Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 är en multipotenta mus neural crest cellinje. Här beskriver vi detaljerade stegvisa protokoll för odling O9-1 celler, differentiera O9-1 celler till specifika celltyper och genetiskt manipulera O9-1 celler med siRNA-medierad knockdown eller CRISPR-Cas9 gen editering.

Abstract

Neural crest celler (penningförfalskning) migrerar multipotenta stamceller som kan differentieras till olika celltyper och ge upphov till flera vävnader och organ. O9-1 cell linjen härstammar från den endogena mus embryonala penningförfalskning och underhåller dess multipotency. Dock viss kultur villkor, O9-1 celler kan differentieras till olika celltyper och utnyttjas i ett stort antal forskningsansökningar. Nyligen, med en kombination av mus studier och O9-1 cell, vi har visat att flodhästen signalering utbildningsavsnitt effektorer Yap och Taz spelar viktiga roller i neural crest-derived kraniofaciala utveckling. Även om culturing processen för O9-1 celler är mer komplicerad än den som används för andra cellinjer, är O9-1 cell linjen en kraftfull modell för att utreda NCCs in vitro. Här presenterar vi ett protokoll för odling raden O9-1 cell för att bibehålla dess stemness, samt protokoll för att skilja O9-1 celler till olika celltyper, såsom glatta muskelceller och osteoblaster. Dessutom beskrivs protokoll för att utföra gen förlust-av-funktion studier i O9-1 celler med hjälp av CRISPR-Cas9 radering och små störande RNA-medierad knockdown.

Introduction

Neural crest celler (penningförfalskning) är multipotenta stamceller-liknande celler med en anmärkningsvärd flyttande förmåga och övergående existens under fosterutvecklingen. NCCs härstammar mellan det ytan ektodermet och neuralrörsdefekter och migrera till andra delar av embryot under embryonal utveckling1. Baserat på deras funktionella domäner, kan penningförfalskning delas in i flera olika typer, inklusive kraniala, stam, vagala, sakrala, och hjärt NCCs. Dessutom kan NCCs differentieras till flera cell härstamningar, såsom glatta muskelceller, benceller och nervceller, och ge upphov till olika vävnader2,3. Utvecklingen av NCCs kännetecknas av en komplex serie av morphogenetic händelser som är finjusteras av olika molekylära signaler. Med tanke på den komplexa regleringen av penningförfalskning och deras viktiga bidrag till många strukturer, kan dysreglering av NCC utveckling ofta leda till medfödda missbildningar, som står för nästan 30% av alla människans medfödda missbildningar. Avvikelser under neural crest utvecklingen kan leda till kluven läpp/gomspalt, bristfällig näsa bildandet, syndrom, defekter såsom en defekt hjärt utflöde tarmkanalen, eller ens Begynna dödlighet1,4,5, 6 , 7. förstå de molekylära mekanismerna av NCC utveckling är viktigt för att utveckla behandlingar för sjukdomar som orsakas av defekter i NCC utveckling. Med användning av olika in vitro- och in-vivo närmar sig8,9,10,11,12,13,14 ,15, betydande framsteg har gjorts i NCC forskning. In vivo, djurmodeller, inklusive kycklingar, amfibier, zebrafiskar och möss, har använts för att undersöka NCCs1. Mänskliga embryon har dessutom använts för att studera processen för NCC migration i tidiga mänskliga embryots utveckling16. In vitro, cellmodeller för NCCs, såsom mänskliga NCCs som härstammar från patientens underhudsfett, har använts för att undersöka Parkinsons sjukdom17. O9-1 NCC linjen, som ursprungligen härrör från massa kulturer av endogena NCCs isolerade från E8.5 mus embryon18, är en kraftfull cell modell för att studera NCCs. allt villkor icke-göra åtskillnad mellan kultur, O9-1 celler multipotenta stamceller-liknande NCCs. Dock varierande kultur villkor, kan O9-1 celler differentieras till framstående celltyper, såsom glatta muskelceller, osteoblaster, kondrocyter och gliaceller18. Med tanke på dessa egenskaper, har O9-1 celler i huvudsak använts för NCC-relaterade studier, som undersöker den molekylära mekanismen av kraniala-ansiktsbehandling defekter19,20.

Här, detaljerade protokoll tillhandahålls för att upprätthålla O9-1 celler, differentiera O9-1 celler till olika celltyper och manipulera O9-1 celler genom att utföra gen förlust-av-funktion studier med CRISPR-Cas9 gen editering och små störande RNA (siRNA)- medierad knockdown teknik. Som ett typexempel beskrivs användningen av O9-1 celler att studera Yap och Taz förlust-av-funktion. YAP och Taz är de nedströms effektorer av flodhästen signalering utbildningsavsnitt, som spelar en avgörande roll i cellproliferation, differentiering och apoptos. Hippo vägen har också visat sig vara viktigt i utvecklingen och homeostas av flera olika vävnader och organ, liksom i patogenesen av olika sjukdomar20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Kärnkomponenterna i Hippo signalering inkluderar de tumör suppressor steril 20-liknande kinaser Mst1/2, WW domän-innehållande Salvador byggnadsställning protein och de stora tumör suppressor homolog (Lats1/2) kinaser. Hippo signalering hämmar Yap och Taz aktivitet och främjar deras nedbrytning i cytoplasman. Utan förtryck från Hippo, kan Yap och Taz translocate till atomkärnor och fungera som transkriptionell aktivatorer. Vi visade nyligen att specifikt inactivating flodhästen signalering effektorer Yap och Taz i musen NCCs med hjälp av den Wnt1cre och Wnt1Cre2SOR drivrutiner resulterade i embryonal dödlighet på E10.5 med svår kraniofaciala defekter20. Vi har även utfört studier använder O9-1 celler för att undersöka Yap och Taz i NCCs roll. För att studera Yap och Taz funktion i NCC proliferation och differentiering, Yap och Taz knockdown celler genererades i O9-1 celler med hjälp av siRNA och Yap knockout celler genererades med hjälp av CRISPR-Cas9 gen editering. Samma gen förlust-av-funktion strategier kan tillämpas på olika målgener i andra vägar. Gain-of-function studier och transfection analyser kan dessutom också tillämpas på O9-1 celler att studera geners funktion och reglering. De protokoll som beskrivs här är avsedda att användas av utredare som guider för odling O9-1 celler för att upprätthålla multipotenta stemness, för att skilja O9-1 celler till andra celltyper under olika odlingsbetingelser och för att studera geners funktion och molekylära mekanismer för NCCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning innan O9-1-cellkultur

Obs: Basal media som används för O9-1 cellkultur måste har betingats av Sandos inavlade möss tioguanin/ouabain-resistenta (STO) mus fibroblast celler; STO celler behöver därför erhållas och bereds enligt anvisningarna nedan innan du börjar O9-1 cellkultur.

  1. Aktiva STO cellkultur
    1. Förbereda media för odling aktiva STO celler genom att göra komplett Dulbeccos modifierade örnens media (DMEM) med 7% fetalt bovint serum (FBS) (embryonala stamceller kultur grad), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 2 mM L-glutamin (slutliga koncentrationer anges).
      Obs: STO medium används för odling av aktiva STO feeder celler. Penicillin, streptomycin och L-glutamin kan bilda nederbörd i lager. Lös fullständigt genom pipettering före användning.
    2. Coat en standard 100 mm cell kultur plattan med 0,1% gelatin i 30 min i rumstemperatur. Efter inkubationstiden aspirera extra gelatin. Använda plattan omedelbart efter beläggning.
      Obs: Alternativt täcka plattan med STO media och lämna plattan i en fuktad inkubator att undvika torkning av plattan (detta är tänkt endast för kortsiktig lagring och inte för att lagra silicagel plattor).
    3. Tina de STO cellerna snabbt i 37 ° C vattenbad; torka cryovial med 70% etanol innan öppningen, och omedelbart överföra hela injektionsflaskan med celler till ett centrifugrör.
    4. Lägga till STO media droppvis i centrifugröret; förhållandet av volymen av celler, som media är 1:10.
    5. Centrifugera cellerna vid 180 x g i 3 min vid RT.
    6. Blanda genom skonsam pipettering och överföring celler till gelatin-belagd plattan.
    7. Tillåta STO celler att växa för 24 h i en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    8. Ändra mediet (endast efter cellerna följa) 24 h efter sådd och kassera det gamla mediet.
    9. Kontrollera STO celler varje dag under ett mikroskop och passagen på 80% konfluens.
      1. Innan du börjar STO cell passaging, coat plattor med 0,1% gelatin (gelatin volym motsvarar hälften av tillväxten mediavolymen fartyget) under 30 minuter vid rumstemperatur.
      2. För att passage STO celler, aspirera tillväxt medier och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger (Lägg till PBS i en lika stor volym av Tillväxtmassmedia).
      3. Aspirera PBS och lägga till 0,25% trypsin-EDTA (justera volymen beroende på fartygets storlek); sedan, inkubera vid 37 ° C i 5 min.
        Obs: För en 100 mm platta, använda 10 mL av tillväxtmassmedia och 3 mL trypsin lösning. För en 150 mm plåt, Använd 20 mL av tillväxtmassmedia och 8 mL av trypsin lösning. Volymen av tvättbuffert som används är lika med volymen av tillväxtmassmedia.
      4. Inaktivera trypsin med en lika stor volym av STO media. Utsäde STO celler till nya plattor med förhållandet mellan 1:3 till 1:10.
        Obs: Ett gemensamt växande system är att utöka från en cryovial till en 100 mm platta, sedan till en 150 mm platta, sedan till fyra 150 mm plattor, och slutligen till 16 150 mm plattor.
  2. Inaktivering och frysning av STO celler
    1. För att förbereda 2 x frysning media, Lägg till följande STO media (slutliga koncentrationer anges): 20% FBS, 20% dimetyl sulfoxid (DMSO).
    2. Efter blandning, filtret sterilisera 2 x frysning media (por storlek 0,22 µm) och lagra den på 4 ° C fram till användning. Gör 2 x frysning media samma dag som använder och Kassera oanvänd frysning media.
    3. Bered mitomycin C i PBS med en koncentration på 0,5 mg/mL. För att upplösa mitomycin C i PBS, tejpa flaskan på en vortexer och vortex på en låg inställning för ca 45 min för att upplösa partiklarna helt.
      Obs: Mitomycin C är ljus känsliga och svåra att upplösa.
      Försiktighet: Mitomycin C är akut giftiga och kan orsaka cancer. Hantera endast med lämplig personlig skyddsutrustning.
    4. Inaktivera STO celler genom att lägga till en slutlig koncentration på 0,01 mg/mL mitomycin C till befintliga media. Inkubera i 2 h inuti en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    5. Tvätta plattorna (150 mm) med 20 mL PBS två gånger efter inaktivering med mitomycin C.
    6. Aspirera PBS lösningen, separera celler med hjälp av 8 mL av 0,25% trypsin-EDTA och inkubera i 5 min inuti en standard befuktade inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inaktivera trypsin med 8 mL STO media.
    8. Överföra den cell lösningen till ett centrifugrör. Kombinera flera plattan i ett centrifugrör att spara tid. Centrifugera under 5 minuter vid 180 x g.
    9. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 mL PBS.
    10. Använd 10 µL av den cell lösningen för att räkna celler genom att använda en hemocytometer. Räkna celler i det centrala inrutade torget och multiplicera antalet erhålls genom 104 att bestämma antalet celler per 1 mL. Räkna två gånger och i genomsnitt två nummer för att få den slutliga uppskattningen av antalet celler per milliliter.
    11. Centrifugera celler för 5 min på 180 x g.
    12. Aspirera PBS och Lägg till 1:1 (i volym) STO media och 2 x frysning media cellpelleten. Justera volymen för en sista cell koncentration på 4 x 106 cell/mL (detta belopp är bra för en 100 mm platta).
      Obs: till exempel från fyra 150-mm plattor ger totalt 60 x 106 celler, frysa 4 x 106 celler per cryovial, med varje cryovial innehållande 1 mL cell lösning. Fyra plattor ger cirka 15 cryovials (60/4 = 15). Tillsätt 7,5 mL STO media och 7,5 mL 2 x frysning media till cellpelleten, Omsuspendera och delprov 1 mL i varje cryovial.
    13. Återsuspendera av långsamt pipettering frysning media med cellpelleten. Överför 1 mL av cell lösning till varje cryovial och etikett med detta.
    14. Placera cryovials inuti en lockförsedd polystyren låda (detta ger en långsam kylning hastighet, vilket förbättrar cellöverlevnad). Överföra rutan till-80 ° C frys under minst 24 h innan du överför cryovial till flytande kväve.
      Obs: För bästa resultat, minimera cellen räknar tid, liksom tiden mellan att lägga till 2 x frysning media celler och överföra injektionsflaskor till-80 ° C.

2. O9-1-cellkultur

  1. Förbered basala för O9-1 cellkultur genom att lägga till följande i DMEM (slutliga koncentrationer anges): 15% FBS, 0,1 mM minsta nödvändiga media (MEM) onödiga aminosyror, 1 mM natrium pyruvat, 55 mM beta-merkaptoetanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamin, 103 enheter/mL leukemi hämmande faktor (LIF; till omedelbart före användning, Lägg inte lager flaska), och 25 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor-basic (bFGF; till omedelbart före användning, Lägg inte lager flaska).
  2. Filter sterilisera basala media (por storlek 0,22 µm) och Linda in i folie att skydda mot ljus.
  3. Samla luftkonditionerade basala media från inaktiverade STO celler.
    Obs: Fortsätt bara efter att ha inaktiverat STO celler. O9-1 basala media samlas in från STO cell plåtar är hädanefter luftkonditionerade basala media.
    1. Blidvädret inaktiverat STO celler snabbt som beskrivs ovan (en cryovial som innehåller 4 x 106 celler är bra för en 100 mm platta och ger cirka 100 mL luftkonditionerade basala media efter 10 dagar av samling). Utsäde inaktiverat STO celler till gelatin-belagd plattan med hjälp av STO media. Tillåta celler att fästa över natten i en standard befuktade inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 h efter upptining STO celler, ignorera befintliga STO media och ersätta med basala media.
      Obs: Lägg inte till LIF och bFGF inaktiverade STO cell kultur rätter; bara lägga till O9-1 cell kultur rätter.
    3. Varje 24 h, ändra media med hjälp av O9-1 basala media och samla basala media från STO cell plåtar i en flaska. Wrap flaskan som innehåller betingade basala media i folie för att skydda mot ljus. Förvara alla insamlade materialet vid 4 ° C.
      Obs: Eftersom cellerna var inaktiverat, de kan inte visas så friska som de gjorde efter flera dagar av samling; Detta förväntas kan.
    4. Eventuellt för att kontrollera kontaminering, samla basala media för varje samling dag i olika rör (istället för en flaska) insvept i folie. Använda en 24-well platta, placera 1 mL media från varje dag i varje brunn och inkubera över natten i en standard inkubator att kontrollera för bakteriell kontamination under mikroskopet.
      Obs: Medierna förblir en röd färg om det finns ingen förorening utom ändringar av gul om bakteriell kontaminering är närvarande.
    5. Efter att samla luftkonditionerade basala media för 10 dagar, kassera STO cellerna. Kombinera (i tillämpliga fall) samlas alla villkorliga basala media och filter sterilisera (por storlek 0,22 µm) i en steril flaska. Linda in flaskan i folie för att skydda mot ljus. Hålla de filtrerade luftkonditionerade basala media vid 4 ° C i högst en månad från filtret.

3. upprätthålla O9-1 celler

Obs: Fungerar O9-1 basala media är filtret steriliseras luftkonditionerade basala media, till vilken LIF (slutlig koncentration 103 enheter/mL) och bFGF (slutlig koncentration 25 ng/mL) tillsätts omedelbart cell kultur skålen före användning. Detta media behöver skyddas från ljus och lagras vid 4 ° C.

  1. Återvinning av O9-1 celler
    1. Långsamt Tina basalmembranet matrisen (t.ex., Matrigel) lager flaska över natten vid 4 ° C att förbereda alikvoter.
    2. Tillsätt 5 mL DMEM med 10% FBS till 5 mL av lager basalmembranet matrix membranet. Blanda väl genom pipettering med kall pipettspetsar förvaras vid-20 ° C. Hålla det ursprungliga flaska och alikvot rören på isen. Frysa alikvoter i olika volymer (0,5 mL eller 1 mL portioner) beroende på experiment behoven. Undvika frysa-upptining basalmembranet matrix flera gånger.
      Obs: basalmembranet matrix polymerizes snabbt i rumstemperatur; Använd kallt pipettspetsar och hålla rören kalla när du arbetar för att undvika oavsiktlig polymerisation.
    3. Tina en alikvot av basalmembranet matrisen vid 4 ° C eller på is 2 h innan experimentet. Förvara inte matrisen vid 4 ° C under en längre tid.
    4. Använda filter-steriliseras DMEM med 10% FBS att späda basalmembranet matrisen till en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL att bestryka plattorna. Coat plattor med matrisen basalmembranet (0,5 mg/mL) vid rumstemperatur för 1 h. se till att den helt täcker plattan (som visas i figur 1).
    5. Luta plattan när aspirera basalmembranet matrisen för att undvika att vidröra den belagda ytan; torka plattorna vid 37 ° C i 30 min. Torka inte över plattorna.
      Obs: Gå vidare endast när alla medier och reagenser är redo att använda (luftkonditionerade basala media, steril-filtrerad 10% FBS i DMEM, LIF och bFGF).
    6. Återställa O9-1 celler snabbt genom att placera cryovial i 37 ° C vattenbad; sakta snurra injektionsflaskan tills lösningen helt vänder sig till vätska och omedelbart gå vidare till nästa steg.
    7. Överföra all cell lösning från cryovial (ungefär 1 mL) till en 15 mL centrifugrör. Lägg till 5 volymer av DMEM med 10% FBS (filter steriliseras med ett filter porstorlek på 0,22 µm) och resuspendera.
    8. Centrifugera under 3 minuter vid 180 x g. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten (genom att trycka på) i konditionerat basala media kompletteras med LIF och bFGF. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
      Obs: Luftkonditionerade basala media kompletteras med LIF och bFGF är avgörande för att upprätthålla multipotency av raden O9-1 cell. Var försiktig att lägga till rätt media för att undvika oavsiktlig celldifferentiering.
    9. Utsäde celler från 10.000 till 15.000 cell/cm2 till en 6-bra platta. Tillåta celler att fästa och växa i en vanlig cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) över natten innan byte av media.
    10. Se till att cellerna är anslutna innan du fortsätter att ändra media (friska bifogade celler ser ut som de som visas i figur 2).
    11. Alltid ändra kultur media nästa dag efter återvinning av O9-1 celler (Använd luftkonditionerade basala media kompletteras med LIF och bFGF).
  2. Passage av O9-1 celler
    1. När O9-1 celler når 80% konfluens, Tina matrisen basalmembranet och förbereda en basalmembranet matrix-belagd plåt som beskrivs ovan. Lägg till luftkonditionerade basala media kompletteras med LIF och bFGF till fartyget. Alternativt, lägga till DMEM utan FBS att förvara basalmembranet matrisen från torkning och släpper en standard befuktade inkubator för mer än 3 dagar.
    2. Skölj O9-1-innehållande brunnarna (6-well platta) med 2 mL Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) två gånger och Pipettera försiktigt för att undvika att förlora celler.
    3. Separera celler med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C i 3 min. neutralisera trypsin med en lika stor mängd DMEM med 10% FBS. Upprepade gånger Pipettera vätskan över hela ytan av brunnen för att separera så många celler från plattan som möjligt.
      Obs: Trypsin koncentration är 0,05% istället för 0,25%. Använd DPBS för att späda ut från flaskan med lager.
    4. Undvik att skapa bubblor när separera celler från plattan.
    5. Överföra alla cell lösning till ett centrifugrör och Centrifugera under 3 minuter vid 180 x g. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten i centrifugröret av mild pipettering i konditionerat basala media kompletteras med LIF och bFGF.
    6. Använda en hemocytometer att räkna den totala mobilnummer enligt beskrivningen ovan. Utsäde celler (10 000 till 15 000 celler/cm2) på bestruket plattan som beretts enligt anvisningarna i steg 3.1.4 till 3.1.8. En väl 6-well platta skulle kräva 100 000 celler till utsäde.
    7. Tillåta celler att fästa och växa i en vanlig cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Alltid ändra kultur media nästa dag efter passaging O9-1 celler.
  3. Frysning av O9-1 celler
    1. För att förbereda 2 x frysning media för O9-1 celler, späd följande i DMEM (slutliga koncentrationer anges): 40% FBS och 20% DMSO.
    2. Filter sterilisera 2 x frysning media och hålla det vid 4 ° C. 2 x frysning media måste göras samma dag som det används. Kassera alla oanvända frysning media.
      Obs: Frysa O9-1 celler på 80% konfluens.
    3. Skölj brunnar med DPBS två gånger; pipetten försiktigt för att undvika att förlora celler.
    4. Separera celler med 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C i 3 min och sedan neutralisera trypsin med en lika stor mängd 10% FBS i DMEM. Upprepade gånger Pipettera vätskan över hela ytan av brunnen för att separera så många celler från plattan som möjligt.
    5. Överföra alla plattan innehåll till ett centrifugrör och Centrifugera under 3 minuter vid 180 x g. Aspirera supernatanten och tillsätt 2 mL PBS och resuspendera genom att trycka på.
    6. Använd 10 µL cell lösning för att räkna celler genom att använda en hemocytometer som beskrivs ovan.
    7. Centrifugera cell lösning för 3 min på 180 x g. Aspirera supernatanten och justera mängden basala media behövs; Lägg sedan till en lika stor mängd 2 x frysning media.
      Obs: Celler är frysta vid en koncentration på 1 x 106 celler/mL (1 mL per cryovial).
    8. Överföra celler till cryovials och etikett med detta. Placera cryovials inuti en lockförsedd polystyren låda för en långsam kylningshastigheten vid-80 ° C under minst 24 h innan du överför till flytande kväve.
      Obs: För bästa resultat, minimera cellen räknar tid och tiden mellan att lägga till 2 x frysning media och överföra injektionsflaskor till-80 ° C.

4. manipulering av O9-1 celler

  1. Utför siRNA knockdown i O9-1 celler
    1. Tina och päls en 24-well platta med basalmembranet matrix som beskrivs ovan (steg 3.1.4–3.1.8) innan du börjar experimentet. Återställa och utsäde O9-1 celler, så att de kan växa till 60% och 80% confluency.
    2. Späd liposomer i serumfritt media enligt lämplig väl volym. Späd siRNA i serumfritt media till finalen. Lägga till utspädda siRNA utspädda liposomer i förhållandet som rekommenderas av tillverkaren. Blanda väl genom pipettering och inkubera.
      Obs: Följ tillverkarens guide på volymen används, tid och temperatur för inkubation.
    3. Lägga till en lämplig volym av siRNA-lipid komplexa celler enligt tillverkarens rekommendationer.
    4. Inkubera cellerna för 24 h i en vanlig cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Utföra efterföljande steg som lämpligt (extrahera RNA, extrahera proteiner, färgning, etc.)
      Obs: siRNA knockdown gånger och koncentrationerna kan variera beroende på det enskilda experimentet.
  2. Utföra gen knockout i O9-1 celler med CRISPR-Cas9 gen editering
    Obs: Se tidigare publicerade protokollet för att använda CRISPR-Cas9 i däggdjursceller linjer29. Här är en förenklad beskrivning av CRISPR-Cas9 gen editering och relaterade åtgärder.
    1. Skaffa sgRNA sekvenser med hjälp av ett sgRNA designverktyg.
    2. Ligera sgRNA till pSpCas9 (bb) - 2a - GFP vektor30.
    3. Transfect O9-1 celler med vektorn med hjälp av ett standard lipofection protokoll enligt tillverkarens rekommendationer.
    4. Inkubera cellerna i en vanlig cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 för 24 h.
    5. Utföra fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) baserat på GFP/7-AAD. Utsäde GFP + enstaka celler i plattor med 96 brunnar.
    6. Odla cellerna i inkubatorn ytterligare 4 dagar. Kassera alla brunnar som har mer än en koloni.
    7. Utför PCR med primers som utformats för att upptäcka borttagningen. Efter PCR, kör PCR-produkter på en agarosgel att utvärdera bandstorlek. Validera knockout effektivitet uppnås med hjälp av CRISPR-Cas9 editingby utför Western blotting (ett exempel på Yap knockout resultat visas i figur 3).

5. O9-1 celldifferentiering

  1. Differentiering av O9-1 celler till osteoblaster
    1. För att förbereda osteogent differentiering media, späd följande i alpha-MEM (slutliga koncentrationer anges): 0,1 mM dexametason, 100 ng/mL benmorfogent protein 2 (BMP2), 50 µg/mL askorbinsyra, 10 mM b-glycerofosfat, 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin.
    2. Upptäcka osteoblast markören, osteocalcin, i differentierade osteoblaster genom immunfärgning som visas i figur 4.
      Obs: Osteogent differentiering kan också utvärderas med hjälp av andra markörer av osteoblaster eller med Alizarin röda färgning eller alkaliskt fosfatas färgning.
  2. Differentiering av O9-1 celler till kondrocyter
    1. För att förbereda chondrocyte differentiering media, späd följande i alpha-MEM (slutliga koncentrationer anges): 5% fetalt kalvserum (FCS), 1% insulin-transferrin-selen (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL omvandla tillväxtfaktor beta (TGF-b3), 50 mg/mL askorbinsyra, 10 ng/mL BMP2, dexametason 0,1 mM och 1 mM natrium pyruvat.
    2. Första kultur en enskiktslager av O9-1 celler med osteogent media för 3 dagar sedan trypsinize och kultur som ett micromass format i chondrocyte differentiering media ytterligare 7 dagar.
    3. Åsnor chondrogenic differentiering med Alcian blå färgning eller markörer av kondrocyter.
  3. Differentiering av O9-1 celler i glatta muskelceller
    1. För att förbereda smidig muskel cell differentiering media, späd följande i DMEM (slutliga koncentrationer anges): 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 10% FBS.
    2. Åsnor muskulatur celldifferentiering med immunofluorescens färgning med hjälp av antikroppar mot markörer av glatta muskelceller, till exempel muskulatur aktin (SMA), visas som ett exempel i figur 5.
  4. Differentiering av O9-1 celler in gliaceller
    1. För att förbereda glial cell differentiering media, späd följande i DMEM/F12 (slutliga koncentrationer anges): 1 x B-27 tillägg, 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF och 1% Värmeinaktiverade FBS.
    2. Utvärdera glial celldifferentiering genom att utföra immunofluorescens färgning med antikroppar mot glial cell markörer såsom fettsyra bindande protein 7 (FABP7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med vår knockdown och knockout experiment var att studera effekterna av Yap och Taz förlust-av-funktion i O9-1 celler. Innan knockdown och knockout experimenten måste vi se till att förbereder för basal media och kultur O9-1 celler enligt ovan (exempelvis basalmembranet matrix behov att täcka hela plattan som visas i figur 1och O9-1 celler återhämtat sig från flytande kväve som visas i figur 2). Vi utförde knockdown experiment som beskrivs ovan där Yap och Taz slogs samtidigt ut. Lika mängder Yap siRNA och Taz siRNA lades till den slutliga volymen som rekommenderas av tillverkaren. Till kontrollplattan lades en lika stor volym av nontargeting siRNA.

En Yap-null O9-1 cell fodrar genererades genom att ta bort exon 3 för Yap med hjälp av CRISPR/Cas9 gen editering, som beskrivs av Wang et al. 20. vi utförde knockout experiment med hjälp av CRISPR-Cas9 gen editering som beskrivs ovan och i Wang et al. 20. vi använde den följande sgRNA sekvenser, som flankeras exon 3 för Yap: 5′-caccgtggattacgtgggtatgtt-3 ' (sgRNA1-forward), 5′-aaacaacatacccacgtaatccac-3 ' (sgRNA1-reverse), 5′-caccgagatggtctaatgtagtga-3 ' (sgRNA2-forward), 5′ - aaactcactacattagaccatctc-3′ (sgRNA2-omvänd)

CACC lades till den framåt strand och AAAC lades till omvänd strand. G lades i slutet 5' av den framåt strand eftersom oligo inte börja med G och C lades till 3' ände den omvänd strand. Under CRISPR-Cas9 genomet redigering steg som beskrivs ovan och i Wang et al. 20, celler var i konditionerat basala media för O9-1 celler kompletteras med LIF och bFGF för att undvika oönskade differentiering. Följande PCR primers användes för att upptäcka Yap borttagningen: 5′-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3′ (framåt) och 5′-GGCCATCATAGATCCTGGACG-3′ (bakåt). Positionen för sgRNAs är från bas #7973399 till #7974433 på mus kromosom 9. PCR-primer positionen på kromosomen är från bas #7973306 till #7974478. Efter PCR, PCR-bandet för Yap knockout med exon 3 bort dök upp som ett 138-bp band på en agarosgel; vildtyp Yap framträdde som ett 1173-bp-band. Effektiviteten i Yap knockout med hjälp av CRISPR-Cas9 gen editering validerades med Western blotting, som visas i figur 3.

Som beskrivits ovan, kan O9-1 celler vara odlade i viss differentiering-inducerande medierna att differentiering till speciella celltyper. Utvärdering av differentiering kan göras med hjälp av olika tillvägagångssätt, såsom kvantitativa PCR eller immunfärgning av viss cell markörer. Som exempel, visar figur 4 O9-1 celler som odlade i osteoblast-inducerande media och differentieras efter osteoblaster, som utvärderades genom immunfärgning celler med antikroppen mot osteocalcin (Ocn, en osteoblast markör). Kombinerat med gen knockdown och knockout experiment beskrivs ovan, O9-1 celler i stort sett kan användas för gen funktion studier och fenotypiska analyser. Som ett exempel, både vildtyp och Yap-null O9-1 celler var odlade i smidig muskel cell differentiering media och utvärderas av immunfärgning celler med antikroppen mot glatt muskulatur aktin (SMA, en smidig muskel cell markör). De flesta vildtyp O9-1 celler gav upphov till SMA-positiv glatta muskelceller (figur 5A), medan, Yap-misslyckades med null O9-1 celler differentieras till SMA-positiv glatta muskelceller (figur 5B), som visade att Yap spelar en kritisk roll i differentieringen av NCCs i glatta muskelceller.

Figure 1
Figur 1: Matrigel heltäckande på en 35 mm platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: O9-1 celler 24 h efter återhämtning från flytande kväve. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Western blot data visar den effektiva knockout (ko) för Yap i O9-1 celler med hjälp av CRISPR-Cas9 gen editering. WT: vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: immunofluorescens färgning av osteoblast markör osteocalcin (Ocn) indikerar att O9-1 celler gav upphov till osteoblast celler osteogent differentiering villkor. Cellerna var fläckade osteoblast markör Ocn antikropp (grön) och kärnor var fläckade DAPI (blå). Pilarna anger Ocn-positiva celler. Osteocalcin (Ocn, en osteoblast markör); DAPI (′, 6-diamidin-2-fenylindol). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Immunofluorescens färgning av glatt muskulatur aktin (SMA) som visar att de flesta vildtyp O9-1 celler villkor smidig muskel cell differentiering, gav upphov till glatta muskelceller (A), medan Yap-null O9-1 celler underlåtit att differentieras till glatta muskelceller (B). Cellerna var målat med SMA antikroppar (röd) och kärnor var fläckade DAPI (blå). Pilarna anger SMA-positiva celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NCC är en mångsidig och viktig bidragsgivare till olika vävnader och organ under embryonala morfogenes. O9-1 cell linjen underhåller dess potential att differentieras till många olika celltyper och härmar i vivo egenskaper penningförfalskning, gör det en användbar in vitro- verktyg för att studera geners funktion och molekylär reglering i NCCs. O9-1 celler olika status kan motsvara olika neural crest avkomma i vivo, beroende på kultur av O9-1 celler. O9-1 celler kan bibehållas i tillståndet multipotenta när odlade förhållanden icke-göra åtskillnad mellan kultur, liknande vanliga stamceller kultur. De icke-göra åtskillnad mellan O9-1 cellerna kan motsvara pre-migratory och flyttande multipotenta stamceller-liknande NCCs i vivo. Dessutom kan O9-1 celler differentieras till många olika celltyper specifika differentiering kultur villkor, vilket är en viktig fördel för att studera geners funktion och reglering under differentieringen av NCCs från multipotenta stamceller celler till en särskild differentierad celltyp. De särskiljande O9-1-cellerna kan motsvara post-migratory neural crest avkomma i vivo, som har en annan cell öde differentieras till olika celltyper. Beroende på forskningsintressen, kan O9-1 celler manipuleras och odlade annorlunda komplement i vivo NCC studier med djurmodeller.

Det finns olika sätt att manipulera O9-1 celler för att studera NCC händelser, inklusive gen förlust-av-funktion och gain-of-function. Här, presenteras exempel i vilken siRNA knockdown och CRISPR-Cas 9 gen redigering experiment utfördes i O9-1 celler för Hippo väg effektor Yap förlust-av-function studier20. Med den kombinerade användningen av en musmodell och O9-1 celler visade vår studie att Yap spelar en avgörande roll i regleringen av NCC proliferation och differentiering till glatt muskulatur celler20. Andra studier i olika modeller har också indikerat en viktig roll för Yap i NCCs. Yap visades att krävas för musen neural crest muskulatur differentiering31 och att stärka mänskliga NCC öde och migration32. Vidare uttrycks Yap under tidig Xenopus utveckling33. Effektiviteten i gen knockdown och knockout i O9-1 celler, kombinerat med bekvämligheten av utför andra nedströms molekylära tekniker såsom kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting, och immunfärgning stöder att raden O9-1 cell är en utmärkt NCC-modell som lätt kan manipuleras i vitro. Förutom förlust-av-funktion studierna har vi beskrivit ovan och tidigare20, olika andra tillämpningar av O9-1 celler har beskrivits för studera NCCs. O9-1 celler kan användas som ett effektivt alternativ för experiment som kräver en relativt stor mängd vävnad, såsom kromatin immunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq). Men många i vivo cell händelser såsom NCC migration är beroende av komplex vävnad-till-vävnad interaktioner, så det är fortfarande oklart hur väl O9-1 celler exakt kan efterlikna i vivo NCC migration. På grund av begränsningar av in vitro- studier med O9-1 celler, är det rekommenderat att validera iakttagelser med O9-1 celler i vivo med hjälp av djurmodeller.

När du använder O9-1 cell linjen för att studera är NCCs i vitro, upprätthållande av multipotency celler under rutinmässiga kultur kritisk. Multipotency av O9-1 celler kan testas i början av kulturen genom att utvärdera uttrycket av NCC markörgener såsom AP-2a och Sox9. Likaså kan O9-1 cellernas differentiering förmåga testas genom att differentiera dem till specifika celltyper. För att undvika oönskade differentiering under rutinmässiga odling av O9-1 celler, måste de experimentella procedurerna utföras i överensstämmelse med de etablerade protokollet som beskrivs här. Noggrann förberedelse av konditionerat basala media och färska tillägg av rätta koncentrationerna av LIF och bFGF är kritiska för att upprätthålla multipotency O9-1 celler. Dessutom experimentella tidslinjen måste planeras noga, med tanke på att odla O9-1 celler kräver först förbereda inaktiva feeder STO celler och samla luftkonditionerade basala media, vilket är bra för bara ca en månad. Tidigare studier har visat att källaren membran matrix är viktiga för att upprätthålla differentieringen potentiella muskel och neurala prekursorceller, liksom mesenkymala stamceller celler34,35,36. I samband med av protokollet som beskrivs här, basalmembranet matris ger en plattform för O9-1 celler att fästa och hjälper till att upprätthålla differentiering potentiella. Basalmembranet matris är därför en viktig faktor som kan påverka experimentella resultat och deras samstämmighet när upprepas. Vi rekommenderar att förbereda basalmembranet matrix strikt enligt protokollet beskrivs ovan och undvika flera frysning-tining cykler av matrisen basalmembranet. När du återställer O9-1 celler från fryst tillstånd till kultur, måste processen att flytta cellerna från flytande kväve till 37 ° C vattenbad också ske snabbt, undvika eventuella vortexa under hela processen. Överväxt av O9-1 celler måste dessutom också undvikas för att upprätthålla multipotency O9-1 celler. När passaging O9-1 celler, säkerställa att trypsin koncentrationen späds till 0,05% istället för 0,25% och att celler visas ordentligt separerade. Upprepade gånger pipettering mycket försiktigt är för att uppnå en encellig suspension nödvändigt för att undvika bildandet av aggregerade celler. I allmänhet, måste hela processen för hantering av raden O9-1 cell göras försiktigt och noggrant.

Sammanfattningsvis, O9-1 cell linjen är ett mycket användbart verktyg för att studera NCCs i vitro, särskilt när den används som en metod som komplement till in-vivo studier av NCCs. O9-1 celler har uppenbara fördelar såsom lätthet med vilken de kan nås och lättheten med vilken tillräcklig cell kan nummer erhållas för experiment. Med tanke på differentiering funktionerna i O9-1 celler, har de stor potential för användning i ett brett spektrum av tillämpningar inom olika områden av forskning. O9-1 celler kan användas bekvämt för applikationer såsom snabb drog tester och screening, ChIP-seq, transposase-tillgänglig kromatin med hög genomströmning sekvensering (ATAC-seq) och RNA-sekvensering (RNA-Seq), gen gain-of-function och förlust-av-funktion studier, samt signalering förordning studier. Användning av en standardiserad och fullständig protokoll för hantering av O9-1 celler kommer att underlätta reproducerbarhet av studier där de används.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, vetenskapliga publikationer på Texas hjärtat Institute, gav redaktionellt stöd. Vi tackar också de följande finansieringskällorna: American Heart Associations nationella Center forskare utveckling Grant (14SDG19840000 till J. Wang), Lawrence forskning Litteraturpriset 2014 från Rolanette och Ehlanas Lawrence ben sjukdom Program i Texas (till J. Wang ), och de National institutionerna of Health (DE026561 och DE025873 till J. Wang, DE016320 och DE019650 till R. Maxson).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Tags

Genetik utfärda 140 CRISPR Cas9 O9-1 celler gen knockout gen knockdown neural crest celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter