Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 הוא קו תא multipotent העכבר הרכס העצבי. כאן נתאר מפורט שלב אחר שלב פרוטוקולים culturing O9-1 תאים, המבדילים O9-1 תאים תאים מסוים סוגים של מניפולציה גנטית O9-1 תאים על-ידי שימוש בתיווך siRNA נוקאאוט או עריכה של הגנום CRISPR-Cas9.

Abstract

תאי הרכס העצבי (NCCs) מעביר multipotent תאי גזע יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, להצמיח מרובים רקמות ואיברים. שורת התאים O9-1 נגזרת אנדוגני העכבר NCCs עובריים ושומר על multipotency שלה. עם זאת, בתנאים תרבות מסוימת, O9-1 התאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומי מחקר. לאחרונה, עם השילוב של העכבר מחקרים ולימודים תא O9-1, אנחנו הראו כי ההיפופוטם איתות לשביל effectors הפה, טאז תפקיד חשוב בהתפתחות ואסטתיים נגזר הרכס העצבי. למרות תהליך culturing עבור תאים O9-1 הוא מסובך יותר בשימוש עבור שורות תאים אחרים, שורת התאים O9-1 הוא מודל חזק על חקירת NCCs חוץ גופית בתוך. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing הקו תא O9-1 כדי לשמור על stemness שלה, כמו גם פרוטוקולים עבור המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם. בנוסף, פרוטוקולים מתוארים לביצוע מחקרים אובדן-של-פונקציה ג'ין בתאים O9-1 על-ידי שימוש CRISPR-Cas9 והמומנט קטן מפריעות נוקאאוט בתיווך RNA.

Introduction

תאי הרכס העצבי (NCCs) הם תאי גזע דמוי multipotent עם יכולת מדהימה נודדות, קיום חולף במהלך התפתחות עובריים. NCCs מקורם בין האאקטודרם השטח של הצינור העצבי ולהעביר אל חלקים אחרים של העובר במהלך התפתחות1. בהתבסס על תחומים פונקציונליים שלהם, NCCs יכולים להיות מסווגים לתוך מספר סוגים שונים, כולל הגולגולת, תא המטען, vagal, עצם העצה, NCCs הלב. בנוסף, NCCs ניתן להתמיין שושלות תאים מרובים, כגון תאי שריר חלק, תאים עצם הנוירונים, להצמיח רקמות שונות2,3. הפיתוח של NCCs מאופיין על ידי סדרה מורכבת של אירועים morphogenetic, כי הם יסודי על ידי אותות מולקולריים שונים. לאור מורכבות ויסות NCCs ותרומתם מבנים רבים חשוב, dysregulation של פיתוח NCC יכול להוביל בדרך כלל מולדת למומים מולדים, באיזה חשבון כמעט 30% של כל אדם מולדות מומים מולדים. ליקויים במהלך פיתוח הרכס העצבי יכול להוביל שסוע שפתיים/החיך, פגם באף צורה, תסמונות, פגמים כגון מערכת יצוא לב פגומים או אפילו תמותת1,4,5, 6 , 7. הבנת המנגנונים המולקולריים של פיתוח NCC חשוב לפיתוח טיפולים עבור מחלות הנגרמות על ידי ליקויים בהתפתחות NCC. עם השימוש השונים במבחנה , ויוו מתקרב8,9,10,11,12,13,14 ,15, התקדמות ניכרת נעשתה במחקר NCC. In vivo, מודלים בבעלי חיים, כולל עופות, דו-חיים, דג זברה ועכברים, שימשו כדי לחקור NCCs1. יתר על כן, עוברי אדם שימשו כדי לחקור את תהליך ההעברה NCC במהלך התפתחות העובר מוקדם16. במבחנה, מודלים תא NCCs, כגון NCCs האנושי, כי מקורם החולה השומן התת עורית שימשו כדי לחקור את מחלת פרקינסון17. הקו NCC O9-1, אשר נגזר במקור מתרבויות המונית של NCCs אנדוגני מבודד E8.5 העכבר עוברי18, הוא מודל חזק תא ללמוד NCCs. חשוב, בתנאים תרבות שאינם מבדילים, תאים O9-1 NCCs גזע דמוי multipotent. עם זאת, בתנאים תרבות שונות, תאים O9-1 יכול להיות מובחן סוגי תאים מכובדים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם, chondrocytes וגלייה18. לאור מאפיינים אלה, תאים O9-1 שימשו בהרחבה ללימודים הקשורות NCC, כגון חקירת המנגנון המולקולרי של הפנים הגולגולתי פגמים19,20.

כאן, פרוטוקולים מפורט ניתנים לשמירה על תאי O9-1, המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים של מניפולציה O9-1 תאים על-ידי ביצוע גנים לימודי אובדן-של-פונקציה עם עריכה הגנום CRISPR-Cas9 ו- RNA מפריעות קטן (siRNA)- מתווכת הטכנולוגיות תמונות ציפורים. בתור דוגמא מייצגת, מתואר השימוש O9-1 תאים כדי לחקור הפה , טאז אובדן-של-פונקציה. הפה טאז effectors במורד הזרם של ההיפופוטם איתות, אשר ממלא תפקיד קריטי התפשטות תאים, בידול ולאחר אפופטוזיס בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מסלול היפו גם הוכח להיות חשוב פיתוח, הומאוסטזיס של מספר ברקמות שונות ואיברים, וכן בפתוגנזה של מחלות שונות20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. מרכיבי הליבה של היפו איתות כוללים את הגידול משתיק קול סטרילית כמו 20 kinases Mst1/2, WW המכילות תחום סלבדור לגרדום חלבונים kinases homolog (Lats1/2) משתיק קול של גידול גדול. היפו איתות מעכב פעילות הפה, טאז ומקדם שפלותם בציטופלסמה. ללא דיכוי של היפופוטם, הפה, טאז יכול translocate לתוך גרעין האטום, לתפקד כמו תעתיק שיתוף activators. אנחנו לאחרונה הראה כי במיוחד inactivating ההיפופוטם איתות effectors הפה, טאז עכבר NCCs באמצעות Wnt1שלcre וכתוצאה Wnt1Cre2SOR נהגים עובריים lethality ב E10.5 עם חמור פגמים ואסטתיים20. אנחנו גם הופיעו מחקרים באמצעות תאים O9-1 כדי לחקור את התפקיד של הפה ו Taz ב- NCCs. כדי לחקור הפה, טאז פונקציה NCC התפשטות, בידול, הפה , טאז נוקאאוט תאים נוצר בתאים O9-1 על-ידי שימוש siRNA, הפה נוקאאוט תאים נוצרו באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9. האסטרטגיות אובדן-של-פונקציה באותו הגן ניתן ליישם יעד אחר גנים במשעולים אחרים. בנוסף, רווח-של-תפקוד לימודי, תרביות תאים מבחני ניתן להחיל גם לתאים O9-1 ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה. הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לשמש על ידי חוקרים מדריכים culturing O9-1 תאים כדי לשמור על multipotent stemness, על הבחנה O9-1 תאים לתוך סוגי תאים אחרים בתנאים תרבות אחרת, ועל לימוד תפקוד הגן, המנגנון המולקולרי של NCCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לפני תרבית תאים O9-1

הערה: הבסיס מדיה המשמשת עבור תרבית תאים O9-1 בטח יש כבר נעשים על ידי סנדוס מוכלאים עכברים thioguanine/ouabain-עמידים (STO) העכבר פיברובלסט תאים; לכן, STO תאים צריך להיות שהושג והכינו כמפורט להלן לפני שמתחילים תרבית תאים O9-1.

  1. תרבית תאים STO פעיל
    1. להכין מדיה עבור culturing פעיל STO תאים על ידי ביצוע של Dulbecco מלאה שונה מדיה של הנשר (DMEM) עם 7% סרום שור עוברית (FBS) (בתאי גזע עובריים תרבות כיתה), 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 2 מ מגלוטמין (ריכוזים הסופי מסומנים).
      הערה: בינוני STO משמש לגידול תאים מזין STO פעיל. פניצילין, סטרפטומיצין וגלוטמין עשויים בצורת משקעים אחסון; מתמוסס לחלוטין על ידי pipetting לפני השימוש.
    2. המעיל צלחת תרבות תא סטנדרטי 100 מ מ עם ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תקופת דגירה, תשאף הג'לטין נוספת. שימוש לצלחת מיד לאחר ציפוי.
      הערה: לחלופין, מכסה את הצלחת עם STO מדיה, להשאיר את הצלחת חממה humidified כדי למנוע את ייבוש של הצלחת (דבר זה נועד רק לאחסון לטווח קצר, לא לאחסון צלחות precoated).
    3. להפשיר את התאים STO במהירות בתוך אמבט מים 37 ° C; לנגב את cryovial עם 70% אתנול לפני הפתיחה, להעביר מיד את בקבוקון שלם של תאים שפופרת צנטרפוגה.
    4. להוסיף את המדיה STO dropwise הצינור צנטריפוגה; היחס לפי נפח התאים למדיה הוא 1:10.
    5. Centrifuge התאים ב x 180 גרם במשך 3 דקות ב- RT.
    6. מערבבים על ידי תאים pipetting והעברת עדין לצלחת מצופה ג'לטין.
    7. לאפשר STO תאים לגדול במשך 24 שעות ביממה ב חממה סטנדרטי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    8. לשנות את המדיום (רק לאחר התאים לדבוק) 24 שעות לאחר זריעה, ביטול המדיום הישן.
    9. בדוק STO תאים בכל יום תחת מיקרוסקופ. ומעבר ב 80% confluency.
      1. לפני שמתחילים STO תא passaging, מעיל צלחות עם ג'לטין 0.1% (ג'לטין נפח שווה חצי אמצעי מדיה צמיחה עבור כלי הדם הזה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. המעבר STO תאים, תשאף צמיחה מדיה, לשטוף תאים עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) פעמיים (להוסיף PBS ב אמצעי שווה של צמיחה מדיה).
      3. האחות PBS ולהוסיף 0.25% טריפסין-EDTA (להתאים את עוצמת הקול על-פי גודל הכלי); לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
        הערה: צלחת 100 מ מ, לשימוש 10 מ"ל של צמיחה מדיה ו- 3 מ"ל של טריפסין פתרון. צלחת 150 מ מ, לשימוש mL 20 של צמיחה מדיה ו- 8 מ של טריפסין פתרון. הנפח של שטיפת מאגר המשמש שווה לנפח של צמיחה מדיה.
      4. הפוך ללא פעיל טריפסין עם אמצעי אחסון שווה של STO מדיה. זרע STO תאים ללוחות חדש עם יחס של 1:3 ל- 1:10.
        הערה: ערכת הרחבת נפוצה היא להרחיב מ- cryovial אחד לתוך לוח אחד 100 מ מ, צלחת 150 מ מ אחד, ואז על ארבעה לוחות 150 מ מ, ולבסוף ללוחות 150 מ מ 16.
  2. השתקה של כרומוזום, הקפאת תאים STO
    1. להכנת 2 x קפוא מדיה, להוסיף את הקוד הבא STO מדיה (ריכוזים הסופי מסומנים): 20% FBS, 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
    2. לאחר ערבוב, מסנן לעקר את 2 x קפוא מדיה (נקבובית גודל 0.22 מיקרומטר) ואחסן אותו ב 4 ° C עד השימוש. לעשות 2 x מקפיא מדיה לאותו היום להשתמש ולמחוק את המדיה קפוא שאינם בשימוש.
    3. להכין פתרון מיטומיצין C ב- PBS ריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל. כדי להמיס מיטומיצין C ב- PBS, קלטת את הבקבוק on a vortexer מערבולת בטמפרטורות נמוכות הגדרת במשך כ 45 דקות כדי להמיס את החלקיקים לחלוטין.
      הערה: מיטומיצין C הוא בהיר רגיש וקשה להתמוסס.
      התראה: מיטומיצין C רעיל בחריפות, עלול לגרום לסרטן. לטפל רק עם ציוד מגן אישי מתאים.
    4. בטל STO תאים על-ידי הוספת ריכוז סופי של 0.01 מ"ג/מ"ל מיטומיצין C התקשורת הקיימים. תקופת דגירה של 2 h בפנים חממה סטנדרטי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    5. לשטוף צלחות (150 מ"מ) עם 20 מ ל PBS פעמיים אחרי איון עם מיטומיצין C.
    6. האחות הפתרון PBS מביצועם תאים באמצעות 8 מ של 0.25% טריפסין-EDTA, תקופת דגירה של 5 דקות בתוך חממה humidified רגיל (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    7. הפוך ללא פעיל טריפסין 8 מ ל STO המדיה.
    8. להעביר את הפתרון תא שפופרת צנטרפוגה. לשלב צלחת אחד או יותר בתוך שפופרת אחת צנטריפוגה כדי לחסוך זמן. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 180 גרם.
    9. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 5 מ ל PBS.
    10. השתמש µL 10 של הפתרון תא לספור תאים על-ידי שימוש של hemocytometer. לספור את התאים gridded בכיכר המרכזית ולהכפיל את מספר מתקבל על ידי 104 כדי לקבוע את מספר התאים לכל 1 מ"ל. ספור פעמיים, ממוצע שני המספרים כדי לקבל את הערכה הסופית של מספר תאים למיליליטר.
    11. צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב x 180 גרם.
    12. האחות PBS ולהוסיף 1:1 (לפי נפח) STO מדיה ומדיה 2 x מקפיא בגדר התא. לכוון את עוצמת הקול עבור ריכוז תא הסופי של 4 x 106 תאים/mL (סכום זה הוא טוב עבור לוח אחד 100 מ מ).
      הערה: לדוגמה, מתוך ארבעה לוחות 150-מ מ מניב סך של 60 x 106 תאים, מקפיאים 4 x 106 תאים לכל cryovial, עם כל cryovial המכיל 1 מ"ל של התא פתרון. ארבעה לוחות תשואה כ 15 cryovials (60/4 = 15). להוסיף 7.5 mL STO מדיה ו- 7.5 mL של 2 x קפוא מדיה אל התא צניפה, resuspend, aliquot 1 מ"ל לתוך כל cryovial.
    13. Resuspend על ידי לאט pipetting מדיה מקפיא עם תא גלולה. להעביר 1 מ"ל של התא פתרון לכל cryovial, תווית בהתאם.
    14. מקום cryovials בתוך קופסא מכסה פוליסטירן (זה מספק קצב קירור איטי, אשר משפר הישרדות cell). להעביר את תיבת מקפיא-80 ° C לפחות 24 שעות לפני העברת את cryovial חנקן נוזלי.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, למזער את התא ספירת הזמן, כמו גם את הזמן בין הוספת מדיה מקפיא x 2 תאים והעברת בקבוקונים ל-80 מעלות צלזיוס.

2. תרבית תאים O9-1

  1. להתכונן מדיה הבזליים תרבית תאים O9-1 על-ידי הוספת הבאות DMEM (ריכוז סופי מסומנים): 15% FBS, 0.1 מ"מ המינימום חיוני מדיה (מאמ) חומצות אמינו שאינן חיוניות 1 מ"מ נתרן פירובט, 55 מ"מ בטא-mercaptoethanol, פניצילין U/mL 100, 100 U/mL סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 103 יחידות/mL לוקמיה גורם מעכבות (LIF; הוסיף מיד לפני השימוש, אינם מוסיפים בקבוק מניות), ואת ng/mL 25 פיברובלסט גורם גדילה-basic (bFGF; הוסיף מיד לפני השימוש, אינם מוסיפים בקבוק מניות).
  2. מסנן לעקר את התקשורת הבזליים (נקבובית גודל 0.22 מיקרומטר), לעטוף בנייר כדי להגן מפני אור.
  3. לאסוף את המדיה הבזליים ממוזגים מתאי STO מוחלש.
    הערה: להמשיך רק לאחר קבלת תאים STO מוחלש. מדיה הבזליים O9-1 שנאסף STO תא צלחות הוא ןלהל מדיה הבזליים ממוזגים.
    1. הפשרה לא פעיל STO תאים במהירות כפי שתואר לעיל (אחד cryovial המכיל 4 x 106 תאים טובה לוח 100 מ מ אחד, מניב כ- 100 מ ל ממוזגים הבזליים מדיה לאחר 10 ימים של אוסף). זרע להשבית STO תאים לצלחת מצופה ג'לטין באמצעות STO מדיה. לאפשר תאים לחבר בין לילה בחממה humidified רגיל (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    2. 24 שעות לאחר מפשיר STO תאים, למחוק את התקשורת STO הקיים ולהחליף עם התקשורת הבזליים.
      הערה: לא להוסיף LIF bFGF מוחלש STO תא תרבות מנות; להוסיף רק O9-1 תא תרבות מנות.
    3. כל 24 שעות, לשנות מדיה באמצעות מדיה הבזליים O9-1, לאסוף את המדיה הבזליים STO תא צלחות לתוך בקבוק. לעטוף את הבקבוק המכיל ממוזגים מדיה הבזליים בנייר כדי להגן מפני אור. לאחסן בכל אמצעי התקשורת שנאספו ב 4 º C.
      הערה: כי התאים היו לא פעיל, הם עשויים שלא להופיע בריאים ככל שעשו לאחר מספר ימים של אוסף; זה היה צפוי.
    4. באופן אופציונלי כדי לבדוק אם זיהום, לאסוף את המדיה הבסיס עבור כל יום אוסף צינורות שונים (במקום בקבוק אחד) עטופה בנייר כסף. באמצעות צלחת 24-. ובכן, מקום 1 מ"ל של מדיה בכל יום בכל טוב, דגירה בין לילה ב חממה סטנדרטי כדי לבדוק אם זיהום בקטריאלי מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: המדיה נשאר צבע אדום אם אין זיהום אך משתנה לצהוב אם קיים זיהום חיידקי.
    5. לאחר איסוף ממוזגים מדיה הבזליים במשך 10 ימים, למחוק את התאים STO. שילוב (אם ישים) כל הנאספים מותנה מדיה הבזליים, מסנן לחטא (נקבובית גודל 0.22 מיקרומטר) לתוך בקבוק סטרילי. לעטוף את הבקבוק בנייר כדי להגן מפני אור. למנוע מהתקשורת הבזליים ממוזגים המסוננות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש מתאריך מסנן.

3. שמירה על תאים O9-1

הערה: עובד מדיה הבזליים O9-1 הוא מסנן לעקר ממוזגים הבסיס לתקשורת, לאיש אשר LIF (הריכוז הסופי 103 יחידות/mL) ו bFGF (ריכוז סופי 25 ng/mL) מתווספים מיד לצלחת תרבות תא לפני השימוש. מדיה זו צריך להיות מוגן מפני אור ומאוחסנים ב 4 º C.

  1. שחזור של תאים O9-1
    1. לאט לאט להפשיר את הבקבוק מניות של המטריקס קרום המרתף (למשל, Matrigel) בן לילה ב 4 ° C כדי להכין aliquots.
    2. הוסף 5 מ של DMEM עם 10% FBS 5 מ של קרום מטריקס קרום המרתף מניות. מערבבים היטב בעזרת pipetting עם טיפים פיפטה קר המאוחסנים ב-20 ° C. שמור הצינורות המקוריים בקבוק, aliquot על הקרח. להקפיא aliquots בנפחים שונים (aliquots 0.5 mL או 1 מ"ל) בהתאם לצרכי ניסוי. הימנע מפשיר ההקפאה מטריקס קרום המרתף מספר פעמים.
      הערה: קרום המרתף מטריקס polymerizes במהירות בטמפרטורת החדר; השתמש בעצות פיפטה קר ולשמור על צינורות קר כאשר עובד כדי להימנע הפילמור לא מכוונת.
    3. להפשיר aliquot של המטריקס קרום המרתף ב 4 ° C או על קרח 2 h לפני תחילת הניסוי. אל תאחסן המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך זמן ממושך.
    4. השתמש DMEM עיקור מסנן עם 10% FBS לדלל המטריקס קרום המרתף כדי ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל כדי להרגיע את הצלחות. המעיל צלחות עם המטריצה קרום המרתף (0.5 mg/mL) בטמפרטורת החדר במשך ה 1 ודא לחלוטין שזה מכסה את הצלחת (כפי שמוצג באיור1).
    5. להטות את הצלחת כאשר כ רפה בעברית המטריקס קרום המרתף כדי להימנע מלגעת המשטח מצופה; יבש צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יתר יבש מצופה לוחות.
      הערה: המשך רק כאשר כל מדיה, ריאגנטים המוכנים לשימוש (ממוזגים מדיה הבזליים, סטרילי-מסוננים 10% FBS ב DMEM, LIF ו- bFGF).
    6. לשחזר O9-1 תאים במהירות על-ידי הצבת את cryovial באמבט מים 37 ° C; אט-אט מערבולת המבחנה עד הפתרון לחלוטין הופך לנוזל, פנה/י מיד לשלב הבא.
    7. להעביר את כל הפתרון תא cryovial (כ- 1 מ"ל) שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להוסיף 5 כרכים של DMEM עם 10% FBS (מסנן לעקר עם גודל הנקבוביות מסנן של 0.22 מיקרומטר) ו- resuspend.
    8. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 180 גרם. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא. Resuspend בגדר תא (על-ידי הקשה) בתקשורת הבזליים ממוזגים עם LIF ו- bFGF. ספירת התאים באמצעות של hemocytometer.
      הערה: המדיה הבזליים ממוזגים עם LIF ו- bFGF הוא קריטי כדי לשמר את multipotency של הקו הסלולרי O9-1. טיפול שימוש כדי להוסיף את המדיה הנכונים כדי להימנע בשגגה-תאית התמיינות.
    9. תאי זרע מ-10,000 תא/ס מ 15,0002 כדי צלחת 6-ובכן. מאפשרים לתאים לצרף ולצמוח חממה תרבות תא סטנדרטי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) בן לילה לפני שינוי מדיה.
    10. ודא כי התאים מחוברים לפני שתמשיך כדי לשנות מדיה (תאים בריאים המצורפת המראה כמו באיור 2).
    11. תמיד לשנות תרבות המדיה למחרת אחרי ההתאוששות של תאים O9-1 (השתמש ממוזגים מדיה הבזליים שיושלם עם LIF ו- bFGF).
  2. המעבר של תאים O9-1
    1. כאשר תאים O9-1 מגיעים 80% confluency, להפשיר המטריקס קרום המרתף והכן צלחת מצופים מטריצה קרום המרתף כמתואר לעיל. הוסף מדיה הבזליים ממוזגים עם LIF ו bFGF לכלי השיט. לחלופין, להוסיף DMEM ללא FBS למנוע ייבוש המטריקס קרום המרתף ולאחסן בתוך חממה humidified סטנדרטי לא יותר מ 3 ימים.
    2. לשטוף את הבארות O9-1-המכיל (6-ובכן צלחת) עם 2 מ ל תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) פעמיים, פיפטה בעדינות כדי למנוע איבוד תאים.
    3. מביצועם תאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות טריפסין נטרול עם כמות שווה של DMEM עם 10% FBS. שוב ושוב pipette את הנוזל על פני הבאר מביצועם תאים רבים מהצלחת ככל האפשר.
      הערה: ריכוז טריפסין הוא 0.05% במקום 0.25%. השתמש DPBS כדי לדלל מהבקבוק מניות.
    4. למנוע יצירת בועות כאשר בריא התאים מהצלחת.
    5. העברת כל פתרון תא צנטריפוגה שפופרת, צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 180 גרם. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא. Resuspend בגדר תא בצינור צנטריפוגה מאת pipetting עדין בתקשורת הבזליים ממוזגים עם LIF ו- bFGF.
    6. השתמש hemocytometer כדי למנות את מספר התאים הכולל כפי שתואר לעיל. תאי זרע (10,000 עד 15,000 תאים/cm2) לצלחת מצופה מוכן כמתואר בצעדים 3.1.4 כדי 3.1.8. אחד טוב של צלחת 6-ובכן ידרוש 100,000 לתאי הזרע.
    7. מאפשרים לתאים לצרף ולצמוח חממה תרבות תא סטנדרטי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). תמיד לשנות תרבות המדיה למחרת אחרי passaging תאים O9-1.
  3. הקפאת תאים O9-1
    1. כדי להכין 2 x קפוא מדיה עבור תאים O9-1, לדלל את הפעולות הבאות ב- DMEM (ריכוז סופי מסומנים): 40% FBS ו-20% דימתיל סולפוקסיד.
    2. מסנן לחטא 2 x קפוא מדיה ולשמור אותו ב 4 º C. 2 x קפוא מדיה להתבצע ביום בו. למחוק את כל אמצעי התקשורת קפוא שאינם בשימוש.
      הערה: הקפאת תאים O9-1 ב- 80% confluency.
    3. וולס יש לשטוף עם DPBS פעמיים; פיפטה בעדינות כדי למנוע איבוד תאים.
    4. מביצועם תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולאחר מכן לנטרל טריפסין עם כמות שווה של 10% FBS ב- DMEM. שוב ושוב pipette את הנוזל על פני הבאר מביצועם תאים רבים מהצלחת ככל האפשר.
    5. העברת כל התוכן צלחת צינור צנטריפוגה, צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 180 גרם. וארוקן את תגובת שיקוע, להוסיף 2 מ"ל ל- PBS, resuspend על-ידי הקשה.
    6. השתמש µL 10 של פתרון תא לספור תאים על-ידי שימוש hemocytometer כמתואר לעיל.
    7. צנטריפוגה תא פתרון עבור 3 דקות ב x 180 גרם. וארוקן את תגובת שיקוע ולהתאים את כמות מדיה הבזליים הצורך; לאחר מכן, להוסיף כמות שווה של 2 x מדיה מקפיא.
      הערה: תאים מוקפאים-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל (1 מ"ל לכל cryovial).
    8. להעביר תאים cryovials, תווית בהתאם. הצב cryovials בתוך קופסא פוליסטירן מכסה על שיעור קירור איטי ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני העברת חנקן נוזלי.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, למזער את התא ספירת הזמן ואת פרק הזמן בין הוספת 2 x קפוא התקשורת והעברת בקבוקונים ל-80 מעלות צלזיוס.

4. מניפולציה של תאים O9-1

  1. ביצוע siRNA נוקאאוט בתאים O9-1
    1. להפשיר, מעיל צלחת 24-ובכן עם קרום המרתף מטריקס כפי שתואר לעיל (צעדים 3.1.4–3.1.8) לפני תחילת הניסוי. לשחזר, זרע תאים O9-1, ומאפשר להם לגדול ל- 60% עד 80% confluency.
    2. לדלל ליפוזומים בתקשורת ללא סרום לפי טוב האחסון המתאים. לדלל siRNA בתקשורת ללא סרום לשלב הגמר. להוסיף siRNA מדולל ליפוזומים מדולל על יחס המומלץ על ידי היצרן. מערבבים היטב בעזרת pipetting, דגירה.
      הערה: בצע את המדריך של היצרן על אחסון בו נעשה שימוש, זמן לטמפרטורה של דגירה.
    3. להוסיף אמצעי אחסון המתאים של קומפלקס siRNA-השומנים לתאים בהתאם להמלצות היצרן.
    4. דגירה תאים עבור 24 שעות ביממה בחממה תרבות תא סטנדרטי (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). בצע את השלבים במורד הזרם כמו המתאים (תמצית RNA, תמצית חלבונים, מכתים, וכו '.)
      הערה: פעמים תמונות ציפורים siRNA וריכוזי יכול להשתנות בהתאם הניסוי בודדים.
  2. ביצוע נוקאאוט גנטי בתאי O9-1 באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9
    הערה: עיין פרוטוקול שפורסמו קודם לכן עבור שימוש CRISPR-Cas9 בתרבית של תאים קווים29. בתנאי הנה תיאור מפושט של עריכה הגנום CRISPR-Cas9 של צעדים נלווים.
    1. לקבל רצפים sgRNA באמצעות כלי עיצוב sgRNA.
    2. מאתרים ומפסיקים את sgRNA כדי pSpCas9 (bb) - 2a - GFP וקטור30.
    3. Transfect O9-1 תאים עם וקטור באמצעות פרוטוקול סטנדרטי lipofection בהתאם להמלצות היצרן.
    4. דגירה בתאים חממה התרבות תאים סטנדרטית ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
    5. בצע תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) המבוסס על ה-GFP/7-מ. זרע GFP + תאים בודדים לתוך צלחות 96-ובכן.
    6. לגדל את התאים בחממה במשך 4 ימים נוספים. למחוק את כל בארות בעלי המושבה יותר מפעם אחת.
    7. לבצע PCR עם תחל תוכנן עבור מזהה את המחיקה. לאחר PCR, להפעיל מוצרי ה-PCR ג'ל agarose כדי להעריך את גודל הלהקה. לאמת את היעילות נוקאאוט מושגת על ידי שימוש CRISPR-Cas9 editingby ביצוע המערבי סופג (דוגמה של הפה נוקאאוט תוצאות מוצג באיור3).

