Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/58347

Summary

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Abstract

Doku hücreleri elektriksel aktivitesinin elektrofizyolojik teknikleri tarafından izlenebilir ama bunlar genellikle tek tek hücreler analiz için sınırlıdır. Hücre içi kalsiyum (Ca2 +) sitozol artış kez elektriksel aktivite nedeniyle oluşur veya sayısız diğer uyaranlara yanıt olarak, bu işlem tarafından izlenebilir sonra hücreleri görüntüleme florasan kalsiyum duyarlı ile yüklü boyalar.  Ancak, bu boyalar doku içinde tüm hücre tipleri tarafından alınır çünkü bu yanıtı tüm doku içinde bireysel bir hücreye görüntü zordur. Buna ek olarak, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) bir tek hücre türüne göre ifade edilebilir ve böylece tüm nüfus içinde sinyal Ca2 + görüntüleme erişimine izin verme intrasellüler Ca2 +, artış yanıt olarak belli tek hücre türleri. Burada, biz turk GCaMP3/6 Kullanım fare nöromüsküler kavşak uygulamak, motor nöronlar, iskelet kası ve terminal/perisynaptic arasında üçlü bir synapse Schwann hücreleri. Biz bu teknik klasik ex vivo doku müstahzarları yarar göstermek. Bir optik bölücü kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik Ca2 + sinyal ve nöromüsküler kavşak (NMJ) statik bir etiket iki hücre özgü GECI veya genetik olarak kodlanmış gerilim izlemek için kolayca adapte olabilir bir yaklaşım yerine Göstergeler (GEVI) aynı anda. Son olarak, biz floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yakalamak için kullanılan yordamları tartışıyorlar. Birlikte, bu optik, transgenik ve analitik teknikler farklı hücre altgrupları çeşitli bağlamlarda NMJ, biyolojik aktivitesini incelemek için istihdam edilebilir.

Introduction

Gibi tüm sinapslarda, NMJ üç unsurdan oluşur: presynaptic bir terminal türetilmiş bir nöron, bir postsinaptik nöron/efektör hücre ve bir perisynaptic gliyal hücre1,2. Sinaptik iletimi temel yönlerini ilk bu synapse3' te gösterilen, birçok açıdan, bu işlemin kısmen nedeniyle bu synapse farklı hücresel elementlerin tarafından aynı moleküllerden ifadesi bilinmeyen kalır. Örneğin, omurgalı NMJ, motor nöronlar tarafından ortak yayımlanan, reseptörleri pürin adenin nükleotit ATP ve asetilkolin (ACh), kas, Schwann hücreleri ve motor nöronlar, böylece herhangi bir yorumu karmaşık hale getiren tarafından ifade edilir Bu maddeler (Örneğin, verici yayın veya Yanıt, kas kuvvet oluşturma)4tarafından sarf fonksiyonel etkisi. Basit, NMJ Üçlü bileşenleridir motor nöronlar, kas hücreleri veya Schwann hücreleri bizi canlı tutan göre değişir olup olmadığını Ayrıca, hangi sık sık birden çok sinaptik girdi, sergi, nöronlarda için merkezi sinir sistemi karşılaştırıldığında kendi içsel olarak heterojen (Örneğin, embriyonik türetme, fiber alt tür, morfoloji) belirsiz. Her biri bu sorunları gidermek için aynı anda bir sinaptik öğesi yanı sıra parça, aynı zamanda, böyle bir tepki'a ayrı diğer öğeler içinde birçok hücre yanıtı izlemek için avantajlı olur. Boya banyo uygulanan birden çok hücre tipleri tarafından doku uygulamaya sonra kaplıyor ve intracellularly yüklü boya sadece görselleştirmek için kullanılabilir çünkü geleneksel stratejileri kalsiyum sinyal ölçmek için kimyasal boyalar kullanarak bu iki gol elde edemez hücre bireysel ya da küçük tabur kadar. Burada, transgenik fareler turk ifade kullanan hücre özgü kalsiyum, belirli görüntüleme ve yazılım araçları5, ile birlikte biz bu iki genel hedefleri ilk göstermek ve tartışmak sinyal ölçmek için tasarlanmış nasıl yanı sıra yeni transgenik araçları ikinci elde yardımcı. Bu teknik kalsiyum dynamics veya diğer hücresel olaylar gözlemlenebilir aynı anda birden çok hücre popülasyonlarının gen kodlanmış optik sensörler aracılığıyla sinyal izlemek isteyen herkes için faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvancılık ve deneyler için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve IACUC University of Nevada, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yapıldı.

1. zarlar ve frenik sinir transgenik fareler üzerinden hazırlanması

  1. Transgenik fareler ve oligonükleotid astar genotip için bu fare satın alabilirsiniz.
    Not: Astar her bu fareler için "Bilgi" sayfasında listelenir.
    1. 3 - için 6-ay-yaşlı fare uygun transgenik/knock-in Cre-sürücü alleli bir kopyasını ve sıfır koşullu GCaMP3/6 gen kopyalarını koşullu GCaMP3 bir veya iki kopyasını ifade aynı yaş ikinci bir fare ile ifade etmek üreme / 6 alleli ve Cre-sürücü alleli sıfır kopyalarını.
    2. Genotip Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen var pups ve mark olanlar — bunlar bundan böyle çift transgenik fareler olarak adlandırılır (Örneğin, Myf5-Cre, koşullu GCaMP3)6.
      Not: Bu şekilde bir kopyasını Cre ve koşullu GCaMP3/6 gen ifade fareler tüm verileri türetmek. Diğer mutant farelerde (Örneğin, altını gizleme) bu haçlar eklerken bu özellikle önemlidir.
  2. Çift-transgenik fareler uygun yaş olduğunda (Örneğin, Doğum sonrası gün 0 veya 5 [P0 veya P5] veya yetişkin), fareler onları makas (için fareler P10 genç) ile decapitating veya bir isoflurane inhalasyon odasında yerleştirerek ötenazi — ne zaman onlar are kuyruk çifti forseps ile pinching artık duyarlı, kurban için hazırlar.
  3. Hayvan tarafından işten çıkarma makas çifti ile kurban.
  4. Bölüm arasında hemen altında karaciğer ve kalp ve akciğerler iridectomy makasla hemen üstünde tüm hayvan kemiği.
  5. Uzak karaciğer, kalp ve akciğerler frenik sinir bir emme elektrot (yani, 1-2 cm) çizilmesi için yeterince uzun bir süre korumak için dikkatli olmak, incelemek.
    Not: Sol frenik sinir sol diyafram medial kısmı girer doku beyaz bir parça tanımlanabilir. Bu akciğerler kaldırırken kesilmiş olmalı değil. Şu frenik sinir bir parçası da superior vena cava içeren ve daha ince ve daha beyaz daha vena kava şerit içinde çalışır. Birlikte, her ikisi de sağ medial diyafram nüfuz.
  6. Daha fazla göğüs kafesi ve diyafram çevresinde ince ridge dışında vertebral sütunun kaldırın.
  7. Diyafram ve frenik sinir örnek bir microfuge tüp Krebs Ringer solüsyonu 1 µg/mL 594-αBTX 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile yerleştirin.
    Not: 594-αBTX bu toplama işlevlerine (kişisel gözlem) engellenmeden ACh reseptör (AChRs) Etiketler.

2. uyarımı ve kas aksiyon potansiyelleri kayıt

  1. Minutien iğne kullanarak, diyafram hareketsiz yoluyla 6 cm çanak üzerine silikon dielektrik jel ile kaplı ve ~ 8 mL oksijenli Krebs Ringer çözeltisi ile dolu ve mikroskop sahneye yerleştirin. Diyafram için 30 dk daha fazla Krebs-zil çözüm (8 mL/dk) ile sıvı.
    Not: Bu ilişkisiz 594-αBTX durulama yanı sıra doku diseksiyon sonra sakinleştiği.
  2. Kurulan yöntemleri7göre emme bir elektrot olun.
    1. Bir micromanipulator kullanarak 4 X büyütme, emme elektrot Sol frenik sinir üzerinde taşımak ve emme emme elektrot bağlı olduğu Tüp bağlı 5 mL şırınga varil dışarı çekerek uygulayın.
      Not: başarılı bir şekilde emme elektrot çizildiğinde, frenik sinir gergin olduğu. Uyarıcı üzerinde açmak ve frenik teşvik sinir el ile saygısız tarafından geçiş 1 x.
    2. Diyafram 1-Hz stimülasyon cevaben görsel olarak aydınlık alan aydınlatma ile incelenerek sözleşmeleri olduğunu emin olun. Eğer değilse, artımlı olarak bir görsel inceleme kas kasılması, tarafından doğrulanabilir bir supramaximal darbe ulaşmak için gerilim kolu çevirerek gerilim ayarlayın. Eğer hala görünür değil, şırınga ile sinir darbe ve tekrar emme uygulayarak çiz deneyebilirsiniz.
  3. Perfüzyon açmak ve kas özgü myosin inhibitörü BHC6 veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti µ-conotoxin8 100 µM son bir konsantrasyon için ekleyin.
    1. 100 µM BHC yapmak, DMSO 200 mM stokunun 4 µL pipet ve 1 mL Krebs Ringer çözeltisi predilute.
    2. 1 mL Krebs Ringer çözeltisi yemek kaldırın.
    3. Prediluted BHC yemek için ekleyin.
      Not: Bu predilution GCaMP3 ifade hücreleri geçici olmayan floresan yanıtta su katılmamış DMSO tarafından indüksiyon önlemeye yardımcı olur.
    4. 30 dakika bekleyin ve sonra başka bir 20-30 dk için taze Krebs-zil çözüm perfüzyon açın.
  4. Kayıt elektrot hazırlayın.
    1. Eldiven giyiyor, bir borosilikat filamented bir dış çap (OD) ile 1 mm ve cam bir 0.4 mm iç çapı (ID) bir micropipette çektirmenin yerleştirin ve yerine kelepçe için aramalar sıkın. Çektirme kapıyı kapat.
    2. P-97 çektirme kullanarak programı aşağıdaki ayarı: 900 ısıda, çekme 120, 75 hızda, 250, 500 ve döngü olmadığını ek basınç anda.
      Not: Yazılım denetimleri amplifikatör kullanarak Resistance (R) ölçülür: veri toplama yazılımı direnç formülü V çözerek onaylar IR. = Yazılım denetleyicisi bir bilinen akım (ı) (genellikle 1 nA) elektrot üzerinden geçer ve böylece bize R. için çözmek etkinleştirme voltaj (V), değişikliği ölçer
    3. Embriyonik diyaframlar için direniş 60 MΩ yakın ve büyük diyaframlar, 10-20 MΩ için olduğundan emin olun. 3 M KCl ile kayıt elektrot yükleyin.
  5. 10 X büyütme oranında elektrot ikinci bir micromanipulator sahne karşı tarafta bir uyarıcı elektrot kullanarak kas içine daha düşük.
  6. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımı kullanarak, istirahat membran potansiyeli 0'dan-65 için dönüşünceye kadar bekleyin mV veya aşağıda.
  7. 1 Hz de teşvik ve mütevazı bir kaçmak sergiler için büyük bir potansiyel kontrol ederek bir kas aksiyon potansiyeli varlığını denetlemek (0'ın üzerinde yükselir potansiyel-65 başlatıldığında mV mV veya aşağıda). Stimülasyon artifakı bir aksiyon potansiyeli ile karıştırmayın.
    Not: Süresi (~ 5 ms) stimülasyon eserler önemli ölçüde daha uzun kudretliler.

3. örnek floresans görüntüleme

  1. 594-αBTX-etiketli NMJs yeşil/sarı ışık uyarma altında yaşar kas endplate grup merkezi 20 X büyütme oranında bulun (550 nm). Geçiş için mavi ışık uyarma (470 nm) görüntü Ca2 + yanıt kas, motor nöron veya Schwann hücreleri için.
  2. İsterseniz, resim splitter kadar bant filtreleri ve çift dalga boyu görüntüleme için bir dikroik tek-edge filtresi ayarlayın.
  3. GCaMP3/6-ifade doku tarafından sergilenen maksimal Floresan (Fmax) hesaplamak için diyafram hazırlıklar6' ya 3 M potasyum klorür (KCl) 12 µL eklemek.
    1. Arama tablo Bar GCaMP3/6-ifade doku KCl cevaben binning olmadan 20 X büyütmede doygunluğu sergileyen düzeyinin % 110 set parlaklık çubuğu ile deneyler yapmak.
  4. Kaçırmayın için saniyede 20 kare herhangi bir hızlı olayları kaydetmek.
  5. 1-45 s 20-40 Hz ile sinir stimülasyonu ile bir tren emme elektrot kullanarak impulslarinin sunarak teşvik veya farmakolojik agonistler banyo uygulama veya perfüzyon ekleyin ve dinamik floresan Ca2 + yanıtları bir hücre alt toplamak statik 594-αBTX NMJ sinyal ile birlikte.
    Not: doku özgü kırmızı veya far-red GECI veya GEVI fareler, NMJ kullanılmak yayımlanırsa, onlar NMJ iki ayrı hücresel elemanlar yansıtan iki dinamik sinyal toplamak için kullanılabilir.
  6. İstenen sonuçları elde çünkü görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler sona erdikten sonra perfüzyon hatları üzerinden su sıvı ve su 2 x - 3 x tuzları inşa değil emin olmak için emme elektrot ile emmek.

4. ihracat ve bir standart sapma harita floresan yoğunluğu (SDiu16) tarafından veri analizi

  1. 16-bit TIFF yığınlar kaydedilen görüntü sıralarını kayıt ve analiz için istediğiniz görüntüleme veri analiz sistem içine yükleyin.
  2. Yazılım'ın 8d dosya menüsü, ilgi görüntü yığını seçin ve yüklemek için tıklatın.
    1. Bir kez video yükler, hücresel floresan aktivite vardır bir bölümü tanımlamak için zaman inceden inceye gözden geçirmek.
      Not: Bu bölge bir arka plan örnek oluşturmak için kullanılır.
    2. Shift basılı tutun ve bir bölgesi faiz (ROI) kutusunun arka plan örnek alanı olarak tanımlanan alan çizmek için tıklatın.
    3. Kutusu oluşturduktan sonra arka plan etkinliği değiştirmek bir çizim oluşturmak için boşluk çubuğuna basın.
    4. Izleme sağ tıklatın ve xy koordinat metin dosyası olarak izleme yapmak için Metin olarak yatırım getirisi dökümü seçeneği sunmak için çeşitli seçeneğini belirleyin.
  3. Geri faiz video hareketli, tekrar faiz etkinliğin oluştuğu saat bölgesi tanımlamak için tarayın.
    1. Orta fare düğmesini kullanarak, bu zaman bölgesi sarı zaman kutusunda seçin.
    2. Videoda sağ tıklatın ve seçin Yığın OPS ve sonra Stat göster seçeneği 5.
      Not: Bu sol penceresinde bir standart sapma harita (SD) oluşturur.
    3. SD harita üzerinde tıklatın ve sonra uygun renk ısı haritası uygulamak için 19 x tuşuna basın [ ] .
    4. SD Haritayı sağ tıklatın ve hangi SD harita kaydetme seçeneği stm TIFF olarak kaydetmek sunacak STM yük ve kurtarmak, seçin.
    5. O zaman, basın [ bir gri tonlama renk haritaya dönmek için 19 x anahtar.
    6. C sonra D yoğunluğu haritalama araçları kadar getirmek için tuşuna basın. Sol fare düğmesi ve merkezi fare düğmesini kullanarak, SD Haritada gösterilen tüm floresan etkinlik eklemek için eşik ayarlayın.
    7. Eşik ayarlarını koruyarak yoğunluğu araçları kapatmak için C tuşuna basın.
    8. SD Haritayı sağ tıklatın ve seçin STM parçacıklar ve sonra Bulmak PTCLS.
      Not: Bu tek tek hücreleri floresan etkinliği ifade tanımlar.
    9. Bir kez daha SD Haritayı sağ tıklatın ve Parçacık ROIs oluşturmakseçin.
      Not: Bu orijinal video ilgi temel üst üste.
    10. Shiftbasılı tutarak, özgün video Şimdi tespit parçacık ROIs herhangi birini sağ tıklatın.
    11. Yatırım getirisi Marker ve yatırım getirisi ölçü Intseçin.
      Not: Bu video ilgi tanımlanan her yatırım getirisini floresan faaliyet araziler oluşturur. Bunlar bunlardan herhangi biri sağ tıklatarak kaydedilebilir ve Assorted, seçme Metin olarak yatırım getirisi dökümütarafından takip.
  4. Bu işlemler altında yatan ayrıntılı mantık için kaynak kodu dosyası9bakınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Çeşitli değişikliklere örnek olarak artar olan intrasellüler Ca2 + NMJ türleri tanımlanmış hücre içinde tarafından aracılı floresan yoğunluğu, belgili tanımlık yarar bu yaklaşımın göster. Bu sonuçlar yanıt veren hücrelerin konumunu, hem de böylece kaç hücre yanıt ve ne kadar her hücre için belirli bir yanıt değerlendirilmesi için izin verdikleri yanıtlara yoğunluğunu sağlamak kayma floresan yoğunluğu haritalar olarak sunulur uyarıcı. Örneğin, Şekil 1' de gösterildiği gibi biz terminal/perisynaptic Schwann nüfusu içindeki Ca2 + yanıtları videoları hücreleri (TPSCs) adlı bir P7 Wnt1-Crediyafram NMJs aldı; koşullu GCaMP3-fare yanıt frenik sinir uyarılması olarak ifade ve yanıt veren hücreler altgrupları kayma floresan yoğunluğu haritalar tarafından tanımlanan. Isı haritaları ve bir yangın renk tablosuna göre (yangın CLUT) renk kodlu floresan yoğunluğu bu haritalar sunulmaktadır. Biz bu videoları ve aynı anda α BTX etiketli AChRs (Videolar 1 ve 2), diyafram ortasında kümelerini görüntülemek için resmin yarma olmadan kayıt kolayca dinamik GECI veya GEVI yakalamak için adapte olabilir bir yaklaşım koşuluyla her biri üst üste uyarma ve emisyon spectra sergileyen iki ayrı yanıt türleri, hücre.

Şekil 2' de, biz bir P4 Myf5-Cre; koşullu GCaMP3, diyafram aynı sinir stimülasyonu deneyi gerçekleştirilen-ifade fare ve kas hücreleri Ca2 + yanıtlarında görüntüsü. İlginçtir ki, biz myosin engelleyici BHC ya da iskelet kas özel voltaj kullanıldığında sodyum kanal (Nav1.4) engelleyici µ-conotoxin (Şekil 2A ve Video 3 veya Şekil 2B ve Video 4, sırasıyla) , Aksiyon potansiyeli ve Ca2 + sürümü tarafından aracılı sarcoplasmic retikulum, veya sadece endplate grup uzunluğunu temsil eden, temsil eden kas lifi, tam uzunlukta seyahat Ca2 + geçişler görüntülenmiştir endplate potansiyel ve aracılı hücre dışı Ca2 + akını kayma floresan yoğunluğu ile yanıt veren hücreler altgrupları tanımlayıcı AChR.In eklenmesi tarafından (SD), Şekil 1de olduğu gibi haritalar, biz de değişiklik ölçülen floresans kronolojik zamanmekansal (ST) ile bu kas hücrelerinin bir popülasyondaki zamanla eşler. Bu deneyler herbiri farklı hücre tipi, farklı yaş, farklı tedavi (sinir stimülasyonu vs sinir stimülasyonu farklı ilaçlar varlığında) ve Analizi (kayma vs kronolojik zamanmekansal farklı türleri temsil eder «««Haritalar) Floresan yoğunluğu. Bu şekiller transgenik GCaMP ifade fareler, tekrar tekrar uyarmak ve aynı örnek görüntü ve bu nedenle, farklı tedavi koşulları etkisini sınayın, yani yeteneği en yararlı özelliklerinden biri de gösterir.

Figure 1
Resim 1: Faaliyet kaynaklı Schwann hücresi Ca2 + yanıt-e doğru diyafram ve P7 Wnt1-Crefrenik sinir ölçümü; koşullu GCaMP3 fareler. (A) (solda) floresan arka plan düzeyleri Schwann hücreleri frenik sinir dalları boyunca ve nöromüsküler kavşak (NMJ), gösterilen ortalama floresans yoğunluğu görüntüyü sinir stimülasyonu (Prestim) daha önce ele geçirildi. Bu arka plan floresans değerlerini sinir stimülasyonu sonra elde edilen floresan değerler üzerinden düşülen. (Sağ) 16-bit floresan yoğunluğu birim (SDiu16) 30'dan sonra oluşturulan Ca2 + yanıt standart sapması kayma Haritası terminal/perisynaptic Schwann sağlam bir tepki gösterir frenik sinir stimülasyonu (Stim harita veya SD harita) 40 Hz s hücreler (TPSCs), NMJ. Yangın CLUT heatmap SDiu16 ' ve ölçek çubuğu mikron. Tüm panelleri B - E Apanelinde alanındakiyle aynı büyütme görüntülerdir. (B) (solda) 594 Birleşik α-tablolar bağlar ve asetilkolin reseptörü (AChRs) ve yeşil/sarı ışıkla NMJ tanımlamak için heyecanlı bungarotoxin ile (α-BTX), aynı diyafram etiketli oldu. (Sağ) Bu panel aynı diyafram, aydınlık alan görüntüsünü gösterir, bir NMJ güdümlü, bir hücre içi kayıt elektrot (ok), ucu gösteriliyor, α-BTX etiketleme dayalı. (C) Ca2 + geçici özellikleri (Örneğin, yoğunluk, başlangıçlı stimülasyon sonra süresi) bireysel veya grup hücreleriyle mekansal yoğunluk haritası belirli bölgeler (solda), tanecik olarak tirelemeye tarafından değerlendirilebilir Onları kendi yoğunluklarda zaman içinde komplo olarak renk kodlu bölgeleri faiz (ROIs) ve (D) temsil eden. (E) Bu panel sinir stimülasyonu sonra ikizler resim splitter kullanarak aynı diyafram GCaMP3-aracılı floresan Ca2 + yanıt ve 594-α-etiketli NMJs çift dalga boyu görüntüleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1
Video 1: görüntü faaliyet kaynaklı Schwann hücresi Ca yarma olmadan film 2 + yanıt-e doğru P7, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Resim 1 efsanesi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video 2
Video 2: film görüntü faaliyet kaynaklı Schwann hücresi Ca bölme ile 2 + yanıt ve 594- α BTX etiketli AChRs P7, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Resim 1 efsanesi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Figure 2
Resim 2: Faaliyet kaynaklı kas hücre Ca2 + P4 Myf5-Crediyafram yanıtlarında ölçümü; koşullu GCaMP3 fareler. (A)(sol) nikotinik diyafram merkezi bir konumda bulunan endplate bant kümeleri 594-α-BTX ile etiketlenir AChR. (Orta) 30'dan sonra oluşturulan bir kayma harita Ca2 + geçici yoğunluklarını (SD harita), frenik sinir stimülasyonu myosin inhibitörü BHC, huzurunda 40 Hz s tüm diyafram kas hücreleri tüm bölge boyunca bir tepki gösterir. (Sağ) Buna ek olarak, aynı stimülasyon sonra ama Nav1.4 antagonisti µ-conotoxin (μ-CTX), varlığında aynı diyaframdan oluşturulan bir SD harita dağınık şekilde kısıtlı sergileyen yanıt tüm diyafram kas orta bölgedeki hücreleri AChR küme zenginleştirilmiş endplate grubuna karşılık gelir. Yangın CLUT heatmap SDiu16 ' ve ölçek çubuğu mikron. (B) Bu panel (ST haritalar) zamanla geçici yoğunluklarda Ca2 + kronolojik zamanmekansal haritalar Vaha'da kas hücreleri gösterir (y-ekseni) zaman içinde takip (x-ekseni). Ölçek çubuğu saniyedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 3
Video 3: film faaliyet kaynaklı kas hücresinin Ca 2 + Yanıt myosin kütük parçası BHC P4, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi varlığında Şekil 2A efsanesi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video 4
Video 4: film faaliyet kaynaklı kas hücresinin Ca 2 + Yanıt Na varlığında v 1.4 antagonisti µ-conotoxin P4, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Şekil 2B efsanesi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada biz Ca2 + yanıt sağlam nöromüsküler doku GECI ifade fare kullanarak belirli hücrelerde ölçme bazı örnekler sağlar. Bu deneyler başarıyla gerçekleştirebilmek sırasında diseksiyon frenik sinir incitmek değil zorunludur. CA2 + Schwann hücreleri (Örneğin, 20 X veya 60 X) düşük veya yüksek güçte yanıtlarında görüntüye, ya BHC ya da µ-conotoxin blok hareket için kullanmak gereklidir. Düşük güç görüntüleme için tepkilerin Ca2 + kas hücreleri, onları böylece uzunluğu değişiklikler sırasında aynı anda satın alma kas ve kas Ca2 + geçici yoğunluklarda erişimine izin verme bu ilaçların yokluğunda ölçmek mümkündür yüksek frekanslı sinir stimülasyonu6. Birden çok deneyler aynı örnek üzerinde gerçekleştirirken, her biri en az 15 dk, hangi süre içinde örnek periosteum tarafından ayırmak gereklidir. Stimülasyon kaynaklı Ca2 + yanıt aynı alan bakış aynı örnek içinde yinelenen görüntüleme için en az 3-5 saat için adımları sağlar. Aynı zamanda geri dönüşü olmayan, uyarıcı bağımsız floresans yanıt doğrudan GCaMP ifade doku uygulanan DMSO indükler gibi BHC için açıklandığı gibi DMSO içinde çözünmüş predilute ilaçlara çok önemlidir.

Bulduk belirsiz, nedeniyle Wnt1-Cre; conditionalGCaMP3/6 fareler sinir stimülasyonu veya agonist kaynaklı Ca2 + yanıtları Schwann hücreleri P15 sonra - P20 sergilemek başarısız. Ancak, Sox10-Cre; koşullu GCaMP3/6 fareler bu yanıt P56, en az geç biz inceledik en eski yaş sergilemek devam edin. Buna ek olarak, yanıt olarak bir yıl, incelendiğinde en eski yaş eski Myf5 koşullu GCaMP3/6 fareler sergiler.

GECI ifade fareler Ca2 + hücre belirli alt türündeki tüm nüfus yanıtlarında görüntüleme için eşsiz fırsatlar sunarken, ratiometric görüntüleme gerçekleştirmek ve bu nedenle nicel Ca ayıklamak için yetersizlik gibi bazı sınırlamalar vardır 2 + ölçümleri. Ayrıca hangi bu yanıtları widefield floresans mikroskobu (confocal veya multiphoton mikroskobu kullanılarak aksineyani,) kullanarak yansıması doku derinlik miktarı için sınırlamalar vardır. Diyafram inceliği burada sunulan tekniklerin uygulanması için mükellef olmakla birlikte, bu nedenle, hücre özel Ca2 + hücre tipleri daha kalın diğer kaslarda NMJ, yanıtlarında yakalayan alt diseksiyon veya diğer gerektirebilir, floresans mikroskobu.

Bu genetik ve optik araçlar önemli bir ilerleme görüntüleme teknikleri, hangi tarafından yalnızca birden çok hücre türleri veya birkaç tek tek hücreleri içinde bir hücre tipi görüntüsü önceki Ca2 + üzerinde gösterir. Bu kolayca geleneksel kimyasal Ca2 +kullanarak mümkün değildir, ancak Ca2 + yanıt repeatably uzun bir süre için GECI fareler, kullanarak hücrelerden yansıması ki ek bir avantaj olduğunu-floresan boyalar bağlama. Son olarak, bir resim splitter kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik bir sinyal içinde bir hücre tipi (Schwann hücreleri) ve ikinci (kas hücreleri) içinde sabit bir etiket yapmak ve bu nedenle, birden çok hücre özgü kalsiyum göstermek veya yanıt olabilir gerilim değerlendirildi) Örneğin, bir Schwann hücresi Cre-sürüş fare olarak burada, rapor için bir koşullu Cre-bağımlı GCaMP fare geçti geçti bir kas hücre özgü ifade transgenik Cre bağımsız fare için GECI veya GEVI üst üste floresans uyarma ile / emisyon spectra10, sağlayacak kas ve Schwann hücreleri dinamik Ca2 + ve/veya voltaj değişiklikleri aynı anda izleme). Gibi araçlar bir hücre tipi yanıt pürin ATP veya onun arıza ürün adenozin gibi belirli bir uyarıcı olarak doğrudan veya dolaylı olarak başka bir hücre tipi, NMJ üzerinde doğrudan etkisi tarafından aracılı olup olmadığını değerlendirmeniz yardımcı olabilir.

Bu araştırmaların temel amacı kronolojik zamanmekansal Ca2 + yanıt desen sinir stimülasyonu için hücre türlerinden değerlendirmek için ama bunu başarmak için istihdam teknikleri diğer hedeflerine doğru dağıtılabilir. Örneğin, onlar Ca2 + yanıt belirli antagonistleri varlığında veya belirli mutant arka planlar, motor nöron hastalığı, kas distrofisi veya Charcot Marie diş hastalığı, çözümlemek için belirli hayvan modellerinde gibi analiz etmek için kullanılabilir CA2 + yanıt reseptör ifade, Ca2 + yanıt özellikleri içinde bir hücre alt türü bir uyarana heterojen değerlendirmek veya Ca2 + hücre alt türü içinde yanıt-e doğru diğer fonksiyonel karşılaştırmak için değerlendirmek için belirli agonistleri Yanıt-e doğru bu tür (electrophysiologically kaydedilen kas endplate veya Aksiyon potansiyelleri, optik görüntülü kas kısalması, güç dönüştürücü kaydedilmiş kas gerginliği, vb) içinde veya diğer parametreleri (Örneğin, özel mesaj için değerlendirilmesi sinir/kas Schwann hücresi morfoloji veya moleküler ifade üzerinden immünhistokimya). Birlikte, bu çalışmalar ne kadar hücre özgü GECI gösterme veya GEVI fareler, genetik olarak tanımlanabilir, hücre özel girişleri oluşan bir synapse fizyolojik süreçlerin geniş bir spektrum aydınlatmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser fonları sağlık (NIH) GM103554 ve GM110767 (T.W.G.) için ulusal Enstitüleri ve araştırma kaynakları 5P20RR018751 Ulusal Merkezi ve Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 8 P 20 GM103513 (için G.W.H.) ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Myf5-Cre mice Jax #007893 Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice Jax #003829 Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice Jax #025807 Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice Jax #029043 Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice Jax #024105 Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) Hit2Lead #5102862 Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX Biotium #00007 Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb Peptides Int'l #CONO20-01000 Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard Ellswoth Adhesives # Sil Dielec Gel .9KG  Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter) Fine Science Tools 26002-10 Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope  Nikon MBA74100 Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator  Autom8 MXMScr Allows movement of specimen
Manual micromanipulator  Narishige M-152 Holds recording and stimulating electrodes 
Microelectrode amplifier  Molecular Devices Axoclamp 900A Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system Molecular Devices Digidata 1550  Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system Molecular Devices PCLAMP 10 Standard Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator Grass S48 Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit Grass PSIU6 Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter  Sutter FG-GBF100-50-15 Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter  Sutter BF150-117-15 Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller Sutter P-97  Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera  Photometrics Prime 95b Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source Lumencor Spectra X Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
 Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm  Nikon CFI60 Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp Sumita LS-DWL-N Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter  Hamamatsu A12801-01 Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)  SemRock FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter Sem Rock FF560-FDi01-25x36 Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system Nikon NIS Elements - MQS31000 Allows imaging data acquisition
Wavelength control module Nikon MQS41220 Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module  Nikon MQS41410 Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system NA Volumetry 8D5, Fiji Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  2. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
  3. Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
  4. Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
  5. Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
  6. Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
  7. Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
  8. Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
  9. Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
  10. Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).

Tags

Imaging nörolojik sayı: 140 kalsiyum kalsiyum göstergeleri GCaMPs kas genetik olarak kodlanmış Schwann hücresi motor nöron nöromüsküler kavşak transgenik diyafram
<em>Ex Vivo</em> Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heredia, D. J., Hennig, G. W.,More

Heredia, D. J., Hennig, G. W., Gould, T. W. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (140), e58347, doi:10.3791/58347 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter