroma tumoral. Pueden incorporar más líneas de células de cáncer de vejiga o tumores vesicales primarias y células estromales adicionales como cáncer había asociado a fibroblastos y células inmunes5,6,7. Este protocolo describe una matriz compuesta de colágeno tipo 1, pero puede ser modificado para incorporar otras moléculas como la fibronectina, laminina y otras proteínas de colágeno. Procesos invasivos pueden ser seguidos durante 72 h o más dependiendo de la capacidad del microscopio y del sistema utilizado. Fijación y tinción de inmunofluorescencia de tumor embebido en la matriz 3D antes, durante y después de la invasión permite el interrogatorio de proteínas upregulated en las células invasoras, proporcionando información vital que generalmente ausente o difícil reunir usando otros modelos 3-d cultura. Este sistema también se puede utilizar compuestos de pantalla que bloquean invasión y delimitar vías de señalización afectadas por estos compuestos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. creciente cáncer esferoides
-
Crecimiento de líneas celulares
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
Nota: medios de cultivo utilizados es de Dulbecco modificado medio esencial mínimo (DMEM) que contiene 4,5 g/L D-glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L y con 10% suero bovino fetal (FBS) a lo largo de este protocolo. - Un día antes del inicio del experimento, trypsinize (usando 0.25% tripsina-EDTA) cuantificar la concentración de células de las células y distribuir 1 x 106 células en medios de cultivo de 3 mL en cada pocillo de una placa de fijación 6-bien bajas.
- Incubar las células en condiciones de fijación baja a 37 ° C para h ≥16. Esto debe permitir suficiente tiempo para que las células a agregado en esferoides de más líneas de células de cáncer de vejiga.
Nota: La formación de esferoides puede ser observada por microscopio de campo brillante invertida. El tamaño óptimo y el número de esferoides pueden depender de experimentos individuales, pero encontramos que esferoides con un diámetro de 50 μm y 150 μm son generalmente convenientes para Time-lapse de imágenes utilizando un objetivo de 20 X. - Para incorporar los tipos de células adicionales, tales como los fibroblastos o las células inmunes en los esferoides, mezcle las celdas deseadas con células de cáncer en la proporción deseada (1:1, 1:10, etcetera.) en un accesorio ultra bajo de la placa e incubar a 37 ° C por ≥16 h permitir la formación de esferoides de tipo mezclado de la célula.
- Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia.
-
Crecimiento de los tumores primarios
Nota: Fuentes de Tumor esferoides también pueden ser derivados del tumor primario de la vejiga tales como tumores desarrollados de inducida por el carcinógeno de la vejiga tumor modelos8. Por ejemplo, los tumores de vejiga generados a partir de ratones alimentaron con N-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamina (BBN), puede ser cosechado y picado en trozos pequeños (alrededor de 0,5 mm3) utilizando instrumentos quirúrgicos estériles. Digestión primarias muestras de vejiga humana, tipos de cáncer también se pueden estudiar en este sistema.- Recoger y lavar piezas de 0.5m m3 tumor en solución fisiológica 5 mL helado con tampón fosfato (PBS). Centrifugación a 200 x g durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso de lavado una vez.
- Recoge piezas de tumor por centrifugación a 200 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de DMEM con 10% FBS. Transferir tumor esferoide y medios mezcla a una placa de fijación 6-bien ultra baja. Incubar a 37 ° C por ≥16 h antes de la incorporación en la matriz de colágeno (ver paso 2.3).
2. preparación de la cámara de cultura 3-d
-
Diluya el colágeno tipo 1 (derivado de cola de rata) en DMEM con 10% FBS para hacer una mezcla de 2 mg/mL según las instrucciones del fabricante.
- En Resumen, mezcla de colágeno con la cantidad apropiada de solución de NaOH N 1 y DMEM mediante pipeteo suave basado en las instrucciones del fabricante para alcanzar el pH fisiológico.
- Después de mezclar colágeno y DMEM, rápidamente cubrir los pozos de la diapositiva de cámara (para la mayoría de las aplicaciones, diapositivas de la cámara con un vidrio de cubierta del número 1.5 es óptimo) con la mezcla de colágeno-DMEM antes de la solidificación (200 μL/pocillo). Permita que el portaobjetos compartimiento revestido ser inmóvil a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Nota: La composición de la matriz de colágeno puede ser modificada mediante la adición de otros ingredientes de la matriz extracelular, como fibronectina o laminina, según los propósitos del experimento.
- Suavemente pipetee 500 μl de los medios de comunicación que contiene esferoides (o partes del tumor, si se utiliza la muestra de tumor primario) de la placa de fijación 6-bien ultra baja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL vacía. Espere 2 minutos dejó de los esferoides settle al fondo del tubo.
- Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. Preparar otro tubo de colágeno tipo 1 (2 mg/mL) mezclado con DMEM con 10% FBS y rápidamente agregar 500 μl de esta mezcla a los esferoides. Mezclar suavemente los esferoides y colágeno mediante pipeteo lento.
- Añadir 250 μl de mezcla de esferoides colágeno a un pozo de diapositivas cámara de colágeno-pre-revestida. Permitir que la matriz de colágeno que contiene esferoides que se solidifique completamente (unos 30 min a 37 ° C).
- Después de la matriz de colágeno es solidificada, agregar 1 mL de DMEM con 10% FBS a cada pozo (figura 1B). Incubar el portaobjetos de la cámara en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2 hasta que esté listo para la proyección de imagen.
3. proyección de imagen de Time-lapse de la célula en vivo
- Encienda el microscopio confocal siguiendo las instrucciones del fabricante y asegúrese de que la cámara de clima llega a 37 ° C y se suministra con 5% CO2.
Nota: Nuestro microscopio y cámara generalmente requieren 1 h alcanzar el equilibrio del sistema. - Cuidadosamente transfiera el porta de la cámara para el adaptador de diapositivas conectado al microscopio.
- Localizar los esferoides de interés utilizando un objetivo de baja potencia (por ejemplo, 5 X) y comenzar la proyección de imagen con el objetivo de poder más alto (en el actual protocolo, objetivo 20 X se utiliza para la mayoría de la proyección de imagen de células vivas para su mejor calidad de imagen).
Nota: Para las muestras de tumor primario de la vejiga, 5 X y 10 X objetivos pueden ser necesarias para cubrir el área de proyección de imagen más grande. Para nuestro Time-lapse de imágenes, el intervalo de imagen se define como 30 min y una pila de Z se utiliza para el esferoide toda la imagen. Normalmente la distancia entre rodajas Z se establece a 4 μm para el 20 X objetivo y la distancia total del eje de Z es alrededor de 200 μm. las imágenes se pueden obtener utilizando DIC y con fluorescencia si las células/tejidos albergan marcadores fluorescentes. - Realizar proyección de imagen de Time-lapse de 24 – 72 h.
Nota: La duración es determinada por el tipo de célula y a las necesidades del experimento.
4. preparación del bloque de muestras que contienen esferoides de cáncer para secciones congeladas del tejido
- Levante con cuidado el bloque de gel de colágeno y esferoides de los portaobjetos de la cámara utilizando pinzas pequeñas. Colocar el bloque de gel de colágeno en un molde de plástico de la histología.
- Enjuagar el gel de colágeno con 1 x PBS brevemente y luego fijarla con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: PFA es potencial cancerígeno y debe manipularse con cuidado. - El gel de colágeno con 1,5 mL de PBS 1 x en un agitador para reemplazar a 15 minutos de lavado PBS y repita el paso anterior de lavado 3 x.
- Aplique una capa delgada (unos 3 mm) de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto para cubrir el fondo de un molde nuevo de histología plástica. Lugar fijo y luego cuidadosamente lavado gel de colágeno en la parte superior el OCT compuesto, incrustar el gel entero llenando el molde con OCT compuesto evitando la formación de burbujas de aire en los PTU.
- Dejar el molde en 4 ° C durante 1 h.
- Coloque el molde que contiene la muestra y OCT compuesto de un plato de Petri de 100 mm flotante en nitrógeno líquido. Permita que la muestra flash-congela completamente.
- Guarde el bloque de muestras congeladas a-80 ° C para su uso futuro.
5. inmunofluorescencia imágenes para cáncer seccionado congelado esferoides
- Transferir el bloque de muestras congeladas del congelador de-80 ° C de la cámara-20 ° C de un criostato.
-
Realizar seccionamiento congelado convencional de ajuste de la sección a 7 μm. Dejó muestras seccionadas fije a la diapositiva de cristal sin arrugas o aire atrapado.
- Almacenar las diapositivas a-80 ° C antes de realizar la coloración más.
Nota: Pueden utilizarse intervalos diferentes para adaptarse a necesidades experimentales.
- Almacenar las diapositivas a-80 ° C antes de realizar la coloración más.
- Secar los portaobjetos por 1 h a temperatura ambiente.
- Permeabilizar las muestras con PBS que contenga 0,5% Tritón X-100 durante 15 minutos.
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 10 minutos por lavado.
- Rodear las muestras en la diapositiva con barreras hidrofóbicas mediante el uso de la pluma de una barrera hidrofóbica.
- Tratar las muestras con solución de bloqueo (1 x PBS con 5% de albúmina sérica bovina (BSA)), por 1 h a temperatura ambiente.
- Aplican 40 μl de la solución que contiene anticuerpos primario (1 x PBS con 5% de BSA con dilución 1: 100 del anticuerpo primario) a cada muestra en la diapositiva.
- Incubar los portaobjetos en anticuerpo primario a 37 ° C por 1 h o a temperatura ambiente durante la noche (el tiempo de incubación y las condiciones varían dependiendo del anticuerpo primario).
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 15 minutos (por lavado).
- Aplican 40 μl de la solución que contiene anticuerpos secundario (1 x PBS con 5% de BSA con una dilución del anticuerpo secundario de 1:300) a cada muestra en la diapositiva.
- Muestras de lavado 3 veces con PBS durante 15 minutos (por lavado).
- Mancha de las muestras con Hoechst 33342 solución 1 μg/mL, diluido en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lavar las muestras con PBS durante 5 minutos.
- Montar las muestras con medio de montaje y cubrir con cubreobjetos de tamaños adecuado. Dejo las diapositivas en oscuridad a temperatura ambiente durante 24 h y entonces ejecutar la microscopia confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Creación exitosa de esferoide de tumor de cáncer de vejiga invasivo requiere la formación de esferoides tumorales tamaño adecuado de líneas de células o tumores primarios. Figura 2 A muestra de tamaños adecuado esferoides desarrollados a partir de líneas de células de cáncer de cuatro vejiga humana (UM-UC9 UC13 UM, UM UC14, 253J y UM UC18). Figura 2 B muestra un tumor esferoidal de un tumor de vejiga generados por BBN ratón incrustado en la matriz de colágeno. Estos esferoides fueron encajadas como se describe anteriormente y representativas imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio equipado para la proyección de imagen de células vivas. La lente del objetivo X 20 fue utilizado para imágenes UC9 UM, UM-UC13, UM UC14 y UM UC18 esferoides, mientras que los esferoides de tumor de vejiga de ratón fueron examinadas usando 5 X y 10 X lentes del objetivo.
Imágenes representativas de esferoides de línea celular de vejiga humana después de 24 a 72 h (figura 2A) y ratón BBN primario de la vejiga tumor esferoides (figura 2B) demuestran la migración del cáncer de vejiga en la matriz de colágeno. 253J, una línea de celular no invasivo, siendo en gran parte intacta con poca o ninguna migración (figura 2A). Videos 1, 2y 3 muestran el proceso de invasión de Time-lapse para UC9 UM, UM-UC13 y UM UC14 esferoides, respectivamente. Video 4 muestra las propiedades de la invasión de un esferoide de UM UC18. Video 5 se muestran las dos zonas ratón del tumor de vejiga de 66 h a h 87 incorporación de colágeno después.
Para demostrar la viabilidad de utilizar la tinción de inmunofluorescencia de marcadores de proteínas en los esferoides de tumor invasor, fueron fijados y manchados en 24 o 72 h. figura 3 las exposiciones muestras representativas manchadas para la Ataxia-Telangiectasia grupo D proteína (ATDC, también conocido como TRIM29), una proteína que juega un papel importante en la progresión de la tumorigénesis y cáncer de vejiga humana y los cánceres de páncreas9,10, tubulinas α y β, que forman los microtúbulos y desempeñan un papel clave en la conformación de la célula, movimiento celular11,12y queratina 14 (KRT14), un marcador epitelial basal participan en la invasión13y vimentina (VIM), un marcador mesenquimal14,15, 16. Estas imágenes demuestran que la visualización de las estructuras celulares y subcelulares puede realizarse utilizando esta metodología. La visión de ampliación mayor de UM UC14 muestra filamentosa tinción de ATDC (figura 3A). Las células altamente invasivas diseminadas de esferoides de UM UC18 después de 24 horas de invasión manifestar alto nivel de VIM, un marcador de la transición epitelial-a-mesenquimal (EMT, figura 3B).
Incorporación de diferentes tipos celulares (fibroblastos asociada al cáncer) los esferoides tumorales es factible y proporciona una manera para examinar interacciones de células heterólogas (figura 4 y 6 del Video). En este ejemplo hemos utilizado la proteína de la fluorescencia roja (RFP)-etiquetados fibroblastos humanos y el cáncer de vejiga 253J de células transduced con un vector de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Estas células se mezclaron esferoides tumorales de forma y embebidas en colágeno. El proceso de invasión por microscopia confocal. Figura 4 muestra que interacción con fibroblastos puede modular el comportamiento invasivo de 253J.
Figura 5 se muestra la utilidad del sistema de ensayo para poner a prueba a los inhibidores de la invasión. Cytochalasin D es un conocido inhibidor de la migración celular y la invasión que actúa mediante el bloqueo de la actinia polimerización17,18 y fue utilizada como un ejemplo. Tratamiento Cytochalasin D inhibe la invasión de UM-UC9 esferoides (figura 5A). La misma concentración de Citocalasina D (0,2 μm) es capaz de inhibir parcialmente la invasión de UM UC18 esferoides (figura 5B). Puesto que el sistema puede utilizarse para múltiples pozos y organoides de tumor en URL de la imagen, es favorable a la investigación un grupo limitado de agentes farmacológicos para el efecto de la invasión.
Figura 1 : Instalación de ensayo de invasión 3D con imágenes de células vivas. (A) Descripción esquemática de la proyección de imagen en 3D de la célula y de la inmunofluorescencia. Cubreobjetos (B) cámara con colágeno y medios utilizados en este experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Invasión de vejiga cáncer esferoide. (A) ejemplos de vejiga humano cáncer de la célula línea esferoides embebidas en una matriz de gel de colágeno. Esferoides aparecen en el momento de inclusión (0 h, fila superior) después de 72 h (UM-UC9 UC13 UM, UM UC14, 253J) o 24 h (UM-UC18). Barra de escala = 50 μm. (B) ejemplos de BBN-inducida del ratón vejiga invasión del tumor en la matriz de colágeno. Las flechas indican el borde invasivo del esferoide de tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de la inmunofluorescencia de esferoides de cáncer de vejiga invasivo. (A) UM UC14 esferoide de tumor después de 72 h de la invasión en colágeno. Las muestras se tiñeron por análisis de la inmunofluorescencia convencional de ATDC (verde), tubulina (violeta) y núcleos (Hoechst mancha azul). Cuadrado blanco indica el área con mayor vista de la ampliación que se muestra en la derecha dos paneles de fondo fila. Barra de escala = 50 μm. (B) UM UC18 tumor esferoides teñidos para KRT14 (verde), VIM (rojo), ATDC (violeta) y núcleos (Hoechst mancha azul) después de 24 horas de invasión en colágeno. Barra de escala = 50 μm. blanco cuadrado indica el área con mayor vista de la ampliación se muestra en el panel derecho inferior. Línea punteada indica aproximadamente el límite de la esferoide original del tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Esferoide de tumor marcada con fluorescencia incorporando fibroblastos. Invasión de GFP marcado 253J vejiga cáncer células solo (paneles inferiores) o co cultivadas con fibroblastos marcados con RFP (paneles superiores) durante 24 h. escala de la barra = 50 μm. invasión es mejorada con la adición de los fibroblastos para el sistema de cultivo (panel superior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Efecto de una droga molecular pequeño dirigido a polimerización de la actina en invasión. (A) UM-UC9 esferoide de tumor tratado con Citocalasina D (0,2 μm) o DMSO (control del vehículo) y monitoreados para el esferoide de 72 h. (B) UM UC18 tumor tratado con Citocalasina D o DMSO durante 24 h. escala de la barra = 50 μm. línea punteada indica el límite de la original esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Posible problema | Solución recomendada |
| Bajo número de esferoides viables | • Aumento del número de células cultivadas en suspensión • Asegúrese de > 90% de células es viable después de typsinization • Células de control de contaminación • Mantener las células en crecimiento logarítmico antes typsinizing • Optimizar los medios de cultivo celular • Modificar el tiempo de la cultura en estado de suspensión • Trate de líneas celulares alternativos |
| Esferoides son demasiado grandes o demasiado pequeños | • Ajustar el número de células a placa de fijación bajo • El uso suave de pipeteo para romper grandes agregados de la célula |
| Difícil concentrarse en imaginar | • Ajustar el espesor del gel de colágeno. Para objetivos con distancia de trabajo corta, intente hacer el colágeno gel disolvente. • Asegúrese de que la cámara muestra o cubreobjetos sean #1.5 • Optimizar el tamaño de esferoides (50 – 150 μm de diámetro) |
| Las células migran fuera de la zona de proyección de imagen durante el ensayo de invasión | • Reducir el tamaño de esferoides • Centrar la zona de proyección de imagen cada 24 h si es necesario Mosaico de participación • tecnología de la imagen (si corresponde) para cubrir un área más grande • Considerar el uso de líneas celulares alternativos |
| El portaobjetos de la cámara se seca | • Asegúrese de que no hay ninguna salida en la configuración de la cámara de clima • Asegúrese de que el mecanismo de control de humedad es funcional |
Tabla 1: Solución de problemas el modelo 3-d de la invasión.
1 video: Time-lapse mostrando video UM-UC9 esferoide cultivada en colágeno de 0 a 72 h. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2: video Time-lapse que muestra la migración colectiva de UM-UC13 esferoide cultivada en colágeno de 0 a 72 h. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 3: Time-lapse video de UM UC14 esferoide cultivada en colágeno de 0 a 72 h. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 4: video Time-lapse de UM UC18 esferoide cultivada en colágeno de 0 a 24 h. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 5: video Time-lapse de los tumores vesicales de ratón inducido por BBN 66–inclusión de colágeno después de 84 h. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
6 video: video Time-lapse que muestra esferoides cáncer formados por células GFP marcado 253J mezclado con etiqueta RFP fibroblastos humanos (izquierda) o GFP marcado 253J células solas (derecha). Esferoides fueron encajados en colágeno y monitorearon por 24 h. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí describimos un modelo esferoide de tumor 3-d que permite la observación en tiempo real de invasión del cáncer de vejiga que es crítica para la metástasis y la progresión del cáncer. Este sistema es favorable a la incorporación de distintos componentes stromal y celulares para permitir a los investigadores mejor Recapitulemos el microambiente del tejido donde ocurre la invasión del cáncer de vejiga. Esferoides de cáncer de vejiga puede ser generadas de diversas fuentes como líneas celulares (incluyendo líneas celulares genéticamente modificados de útiles para el examen de las vías que afectan procesos de invasión de señalización) y ratón primarios tumores (descritos aquí). Potencialmente puede también ser adaptado para el análisis del tumor primario humano. Según el sistema de imagen utilizado, fluorescencia puede ser monitoreada en tiempo real o por la fijación y la inmunofluorescencia que manchaba en varios puntos del tiempo. El sistema también puede utilizarse para probar los inhibidores potenciales de la invasión. Esto hace que el sistema de una herramienta versátil y potente para evaluar Biología del cáncer de vejiga.
El sistema de microscopía confocal con una cámara climática que proporciona control de temperatura, control de humedad y fuente de CO2 es una pieza clave del equipo para construir el modelo descrito en el presente Protocolo.
Se ha informado ampliamente que las culturas 3D proporcionan microambientes especializados que mejor imitan los tejidos nativos para celular biología y cáncer estudios19,20. Muchos estudios se basan en ensayos de inserción de membrana permeable que no reflejan las condiciones en que la invasión se produce en vivo. Además, estos estudios convencionales permiten fácil seguimiento del proceso de invasión de una manera en tiempo real, ni Análisis de las muestras durante o invasión siguiente. Adjunto describimos un sistema que es útil para ambos en tiempo real e interrogatorio final de Biología de cáncer invasor.
Colágeno es un componente importante de la matriz extra celular (ECM) y existe en muchas formas. Colágeno tipo 1 es la forma predominante de colágeno fibrilar colágeno tipo 4 es un nonfibrillar colágeno que forman la membrana basal21. Las células cancerosas deben penetrar la membrana basal y pasar a través del colágeno tipo 1 durante la progresión de no invasivo para tumores invasivos22. Dada su presencia ubicua en el ECM, colágeno de tipo 1 se ha utilizado como matriz para la construcción de culturas 3-d, que imitan el ECM mejor que la cultura bidimensional plato5,6,23. Mientras el sistema descrito aquí está basado en una matriz de colágeno tipo 1, puede modificarse para incluir otros componentes stromal basados en cuestión experimental y necesita.
La metodología que utilizamos para generar líneas de células esferoides de cáncer de vejiga consiste en cultivo celular en condiciones de baja fijación y agregación celular. No todas las células pueden tolerar estas condiciones de cultivo y algunos pueden sufrir apoptosis o formación de agregados sueltos que disociar el proceso de inclusión de colágeno. Modificar el tiempo de la cultura, número celular o incorporación de otros tipos de células en suspensión puede mejorar el resultado. Las líneas celulares seleccionadas para este análisis dependen el objetivo del experimento. Hemos utilizado con éxito esta técnica con líneas de células de cáncer de vejiga humana única 7/7. Sin embargo, es posible que algunas líneas celulares pueden no ser adecuados para este montaje experimental. Además, algunas líneas de células con un fenotipo muy invasivo, que conduce a la disociación temprana de esferoides, cáncer células y salir de la zona de observación durante el experimento de Time-lapse. Experiencias piloto para entender el comportamiento general de las líneas celulares son muy recomendables para determinar los mejores marcos de tiempo para los estudios. Solución de problemas para problemas comunes con la generación del esferoide y la proyección de imagen se muestra en la tabla 1.
Este sistema es adecuado para la proyección limitada de compuestos farmacológicos con potencial de invasión de células de cáncer bloque. En este documento utilizamos Citocalasina D, un inhibidor permeable a la célula de la polimerización de la actina, para ilustrar esta potencial aplicación18. Como se muestra arriba, 0.2 μm de Citocalasina D inhibe eficazmente la invasión de UM-UC9 y UM UC18 esferoides. Mediante la utilización de múltiples compartimientos portaobjetos y control automatizado etapa microscópica, el efecto de múltiples compuestos de invasión del tumor esferoide es factible.
Aunque estos análisis son los más adecuados para describir cualitativamente el comportamiento invasivo, cuantificación de la magnitud de la migración y la invasión es también factible. Adquisición de imágenes de esferoides al inicio del experimento y en varios puntos del tiempo y los posteriores análisis para medir la distancia lineal más alejada de la invasión en X de la imagen, Y o Z direcciones pueden proporcionar la cuantificación del comportamiento migratorio invasor. Más avanzadas de imagen análisis usando fluorescencia etiquetada células podría utilizarse para definir y cuantificar células individuales o comportamiento de tipo celular dependiendo de la necesidad experimental o pregunta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Howard Crawford (Universidad de Michigan) para el soporte técnico y proporcionando materiales y equipos para este estudio y Alan Kelleher para soporte técnico.
Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Michigan Rogel cáncer centro Core Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
