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Summary
O9 1 は多能性マウス神経堤細胞株です。ここで O9 1 細胞を培養、特定の細胞型へ O9 1 細胞と分化および遺伝子 siRNA によるノックダウンや CRISPR Cas9 ゲノム編集による O9 1 セルを操作するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。
Abstract
神経堤細胞 (Ncc) は異なったセルタイプに区別でき、複数の組織や臓器に上昇を与える多能性幹細胞に移行しています。O9 の-1 セルの行は、内因性から派生したマウスの胚の Ncc とその率を維持します。ただし、特定のカルチャ条件下で O9 1 細胞は異なる種類の細胞に分化することができます、研究用途の広い範囲で利用します。最近では、マウスでの研究と O9 1 細胞研究の組み合わせであることを示したシグナリング経路エフェクタ ヤップおよび Taz 顎顔面神経堤由来で重要な役割を果たすカバ。O9 の-細胞培養プロセスは他の細胞よりも複雑ですが、O9 1 細胞ラインは Ncc体外を調査するため強力なモデルです。ここでは、異なる種類の細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞などに分化 O9 1 細胞のプロトコルと同様に、その、幹細胞性を維持するために O9 1 細胞株を培養するためのプロトコルを提案する.また、CRISPR Cas9 削除と小さい干渉の RNA を介したノックダウンによる O9 1 細胞の遺伝子の機能喪失の研究を実行するためのプロトコルを説明します。
Introduction
神経堤細胞 (Ncc) は、渡り鳥の驚くべき能力の萌芽期の開発の間に一時的な存在と多能性幹細胞です。Ncc は、表面の外胚葉と神経管の間発信や1萌芽期の開発の間に胚の他の部分への移行します。その機能領域に基づいて、いくつかの頭蓋を含む、さまざまな種類、トランク、迷走神経、仙骨の, と心臓 Ncc に Ncc を分類できます。さらに、Ncc は平滑筋細胞、骨細胞、神経細胞などの複数の細胞系統に分化し、様々 な組織2,3を生じさせるできます。Ncc の開発は、複雑な一連のさまざまな分子シグナルによって、微調整されてます形成イベントが特徴です。Ncc の複雑な規制と多数の構造への重要な貢献を与え、NCC 開発の破綻一般的に先天異常、すべてひと先天性先天性欠損症の約 30% を占めているにつながることができます。神経堤の開発中に異常口唇口蓋、欠陥につながることができます鼻形成、症候群、欠陥欠陥心臓流出路なども乳児死亡率1,4,5,6,7. NCC 開発の分子機構の解明は NCC 開発中の欠陥に起因する疾患の治療法開発のために重要です。様々 な生体外でそして生体内の使用に近づく8,9,10、11,12,13,14 ,15、かなり進展した NCC 研究。生体内で鶏、両生類、ゼブラフィッシュ、マウスなどの動物モデルは、Ncc1を調査する使用されています。さらに、早い人間の胚の開発16に NCC 移行の過程を研究する人間の胚が使用されています。生体外でセルのモデルながん患者の皮下脂肪に由来する人間の Ncc などパーキンソン病17を調査に使用されています。E8.5 マウス胚18から分離した内因性の Ncc の大衆文化から派生した当初、O9 1 NCC の行は勉強してながん。 重要なは、非分化培養条件下での強力な細胞モデル、O9 1 セル多能性幹のようながん。しかし、種類の識別細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、グリア細胞18などに、さまざまな文化状況で O9 1 セルを区別できます。これらのプロパティを指定すると、セル O9 1 使用されている広く頭蓋顔面欠損19,20の分子メカニズム解明などの NCC 関連の研究。
O9 の-1 細胞を維持し、異なったセルタイプに O9 1 細胞を分化、CRISPR Cas9 ゲノム編集と小さい干渉の RNA (siRNA) 遺伝子の機能喪失の研究を実行することによって O9 1 セルを操作するため詳細なプロトコルを提供するここでは、-ノックダウン技術を媒介します。代表的な例としてヤップおよびTazの機能喪失を研究する O9 1 セルの使用が説明されます。ヤップと Taz は、シグナル伝達経路は、細胞の増殖・分化・ アポトーシスの重要な役割を果たしているカバの下流のエフェクターです。カバの経路は、開発といくつかの異なる組織や臓器の恒常性だけでなくさまざまな病気20,21,22,23 の病因に重要であることも示されています。 ,24,25,26,,2728。カバがシグナル伝達のコア コンポーネントには、腫瘍サプレッサー滅菌 20 のようなキナーゼ Mst1/2、WW ドメイン含有サルバドール足場タンパク質、大きい腫瘍のサプレッサーの相同物 (Lats1/2) キナーゼが含まれます。カバ シグナリング ヤップおよび Taz の活性を阻害して、細胞質の劣化を促進します。カバから抑圧せずヤップおよび Taz が核に若しし、転写共活性化因子として機能します。最近示した具体的Wnt1creを使用してヤップおよび Taz のエフェクタ マウス Ncc をシグナリング カバを不活化して重度の E10.5 で胚致死の結果Wnt1Cre2SORドライバー顎顔面欠損20。ヤップと Ncc の Taz の役割を調べるため O9 1 細胞を用いた研究も行ってきました。NCC の増殖と分化、ヤップ・タズノックダウン ヤップおよび Taz 関数を勉強するセル O9 1 細胞で siRNA を使用して生成された、ヤップノックアウト細胞だった CRISPR Cas9 ゲノム編集を使用して生成されます。その他の経路の異なるターゲット遺伝子遺伝子の機能喪失と同じ戦略を適用できます。さらに、ゲインの機能研究とトランスフェクション アッセイも適用できます O9 1 細胞遺伝子の機能と制御の研究をします。ここで説明されているプロトコルは、O9 の-多能性幹細胞性を維持するために細胞を培養するため、異なる培養条件下での他の種類の細胞に分化 O9 1 細胞および遺伝子の機能を研究するために研究者によってガイドとして使用してNcc の分子機構。
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Protocol
1. O9 1 細胞培養前に、の準備
注: O9 1 細胞培養で使用される基底のメディアする必要がありますエアコンされているによってサンドス近交系マウスの各/ウワバイン耐性 (STO) マウスの線維芽細胞の細胞;したがって、STO 細胞は, O9 1 細胞培養を開始する前に以下のように準備する必要があります。
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アクティブな STO 細胞培養
- 7% ウシ胎児血清 (FBS) (萌芽期の幹細胞文化グレード)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン (最終濃度でワシのメディア (DMEM) を変更された完全なダルベッコすることによってアクティブな STO 細胞を培養メディアを準備します。示される)。
注: STO 媒体は、アクティブな STO フィーダー細胞の培養に使用されます。ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミンは、ストレージで沈殿物を形成します。使用する前にピペッティングして完全に溶かします。 - 室温で 30 分間 0.1% ゼラチンで標準 100 mm 細胞培養プレートのコート。潜伏期間後に、余分なゼラチンを吸い出しなさい。塗布後すぐに、プレートを使用します。
注: また、STO メディア プレート カバー、プレート (これは意味される短期記憶とプレコート板を保存するためではなく) の乾燥を防ぐため加湿のインキュベーターでプレートを残してください。 - 37 ° C の水浴; で急速に STO 細胞を解凍します。クリオバイアル、開く前に 70% のエタノールで拭くし、すぐに細胞の全体の瓶を遠心管に転送。
- 遠心分離機管; 滴下 STO メディアに追加します。メディアに細胞の容積比は 1:10 です。
- 180 x g室温 3 分で細胞を遠心分離します。
- ゼラチン コーティング プレートに穏やかなピペッティングおよび転送細胞を混ぜます。
- (37 ° C、5% CO2) 標準のインキュベーターで 24 h の成長する STO 細胞を許可します。
- 媒体を変更する (セル付着) 後にのみシードと古い媒体を破棄後 24 h。
- STO 細胞顕微鏡および 80% の confluency に通路の下で毎日をチェックします。
- STO 細胞継を開始、する前にコート 0.1% ゼラチン板 (ゼラチン ボリュームにその容器の成長メディア ボリュームの半分相当) 室温で 30 分間。
- STO 細胞を通過する成長媒体を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を二度洗い (成長媒体の等量の PBS を追加)。
- PBS を吸引し、0.25% トリプシン-EDTA を追加 (容器サイズに合わせて音量を調整)。その後、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
注: 100 mm プレート成長媒体の 10 mL、3 mL のトリプシン溶液を使用します。150 mm プレート成長媒体の 20 mL、8 mL のトリプシン溶液を使用します。洗浄バッファー使用量は成長媒体のボリュームと同じです。 - STO メディアの等量とトリプシンを不活化します。1:3 1:10 ~ 比で新しい板に種子 STO 細胞。
注: 一般的な拡大スキームは 1 つ 100 mm プレートに 1 つの 150 の mm 板にし 4 つの 150 の mm のプレートに 1 つクリオバイアルから展開して最終的に 16 の 150 mm プレート。
- 7% ウシ胎児血清 (FBS) (萌芽期の幹細胞文化グレード)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン (最終濃度でワシのメディア (DMEM) を変更された完全なダルベッコすることによってアクティブな STO 細胞を培養メディアを準備します。示される)。
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不活化と STO 細胞の凍結
- メディアを凍結 × 2 の準備、STO メディアに次を追加 (最終濃度が示されている): 20 %fbs、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)。
- 混合した後、フィルターは凍結メディア (細孔サイズ 0.22 μ m) x 2 を殺菌し、使用するまで 4 ° C で保存します。2 x 凍結メディアの同じ日を使用し、未使用の凍結メディアを破棄を行います。
- 0.5 mg/mL の濃度で PBS でマイトマイシン C 溶液を準備します。PBS のマイトマイシン C を分解するには、vortexer と粒子を完全に解散する約 45 分の設定低で渦にボトルをテープします。
注: マイトマイシン C、光敏感なと解散するは難しい。
注意: マイトマイシン C は急性毒性は、がんを引き起こす可能性があります。適切な個人用保護具とだけを処理します。 - 0.01 mg/mL マイトマイシン C の最終濃度を既存のメディアに追加することによって STO 細胞を不活性化します。(37 ° C、5% CO2) 標準インキュベーター内 2 時間インキュベートします。
- マイトマイシン C と不活化後 2 回 20 ml の PBS プレート (150 mm) を洗う
- PBS ソリューションを吸引、0.25% トリプシン-EDTA、8 mL を使用して細胞を分離、(37 ° C、5% CO2) 標準加湿インキュベーターの中 5 分間インキュベートします。
- STO メディアの 8 ml のトリプシンを不活化します。
- 細胞液を遠心管に転送します。時間を節約する 1 つの遠心管に 2 つ以上のプレートを組み合わせます。180 x gで 5 分間遠心します。
- 上清を吸引し、5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞液の 10 μ L を使用して、診断を使用して、セルをカウントします。中央の格子正方形のセルを数えるし、10 によって得られる数値を乗算4 1 mL あたりのセルの数を決定します。2 回を数えるし、1 ミリリットルあたりのセル数の最終の見積りを取得する 2 つの数値の平均します。
- 180 x gで 5 分間細胞を遠心します。
- PBS を吸引し、細胞ペレットを 1:1 (ボリューム) で STO メディアと 2 x 凍結メディアを追加します。4 x 106セル/mL (この金額は 1 つ 100 mm プレートの良い) の最終的な細胞濃度のボリュームを調整します。
たとえば、60 x 10 の6セルの合計 4 つの 150 mm 版からをメモ: セル溶液 1 mL を含む各クリオバイアル クリオバイアル、あたり 4 × 106細胞を凍結します。4 つのプレートをもたらす約 15 クリオバイアル (60/4 = 15)。7.5 mL STO メディアと各クリオバイアルに細胞ペレット、再懸濁します、そして因数 1 mL にメディアを凍結 × 2 7.5 mL を追加します。 - ゆっくり凍結媒体細胞ペレットをピペッティングによって再懸濁します。各クリオバイアル セル溶液 1 mL に転送し、それに応じてラベルします。
- クリオバイアルは、蓋付きスチロールの箱 (これは細胞の生存率を改善遅い冷却速度を提供します) 内に配置します。少なくとも 24 時間-80 ° C のフリーザーのクリオバイアルを液体窒素に転送する前に、ボックスに転送します。
注: 最良の結果を得るには、2 x 凍結メディアをセルに追加して、-80 ° C にバイアルを転送する間の時間と同様、時間をカウントするセルを最小化します。
2. O9 1 細胞培養
- O9 1 細胞培養 DMEM に以下を追加することによって基底メディアの準備 (最終濃度が示されている): 15 %fbs、0.1 mM 最小必須メディア (MEM) 必須でないアミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、55 ミリメートル β-メルカプトエタノール、100 U/mL ペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、103単位/ml 白血病抑制因子 (LIF; ストック ボトルを追加しないでください使用の直前に追加すると、)、および 25 ng/mL の線維芽細胞成長因子-基本的な (bFGF; ストック ボトルを追加しないでください使用の直前に追加すると、)。
- フィルターは、基底メディア (細孔サイズ 0.22 μ m) を殺菌し、光から保護するためにホイルで包みます。
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不活化 STO 細胞からエアコンの基底メディアを収集します。
注: は、不活化 STO 細胞を取得した後にのみ進んでください。以降に STO 細胞板から収集した O9 1 基底メディアにエアコン基底メディアと呼びます。- 雪解けが急速に前述 STO 細胞を不活化 (4 x 10 の6セルを含む 1 つのクリオバイアル 1 つ 100 mm プレートだし、コレクションの 10 日後約 100 mL 完備基底メディアが得られます)。種子は、STO のメディアを使用してゼラチン コーティング プレートに STO 細胞を不活化。(37 ° C、5% CO2) 標準加湿インキュベーターで一晩付けるセルを許可します。
- STO 細胞を解凍後 24 時間は、既存の STO メディアを破棄し、基底メディアに置き換えます。
注: 不活化 STO 細胞培養皿; に LIF と bFGF を追加しません。O9 の-1 細胞培養皿を追加します。 - すべての 24 h は、O9 1 基底メディアを使用してメディアを変更し、瓶の中に STO 細胞板から基底メディアを収集します。光から保護するために箔のエアコン基底メディアを含むボトルを包みます。4 ° C で収集したすべてのメディアを保管します。
注: セルが不活化、ので彼らがありますコレクションの数日後と同様に健康的ですこれは予想されることです。 - で汚染をチェックする箔に包まれて (ボトル 1 本) ではなく別のチューブでコレクション毎日の基底のメディアを収集するオプション。24 ウェル プレートを使用して、毎日のメディアの 1 つの mL を各ウェルに置き、顕微鏡下で細菌の汚染をチェックするための標準的なインキュベーターで一晩インキュベートします。
注: 汚染が、黄色の細菌汚染が存在する場合に変更がない場合、メディアにより赤い色が残ります。 - エアコンの基底メディアを収集した後 10 日間 STO 細胞を破棄します。コンバイン (該当する場合) はすべて、収集条件付き基底メディアとフィルター滅菌瓶に (細孔サイズ 0.22 μ m) を消毒します。光から保護するために箔のボトルを包みます。フィルター エアコン基底メディアを保つフィルター日付から 1 ヶ月の最大のための 4 ° C で。
3. O9 1 細胞を維持します。
注: 作業 O9 1 基底メディアは滅菌フィルター エアコンのどの LIF (最終濃度 103ユニット/mL) に、基底メディア、bFGF (最終濃度 25 ng/mL) は、使用する前に細胞培養ディッシュに即座に追加されます。このメディアは、光から保護され、4 ° C で保存されている必要があります。
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O9 の-細胞の回復
- 因数を準備する 4 ° C で、一晩基底膜マトリックス (例えばマトリゲル) のストック ボトルをゆっくりと融解します。
- 10 %5 mL DMEM の追加株式の基底膜マトリックス膜 5 mL に FBS。-20 ° C で保存されている冷たいピペット チップでピペッティングでよく混ぜる氷の上オリジナル ボトルと因数チューブを保ちます。実験のニーズに応じて異なるボリューム (0.5 mL または 1 mL 因数) の因数を凍結します。複数回基底膜マトリックスの凍結融解は避けてください。
注意: 基底膜マトリックス重合急速に常温。冷たいピペット チップを使用して、意図しない重合を避けるために作業するときにチューブを冷たい保つため。 - 実験を開始する前に、4 ° C で氷 2 h または基底膜マトリックスの因数を解凍します。延長時間のための 4 ° C で行列を格納しないようにします。
- フィルター滅菌 DMEM を使用し 10 %fbs 最終濃度 0.5 mg/mL にプレートをコートする基底膜マトリックスを希釈します。1 h. (図 1に示すように)、プレートを完全にカバーしていることを確認のため室温で基底膜マトリックス (0.5 mg/mL) 板をコートします。
- コーティング表面に触れることを避けるために基底膜マトリックスを吸引するとき、プレートを傾ける30 分の 37 ° C で乾燥プレート。オーバー コーティング プレートを乾燥しないでください。
注: は、すべてのメディアおよび試薬が使用する準備ができている場合にのみ進んでください (基底メディア、10% の無菌ろ過を完備、DMEM、LIF、bFGF FBS)。 - 37 ° C の水浴; に配置すると、クリオバイアル O9 1 細胞の迅速なリカバリします。ゆっくりと液体になります完全に解決するまでバイアルを旋回し、次のステップに進んでください。
- クリオバイアル (約 1 mL) からすべての細胞液を 15 mL 遠心管に転送します。10 %dmem の 5 冊を追加 FBS (0.22 μ m のフィルター孔径の滅菌フィルター) と再懸濁します。
- 180 x gで 3 分間遠心します。細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。LIF と bFGF を添加したエアコンの基底メディア (タップ) して細胞ペレットを再懸濁します。診断を使用して、セルをカウントします。
注: LIF と bFGF を添加したエアコンの基底メディア O9 1 セル行の率を維持するために重要です。意図しない細胞分化を避けるために適切なメディアを追加するのに注意してください。 - 種のセルは、10,000 から 15,000 セル/cm2 6 ウェル プレートです。メディアを変更する前に一晩を添付し、標準細胞文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) で成長する細胞を許可します。
- セルがメディア (図 2に示すような健康的な接続されたセル外観) を変更する前に接続されていることを確認します。
- 常に培地 (LIF と bFGF エアコン基礎培地を使用) セルの O9 の-1 の回復後次の日を変更します。
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O9 の-1 セルの通路
- O9 の-1 細胞が 80% の confluency に達したら、基底膜マトリックスを解凍し、前述のように基底膜マトリックス コーティング プレートを準備します。LIF と容器に bFGF 添加条件基底メディアを追加します。また、FBS に 3 日以上標準加湿インキュベーター内部格納して乾燥から基底膜マトリックスを維持せず DMEM を追加します。
- ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 2 mL 2 回すすぎ O9 1 含む井戸 (6 ウェル プレート) と細胞を失うことを避けるためにゆっくりピペットします。
- 1 ml の 10% を DMEM の等しい量で 3 分 Neutralize トリプシンの 37 ° C で 0.05% トリプシン-EDTA の細胞を切り離す FBS。繰り返しできるだけプレートからできるだけ多くの細胞を分離するによくの全体の表面に液体をピペットします。
注: トリプシン濃度は 0.25% の代わりに 0.05% です。ストック ボトルから希釈する DPBS を使用します。 - プレートから細胞を分離するときの泡の生成を避けます。
- すべての細胞液を遠心管と 180 x gで 3 分間遠心に転送します。細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。LIF と bFGF を添加したエアコンの基底メディアで穏やかなピペッティングによる遠心管の細胞ペレットを再懸濁します。
- 上記のように総細胞数をカウントする、検定を使用します。種子のセル (10,000 に 15,000 セル/cm2) 3.1.4 に 3.1.8 の手順で説明されているコーティングのプレートです。6 ウェル プレートの 1 つの井戸は種子に 10万個のセルが必要になります。
- 付 (37 ° C、5% CO2) 標準細胞文化のインキュベーターで成長します。常に培 O9 1 セルを通過後次の日を変更します。
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O9 の-細胞の凍結
- O9 の-1 セルのためのメディアを凍結 × 2 を準備するには、希釈する DMEM で次 (最終濃度が示されている): 40 %fbs と 20 %dmso。
- フィルター滅菌凍結メディア × 2 と 4 ° C でそれを維持メディアを凍結 × 2 は、使用日に行わなければなりません。すべての未使用の凍結メディアを破棄します。
注: は、80% の confluency O9 1 細胞を固定します。 - DPBS と井戸を 2 回リンスします。細胞を失うことを避けるためにゆっくりピペット。
- 37 ° C、3 分で 0.05% トリプシン-EDTA と細胞を分離し、10% の等量とトリプシンを中和する FB DMEM の。繰り返しできるだけプレートからできるだけ多くの細胞を分離するによくの全体の表面に液体をピペットします。
- 180 x gで 3 分間遠心遠心管にプレートのすべての内容を転送します。上清を吸引し 2 mL の PBS を追加し、軽くたたくことによって再懸濁します。
- 上記のように診断を使用して、セルをカウントするのに細胞液の 10 μ L を使用します。
- 180 x gで 3 分の細胞液を遠心します。上清を吸引し、必要な基底のメディアの量を調整2 x 凍結メディアの等しい量を追加します。
注: 1 x 106セル/mL (クリオバイアルあたり 1 mL) の濃度で細胞が固定します。 - クリオバイアルにセルを転送し、それに応じてラベルします。液体窒素に転送する前に少なくとも 24 時間-80 ° C で遅い冷却速度の蓋のスチロールの箱の中クリオバイアルを置きます。
注: 最良の結果を得るには、時間とメディアを凍結し、-80 ° C にバイアルを移すこと × 2 を追加するまでの時間をカウントするセルを最小化します。
4. O9 1 セルの操作
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O9 の-1 細胞で siRNA ノックダウンを実行します。
- 解凍し、実験を開始する前に (手順 3.1.4–3.1.8) 上記のように基底膜マトリックス 24 ウェル プレートをコートします。回復で O9 1 セル、合流の 60% から 80% に成長させることをシードします。
- 適切なよく量に応じて血清自由な媒体のリポソームを希釈します。最終的に血清自由な媒体の siRNA を希釈します。メーカーの推奨比率で希釈したリポソームに希釈した siRNA を追加します。ピペッティングでよく混ぜるし、孵化させなさい。
注: 使用量、時間、培養温度の製造元のガイドに従ってください。 - メーカーの推奨事項に従って細胞に siRNA 脂質複合体の適切なボリュームを追加します。
- (37 ° C、5% CO2) 標準細胞文化のインキュベーターで 24 h のための細胞を孵化させなさい。適切な (エキス RNA、タンパク質抽出物、染色、等.) として下流の手順に従います
注: siRNA ノックダウン時間と濃度個々 の実験によって異なります。
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CRISPR Cas9 ゲノム編集による O9 1 細胞遺伝子ノックアウトを実行します。
注: は、哺乳類の細胞ライン29CRISPR Cas9 を使用して以前に発行されたプロトコルを参照してください。ここは CRISPR Cas9 ゲノム編集と関連する手順の簡単な説明です。- SgRNA デザイン ツールを使用して sgRNA シーケンスを取得します。
- PSpCas9 に sgRNA を縛る (bb) - 2a - GFP ベクトル30。
- メーカーの推奨事項に従って標準リポフェクション プロトコルを使用してベクトルを持つ O9 1 セルを transfect します。
- セル 5% CO2と 37 ° C で 24 時間のスタンダード セル文化インキュベーターで孵化させなさい。
- 蛍光活性化細胞は、GFP/7 AAD に基づく (FACS) を並べ替えを実行します。シード GFP + 96 ウェルのプレートに単一のセルです。
- さらに 4 日間孵卵器で細胞を成長します。1 つ以上のコロニーがあるすべての井戸を破棄します。
- 削除を検出するために設計したプライマーで PCR を行います。PCR 後に、バンドのサイズを評価する agarose のゲルの PCR の製品を実行します。CRISPR Cas9 用 (ヤップノックアウト結果の例は、図 3に示す) 西部のしみを実行するを使用して達成されるノックアウト効率を検証します。
5. O9 1 細胞の分化
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O9 の-細胞の骨芽細胞への分化
- アルファ MEM で次を希釈培養メディアを準備する (最終濃度が示されている): 0.1 mM デキサメタゾン、100 ng/mL 骨形成タンパク質 2 (BMP2)、50 μ g/mL アスコルビン酸、10 mM b-グリセロリン酸、10 %fbs、100 U/mLペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL。
- 図 4に示すように、免疫染色によって分化した骨芽細胞におけるオステオカルシン、骨芽細胞マーカーを検出します。
注: 骨分化誘導は、赤いアリザリン染色とアルカリホスファターゼ染色または骨芽細胞の他のマーカーを使用しても評価できます。
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O9 の-細胞の軟骨細胞への分化
- 軟骨細胞分化のメディアの準備、希釈するアルファ MEM で次 (最終濃度が示されている): 5% ウシ胎仔血清 (FCS)、1% インシュリン ・ トランスフェリン-セレン (ITS)、100 U/mL ペニシリン、100 mg/mL ストレプトマイシン 10 ng/mL 変形成長因子 β (TGF-b3)、50 mg/mL アスコルビン酸、10 ng/mL BMP2、0.1 mM デキサメタゾン、1 mM ピルビン酸ナトリウム。
- O9 の-1 の単分子膜の最初の文化 3 日間細胞の骨形成系メディアで trypsinize し、さらに 7 日間培養軟骨細胞分化メディアで存在しており形式として。
- アルシアン ブルー染色や軟骨細胞のマーカーは軟骨分化をロバ。
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O9 の-1 セルの平滑筋細胞への分化
- 平滑筋細胞分化培地を準備する希釈 DMEM で次 (最終濃度が示されている): 100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンおよび 10 %fbs。
- 図 5の例として示されている平滑筋アクチン (SMA) などの平滑筋細胞のマーカーに対する抗体を用いた染色蛍光とロバ平滑筋細胞分化。
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O9 の-細胞のグリア細胞への分化
- グリア細胞分化培地を準備する希釈 DMEM/f12 キーで次 (最終濃度が示されている): B-27 サプリメント、2 mM L グルタミン、50 ng/mL BMP2、100 U/mL ペニシリン、100 mg/mL ストレプトマイシン、50 ng/mL、LIF および 1% x 1 熱不活化政府短期証券。
- グリア細胞の分化を蛍光脂肪酸結合タンパク質 7 (FABP7) などのグリア細胞マーカーに対する抗体で染色を行い評価します。
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Representative Results
ノックダウンとノックアウト実験の目的は、ヤップおよびTazの機能喪失 O9 1 細胞の効果を研究することだった。ノックダウンとノックアウト実験前に我々 確かめなければならない基底メディアと文化 O9 の-1 セル (例では、図 1、および回復 O9 1 細胞のように、全体の板をカバーする基底膜マトリックス ニーズのため上記のように準備します。図 2に示すように、液体窒素)。行ったノックダウン実験前述のヤップ・タズが同時にダウン ノックしました。ヤップsiRNA とTaz siRNA の同量は、メーカーの推奨最終巻に追加されました。コントロール プレートに nontargeting siRNA の等しい量を追加しました。
ヤップ-王らによって説明 CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用してヤップのエキソン 3 を削除することによって生成された null セル O9 1行20. CRISPR Cas9 ゲノム編集上や王らを使用してノックアウト実験を行った。20. 我々 は両側にヤップのエキソン 3 次の sgRNA シーケンスを使用: 3 '5'-caccgtggattacgtgggtatgtt (sgRNA1-フォワード)、3 '5'-aaacaacatacccacgtaatccac (sgRNA1-リバース)、3 '5'-caccgagatggtctaatgtagtga (sgRNA2-フォワード)、5 '-aaactcactacattagaccatctc-3 ' (sgRNA2 ・ リバース)
前方の鎖に CACC を追加しました、AAAC は逆の繊維に追加されました。Oligo しなかったので、G で始まるし、C が逆鎖の 3' 末端に追加された G は、前方の鎖の 5' 端に追加されました。編集王らと上記で説明した手順 CRISPR Cas9 ゲノムの中に20、細胞だった不要な分化を避けるために、LIF、bFGF 添加 O9 の-1 セルの条件付け基底媒体の。次、PCR のプライマーはヤップ削除を検出するために使用された: 3 '5'-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT (フォワード) と 3 '5'-GGCCATCATAGATCCTGGACG-(リバース)。SgRNAs の位置ですから基本 #7973399 に #7974433 マウスの染色体 9 に。染色体上の PCR プライマーの位置は、基本 #7973306 から #7974478 です。PCR 後エクソン 3 の削除とヤップノックアウトのための PCR バンドは agarose のゲル; 138 bp のバンドとして登場野生型のヤップは 1173 bp バンドとして登場。CRISPR Cas9 ゲノム編集によるヤップノックアウトの効率性は、図 3に示すように、西部のしみが付くことと検証されました。
前述のように、O9 1 細胞は特定の細胞のタイプへの分化を促進するために特定の分化誘導メディアで培養することができます。分化の評価は定量的 PCR または特定の細胞マーカーの免疫染色などの様々 なアプローチを使用して行うことができます。例,としては、図 4は、O9 細胞培養骨芽細胞を誘発するメディアに、オステオカルシン (Ocn, 骨芽細胞マーカー) に対する抗体と免疫細胞によって評価された骨芽細胞へと分化を示しています。結合遺伝子ノックダウンとノックアウト実験上記、O9 1 セル広く使用できる表現型解析・遺伝子機能研究。たとえば、両方の野生型とヤップ-null O9 1 細胞培養平滑筋細胞分化培地で, 平滑筋アクチン (SMA、平滑筋細胞のマーカー) に対する抗体と免疫細胞によって評価します。一方、ほとんどの野生型 O9 1 セルが (図 5 a)、SMA 陽性平滑筋細胞に上昇を与えたヤップ-null O9 1 セルにヤップを重要な果たしていることを示される SMA 陽性平滑筋細胞 (図 5 b) に区別するために失敗しましたNcc の平滑筋細胞への分化における役割。
図 1: 35 mm プレートを完全に覆うマトリゲル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: O9 1 液体窒素からの回復後の細胞の 24 h.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 西部のしみデータ CRISPR Cas9 ゲノム編集による O9 1 セルでヤップの効率的なノックアウト (ko) を表示します。wt: 野生型。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 骨芽細胞オステオカルシン (Ocn) を示すマーカー O9 1 細胞が骨芽細胞による骨分化条件の下に上昇を与えたことの免疫蛍光染色します。細胞は (緑)、骨芽細胞マーカー Ocn 抗体で染色された、核染色 DAPI (青)。矢印は、Ocn 陽性細胞を示しています。オステオカルシン (Ocn, 骨芽細胞マーカー);DAPI (′、6-diamidino-2-phenylindole)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5 。平滑筋アクチン (SMA) に対し、ほとんどの野生型 O9 1 細胞は平滑筋細胞の分化条件下で平滑筋細胞 (A) に上昇を与えたことを示すの免疫蛍光染色ヤップ-null O9 1 セルに失敗しました平滑筋細胞 (B) に分化します。細胞は (赤)、SMA 抗体で染色された、核染色 DAPI (青)。矢印は、SMA 陽性細胞を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
NCC は、さまざまな組織や臓器に汎用性と主要コントリビューターを胚形態形成中です。O9 の-1 セルの行は、その潜在的な多くの異なったセルタイプに区別するためを維持し、Ncc、遺伝子機能とながん分子制御を勉強するため生体外で役に立つツールの生体内特性を模倣します。O9 の-1 セルの別の状態は、異なる神経堤の子孫体内O9 1 細胞の培養条件によって対応があります。O9 の-1 細胞は文化の条件を差別化する、正規の幹細胞文化のようで培養したときの多能性の状態で維持できます。差別 O9 1 セル可能性があります pre-migratory と渡り鳥多能性幹のようながん体内に対応しています。さらに、O9 1 セルは遺伝子機能および多能性幹から Ncc の分化時の調節を研究するための重要な利点である特定の分化培養条件下で多くの異なったセルタイプに区別することができます。特定の区別されたセルにセルを入力します。O9 の-1 細胞は種々 の細胞に分化する細胞の運命があるを用いて神経堤の子孫体内の対応があります。研究関心に応じて O9 1 セルを操作および補完する生体内でNCC 研究動物モデルを異なる培養できます。
遺伝子の機能喪失と機能獲得を含め、NCC のイベントを研究する O9 1 セルを操作する様々 な方法があります。ここでは、例は、どの siRNA でノックダウンと CRISPR Ca 9 遺伝子実験を編集を行ったカバ経路エフェクターヤップの機能喪失研究20の O9 1 セルに掲載されています。O9 1 細胞とマウス モデルの併用でヤップ NCC 増殖の調節に重要な役割を果たしているし、平滑筋への分化細胞20私たちの研究で示されました。別のモデルで他の研究も Ncc。 ヤップのヤップの重要な役割を示したマウス神経堤平滑筋分化31に必要、強化人間 NCC 運命と移行32を示されています。さらに、ヤップ、初期アフリカツメガエル開発33の中に表されます。O9 1 携帯回線が優秀な遺伝子ノックダウンと量的な PCR (qPCR) など他の下流の分子技術を実行する、西部しみが付くこと、および免疫染色の利便性と組み合わせて O9 1 セルでノックアウトの効率をサポートします。簡単にすることができます NCC モデルを生体外で操作。機能喪失研究に加えて我々 が上記で説明した、以前20、他用途 O9 1 セルの記載されている実験を必要とするため、効率的な代替としてながん O9 1 細胞の研究を使用することができます、。クロマチン免疫沈降 (チップ seq) をシーケンスなどの組織の比較的大量の。しかし、多く体内セル イベント NCC 移行などに依存する組織の複雑な相互作用、O9 1 セルが正確に NCC 移行生体内でをまねることができるので、方法も不明のまま。O9 1 細胞の in vitro研究の制限のためは、動物モデルを用いた O9 1 細胞は生体内での観察を検証することをお勧めします。
O9 の-1 セルの行を使用して研究するときながん体外、ルーチン培養中の細胞の率を維持する重要です。O9 1 細胞の率は、AP 2 a など Sox9 NCC マーカー遺伝子の発現を評価することにより文化の初めにテストできます。同様に、特定のセルタイプに区別するそれらによって O9 1 細胞の分化能をテストできます。O9 の-1 セルのルーチン培養中に不要な分化を避けるためは、ここで説明する確立されたプロトコルと一貫性のある方法で実験の手続きを行ってください。エアコンの基底メディアの入念な準備と新鮮な LIF と bFGF の正しい濃度添加 O9 1 細胞の率を維持するため重要です。さらに、実験のタイムラインは、慎重に計画する必要があります、O9 1 細胞を培養、最初非アクティブなフィーダー STO 細胞を準備し、約 1 ヶ月間は、エアコンの基底メディアの収集が必要です。以前の研究では、基底膜マトリックスは茎の葉と同様、筋肉および神経系前駆細胞の潜在的な差別化を維持するために重要な細胞34,35,36であることを示しています。ここで説明したプロトコルでは、基底膜マトリックス付ける O9 1 セルのプラットフォームを提供し、潜在的な分化を維持するのに役立ちます。したがって、基底膜マトリックス実験結果および繰り返されたとき彼らの整合性に影響を与える重要な要因であります。上記の説明し、基底膜マトリックスの複数の凍結融解サイクルを回避するプロトコルに従って厳密に基底膜マトリックスの準備をお勧めします。また、リカバリすると O9 1 細胞凍結状態からの文化に、液体窒素から 37 ° C の水浴にセルを移動するプロセスされる必要がある迅速に、全体のプロセス中に任意のボルテックスを回避します。また、O9 1 細胞の増殖も O9 1 細胞の率を維持するために回避する必要があります。O9 1 セルを通過するときは、正しく解離代わりに 0.25% 0.05% トリプシン濃度を希釈して、セルが表示されることを確認します。非常に軽くピペッティング繰り返し単一細胞懸濁液を達成するために集約された細胞の形成を回避するために必要です。一般に、O9 1 セル行の処理のプロセス全体は、慎重に、慎重に行われる必要があります。
O9 の-1 セルの行は、要約すると、Ncc O9 1 細胞の生体内で研究する相補的な方法の容易さなどの明白な利点を持っているために使用場合は特に体外Ncc、勉強のため非常に便利なツール アクセスできると使いやすさ。十分なセルの実験の番号を取得できます。研究のさまざまな分野でアプリケーションの広い範囲で使用するための大きな可能性が O9 1 細胞の分化機能を考えると、あります。O9 1 セルに便利に使えるクイック薬物テストとスクリーニング、チップ seq、高スループット シーケンス (seq ATAC) と RNA シーケンス (Seq RNA)、遺伝子機能の獲得と損失の関数トランスポザーゼ アクセス クロマチンなどのアプリケーションにシグナル伝達の制御研究と同様、研究。O9 の-1 セルの処理の標準的なプロトコルの使用は使用される研究の再現性を促進します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ニコール Stancel、博士号を取得、ELS、テキサス心臓研究所で科学的な出版物の編集サポートを提供しました。また次の資金源に感謝: アメリカの心臓協会のナショナル センターの科学者開発補助金 (j. 王に 14SDG19840000)、Rolanette、Berdon ローレンス ・骨疾患プログラムのテキサスから 2014 ローレンス研究賞 (j. 王に)、健康 (DE026561 ・ j ・ ワン、DE016320、r. Maxson に DE019650 に DE025873) の国立機関。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin - streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
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遺伝学、問題 140、CRISPR Cas9 O9 1 細胞、遺伝子ノックアウト遺伝子ノックダウン、神経堤細胞Erratum
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