5. O9-1 תאית התמיינות

  1. התמיינות של תאים O9-1 לתוך תאי העצם
    1. כדי להכין בידול osteogenic מדיה, לדלל את הפעולות הבאות באלפא-מ (ריכוזים הסופי מסומנים): דקסמתזון 0.1 מ מ, 100 ננוגרם למ"ל עצם morphogenetic חלבון 2 (BMP2), חומצה אסקורבית µg/mL 50, 10 מ מ b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל.
    2. לזהות דה מרקר אוסטאובלסט, אוסטאוקלצין, הבדיל תאי העצם על-ידי immunostaining כפי שמוצג באיור4.
      הערה: בידול Osteogenic גם ניתן להעריך באמצעות סמנים אחרים של תאי העצם או עם Alizarin אדום להכתים או צביעת phosphatase אלקליין.
  2. התמיינות של תאים O9-1 לתוך chondrocytes
    1. כדי להכין chondrocyte בידול מדיה, לדלל את הפעולות הבאות באלפא-מ (ריכוזים הסופי מסומנים): סרום עגל העוברי 5% (FCS), 1% אינסולין-transferrin-סלניום (ITS), 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל, צורה של ng/mL 10 גורם הגדילה בטא (TGF-b3), 50 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורבית, 10 ננוגרם למ"ל BMP2, דקסמתזון 0.1 מ"מ ו 1 מ"מ נתרן פירובט.
    2. התרבות הראשונה טפט של O9-1 תאים עם מדיה osteogenic במשך 3 ימים ואז trypsinize, תרבות כתבנית micromass בתקשורת בידול chondrocyte עבור 7 ימים נוספים.
    3. ישבנים בידול chondrogenic עם Alcian כחול להכתים או סמנים של chondrocytes.
  3. התמיינות של תאים O9-1 לתאי שריר חלק
    1. כדי להכין מדיה בידול תאי שריר חלק, לדלל את הפעולות הבאות ב- DMEM (ריכוז סופי מסומנים): 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg 100/mL ו- 10% FBS.
    2. ישבנים שריר חלק תאית התמיינות עם immunofluorescence מכתים באמצעות נוגדנים נגד סמנים של תאי שריר חלק, כגון שריר חלק אקטין (SMA), כמוצג בדוגמה באיור5.
  4. התמיינות של תאים O9-1 לתוך תאי גליה
    1. כדי להכין תא גליה הבידול מדיה, לדלל את הפעולות הבאות לפי DMEM/F12 (ריכוזים הסופי מסומנים): 1 x B-27 תוספת, 2 מ מגלוטמין, 50 ננוגרם למ"ל BMP2, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל, 50 ננוגרם למ"ל LIF ו 1% חום-לא פעיל FBS.
    2. הערכת תא גליה הבידול על-ידי ביצוע immunofluorescence מכתים עם נוגדנים נגד תא גליה סמנים כגון חומצת שומן מחייב חלבון 7 (FABP7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה של הניסויים שלנו תמונות ציפורים, נוקאאוט היה לחקור את ההשפעות של הפה , טאז אובדן-של-פונקציה בתאים O9-1. לפני הניסויים תמונות ציפורים, הסתרה, אנחנו חייבים לוודא המכינות עבור מדיה הבזליים ותאים תרבות O9-1 כפי שתואר לעיל (לדוגמה, קרום המרתף לצרכים במטריקס כדי לכסות את כל הצלחת, כפי שמוצג באיור 1ו O9-1 תאים התאושש מחנקן נוזלי, כפי שמוצג באיור 2). ביצענו ניסויים תמונות ציפורים כמתואר לעיל בו הפה , טאז בו-זמנית שהפילו. כמויות שוות של הפה siRNA טאז siRNA נוספו אמצעי האחסון הסופי המומלץ על ידי היצרן. על הלוח בקרה, אמצעי אחסון שווה של nontargeting siRNA נוספה.

הפה-null O9-1 תאים בטור נוצר על-ידי מחיקת אקסון 3 של הפה באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9, כפי שתואר על ידי וואנג. et al. 20. אנחנו ביצע ניסויים הסתרה באמצעות CRISPR-Cas9 הגנום עריכה כמתואר לעיל, וואנג. et al. 20. השתמשנו רצפי sgRNA הבאים, ובו אקסון 3 של הפה: יונקות-caccgtggattacgtgggtatgtt-3′ (sgRNA1-קדימה), יונקות-aaacaacatacccacgtaatccac-3′ (sgRNA1-אחורי), יונקות-caccgagatggtctaatgtagtga-3′ (sgRNA2-קדימה), טוני - aaactcactacattagaccatctc-3′ (sgRNA2-אחורי)

CACC נוספה סטרנד קדימה, AAAC נוספה סטרנד הפוכה. G נוסף בקצה 5' של סטרנד קדימה כי oligo לא להתחיל עם G, ו- C נוספו 3' סוף סטרנד הפוכה. במהלך הגנום CRISPR-Cas9 עריכת השלבים המתוארים לעיל, וואנג. et al. 20, היו תאים ממוזגים הבזליים מדיה עבור תאים O9-1 בתוספת עם LIF bFGF כדי להימנע בידול לא רצויים. תחל הבאה ה-PCR שימשו לזיהוי המחיקה הפה : יונקות-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3′ (קדימה), יונקות-GGCCATCATAGATCCTGGACG-3′ (הפוכה). המיקום של sgRNAs הוא מן הבסיס #7973399 ל #7974433 על העכבר כרומוזום 9. המיקום פריימר PCR על כרומוזום ה הוא מ #7973306 הבסיס ל #7974478. לאחר PCR, הלהקה PCR על נוקאאוט הפה עם אקסון 3 נמחק הופיע בתור להקה 138-bp-ג'ל agarose; פראי-סוג הפה הופיע בתור להקת 1173-bp. היעילות של הפה הסתרה באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9 אומתה עם סופג המערבי, כפי שמוצג באיור3.

כמתואר לעיל, תאים O9-1 יכול להיות מחונן בתקשורת ספציפי בתדר בידול כדי לקדם את הבידול לסוגים לתא מסוים הערכה של בידול יכול להיעשות על-ידי שימוש בגישות שונות, כגון PCR כמותי או immunostaining של תאים מסוים סמנים. בתור דוגמה,, מציגה איור 4 תאים O9-1 היו בתרבית בתקשורת בתדר אוסטאובלסט, הבדיל לתוך תאי העצם, אשר הוערכו על ידי תאים immunostaining עם הנוגדן נגד אוסטאוקלצין (Ocn, סמן אוסטאובלסט). בשילוב עם גנים, נוקאאוט הניסויים תוארו לעיל, O9-1 תאים בהרחבה ניתן תמורת ג'ין פונקציה מחקרים וניתוחים פנוטיפי. לדוגמה, שני פראי-סוג של הפה-null O9-1 תאים היו בתרבית בתקשורת התמיינות תאי שריר חלק, מוערך על ידי תאים immunostaining עם הנוגדן כנגד שריר חלק אקטין (SMA, סמן תא שריר חלק). רוב התאים O9-1 פראי-סוג שהולידו לתאי השריר החלק SMA-חיוביות (איור 5A), ואילו, הפה-null תאים O9-1 נכשלה להבדיל לתוך תאי שריר חלק SMA-חיוביות (איור 5B), אשר ציין כי הפה משחק במצב גורלי תפקיד הבידול של NCCs לתוך תאי השריר החלק.

Figure 1
איור 1: Matrigel כיסוי מלא צלחת 35 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: O9-1 תאים 24 שעות לאחר התאוששות חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תספיג הנתונים מציג את נוקאאוט יעיל (ko) של הפה בתאים O9-1 באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9. wt: פראי-סוג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Immunofluorescence מכתים של סמן אוסטאובלסט אוסטאוקלצין (Ocn) המציין כי תאים O9-1 שהולידו לתאים אוסטאובלסט בתנאים בידול osteogenic. התאים היו מוכתמים אוסטאובלסט סמן Ocn נוגדנים (ירוק), גרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). חיצים מציינים תאים Ocn-חיוביות. אוסטאוקלצין (Ocn, סמן אוסטאובלסט); דאפי (′, 6-diamidino-2-phenylindole). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. Immunofluorescence מכתים של שריר חלק אקטין (SMA) המציין כי בתנאים התמיינות תאי שריר חלק, רוב התאים O9-1 פראי-סוג הולידה תאי שריר חלק (A), ואילו הפה-null תאים O9-1 נכשלה להבדיל לתאי השריר החלק (B). התאים היו מוכתמים SMA נוגדנים (אדום), גרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). חיצים מציינים תאים SMA-חיוביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NCC הוא תורם רב-תכליתי, מפתח ברקמות שונות ואיברים במהלך מורפוגנזה עובריים. שורת התאים O9-1 שומרת את הפוטנציאל להתמיין סוגי תאים שונים רבים ולאחר מחקה ויוו מאפייני NCCs, שהופך אותו כלי שימושי במבחנה ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה מולקולרית ב- NCCs. המצב שונה של O9-1 תאים עשויים להתאים הרכס העצבי שונים רומא ויוו, בהתאם לתנאי התרבות של תאים O9-1. תאים O9-1 יכול להישמר במדינה multipotent כאשר תרבותי בתנאים שאינם מבדילים תרבות, דומה לתרבות תאי גזע רגילים. התאים O9-1 שאינם מבדילים יתאימו ל pre-migratory, נודדים multipotent גזע דמוי NCCs ויוו. יתר על כן, O9-1 תאים יכולים להתמיין סוגי תאים שונים רבים בתנאים תרבות בידול מסוים, וזה יתרון חשוב ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה במהלך הבידול של NCCs של גזע multipotent תאים לתוך סוג תא הבדיל מסוים. התאים O9-1 המבדילים יתאימו ל post-migratory הרכס העצבי רומא ויוו, אשר יש גורל תא שונים כדי להתמיין סוגי תאים שונים. בהתאם העניין המחקרי, תאים O9-1 יכול להיות מניפולציות ותרבותית אחרת כדי המשלים ויוו NCC מחקרים במודלים בבעלי חיים.

ישנן דרכים שונות לטפל O9-1 תאים ללמוד NCC אירועים, כולל גנים אובדן-של-פונקציה ופונקציה רווח-של. . הנה, דוגמאות מוצגים ב siRNA איזה נוקאאוט וג'ין CRISPR-Cas 9 עריכת הניסויים בוצעו בתאים O9-1 עבור היפו מסלול אפקטור אובדן-של-תפקוד לימודי הפה 20. עם שימוש משולב דגם העכבר ותאים O9-1, המחקר שלנו ציינו כי הפה שמשחק תפקיד בוויסות NCC התפשטות, בידול לתוך שריר חלק תאים20. מחקרים אחרים במודלים שונים הראו גם שתפקיד חשוב עבור הפה ב- NCCs. הפה הוצגה להיות נדרש עבור העכבר הרכס העצבי שריר חלק בידול31 וכדי לשפר את האדם NCC גורל והעברה32. יתר על כן, הפה מבוטא במהלך התפתחות מוקדמת של צפרדע רפואית 33. היעילות של גנים, נוקאאוט בתאים O9-1, בשילוב עם הנוחות של ביצוע טכניקות מולקולריות במורד הזרם אחרים כגון ה-PCR כמותי (qPCR) במערב סופג, immunostaining תומך כי הקו תא O9-1 הוא מעולה מודל NCC שניתן בקלות מניפולציה במבחנה. בנוסף המחקרים אובדן-של-פונקציה שתיארנו לעיל, בעבר20, ממגוון יישומים אחרים של תאים O9-1 היה מתואר לומד NCCs. O9-1 תאים יכולים לשמש כאלטרנטיבה יעילה לניסויים הדורשים כמות יחסית גדולה של רקמות, כגון immunoprecipitation כרומטין רצף (צ'יפ-seq). אולם, אין ויוו תא אירועים רבים כגון הגירה NCC להסתמך על לאינטרקציות מורכבות רקמות-כדי-רקמות, אז עדיין לא ברור כמה טוב O9-1 תאים שיכולים לחקות במדויק ויוו NCC ההעברה. בגלל המגבלות של מחקרים במבחנה עם תאים O9-1, מומלץ כדי לאמת את תצפיותיו עם O9-1 תאים ויוו באמצעות מודלים בעלי חיים.

כאשר באמצעות שורת תאים O9-1 ללמוד NCCs במבחנה, שמירה על multipotency של התאים במהלך תרבות שגרתית היא קריטית. Multipotency של תאים O9-1 יכול להיבדק בתחילת תרבות המעריכה את הביטוי של גנים סמן NCC כגון AP-2a ו- Sox9. באופן דומה, יכולת התמיינות של תאים O9-1 יכול להיבדק על-ידי המבדילים אותם לתוך סוגי תאים ספציפיים. כדי למנוע הבחנה לא רצויות במהלך culturing שגרתית של תאים O9-1, ההליכים ניסיוני צריך להתבצע בצורה עקבית עם פרוטוקול הוקמה המתוארים כאן. הכנה זהירה של המדיה הבזליים ממוזגים ותוספת טריים של ריכוז הנכון LIF ו- bFGF הם קריטיים לשמירה על multipotency של תאים O9-1. בנוסף, ציר הזמן ניסיוני. צריך לתכנן בקפידה, בהתחשב בכך culturing O9-1 תאים דורש הכנת מזין לא פעיל STO תאים ואיסוף ממוזגים מדיה הבזליים, מה שטוב רק כחודש קודם. מחקרים קודמים הראו המרתף ממברנה מטריקס חשוב לשמירה על הבידול פוטנציאלי של שריר ותאים קודמן עצבית, כמו גם mesenchymal גזע תאים34,35,36. בהקשר של הפרוטוקול המתואר כאן, קרום המרתף מטריקס מספק פלטפורמה עבור תאים O9-1 לצרף ומסייע לשמור על בידול פוטנציאליים. לכן, קרום המרתף מטריקס היא גורם חשוב שעשויים להשפיע על תוצאות הניסוי ועקביות שלהם כאשר חוזר על עצמו. אנו ממליצים על הכנת מטריצה קרום המרתף אך ורק לפי הפרוטוקול המתואר לעיל והימנעות מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה המטריקס קרום המרתף. בנוסף, בעת התאוששות התאים O9-1 המדינה קפוא לתרבות, התהליך של העברת תאי של חנקן נוזלי באמבט מים 37 ° C צריך להיעשות במהירות, הימנעות מכל vortexing במהלך התהליך כולו. בנוסף, גם יתר של תאים O9-1 צריך להימנע כדי לשמר את multipotency של תאים O9-1. כאשר passaging תאים O9-1, ודא כי ריכוז טריפסין הוא מדולל 0.05% במקום 0.25% תאים מופיעים כראוי חלופה מועדפת. שוב ושוב pipetting בעדינות כדי להשיג השעיה תא בודד הוא הכרחי עבור הימנעות היווצרות של תאים צבורים. באופן כללי, כל התהליך של טיפול הקו תא O9-1 צריך להיעשות בעדינות ובזהירות.

לסיכום, שורת התאים O9-1 הוא כלי מאוד שימושי עבור הלומדים NCCs במבחנה, במיוחד בעת שימוש כמו שיטה משלימה ויוו מחקרים של תאים NCCs. O9-1 יש יתרונות ברורים כגון הקלות אשר להם ניתן לגשת וקלות עם אילו תאים מספקת ניתן לקבל מספרים לניסויים. לאור היכולות התמיינות של תאים O9-1, יש להם פוטנציאל גדול לשימוש במגוון רחב של יישומים בתחומים שונים של מחקר. תאים O9-1 יכול לשמש בנוחות עבור יישומים כגון סמים מהירה בדיקות וסינון, צ'יפ-seq, כרומטין transposase נגיש עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) ורצף RNA (RNA-Seq), ג'ין רווח-של-פונקציה ופונקציה אובדן- מחקרים, וכן מחקרים תקנה איתות. השימוש של פרוטוקול מתוקננת ושלמה לטיפול של תאים O9-1 יקל את הפארמצבטית של מחקרים שבהם הם משמשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ניקול Stancel, Ph.d., ELS, הפרסומים המדעיים במכון הלב טקסס, סיפק תמיכה העריכה. אנו מודים גם את מקורות המימון הבאים: מענק פיתוח של מדען מרכז של איגוד הלב האמריקני הלאומי (14SDG19840000 כדי ג'יי וואנג), לורנס 2014 מחקר פרס Rolanette, Berdon לורנס עצם המחלה תוכנית טקסס (כדי ג'יי וואנג ), ולא את המכונים הלאומיים לבריאות (DE026561 ו- DE025873 ג'יי Wang, DE016320, DE019650 ל ר מקסון).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Tags

גנטיקה סוגיה 140 CRISPR Cas9 O9-1 תאים נוקאאוט גנטי תאי הרכס העצבי תמונות ציפורים ג'ין

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter