Summary
Veel behandelingen en genetische mutaties van invloed op de timing van seksuele rijpheid en vruchtbaarheid. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om te evalueren van de pubertijd begin in muizen en ratten vóór het opzetten van een vruchtbaarheidsonderzoek in seksueel volwassen dieren.
Abstract
Beoordeling van reproductieve vakbekwaamheid is van cruciaal belang voor het begrip van het effect van een behandeling of genetische manipulatie op de reproductieve as, ook wel de hypothalamische-hypofyse-gonadale-as genoemd. De reproductieve as is een belangrijke integrator van input van het milieu en de interne aanpassing van vruchtbaarheid naar gunstige omstandigheden voor de voortplanting. Vóór het aangaan van een vruchtbaarheidsonderzoek in muizen en ratten, seksuele looptijd wordt geëvalueerd als u wilt uitsluiten van de mogelijkheid dat de waargenomen reproductieve fenotypen zijn veroorzaakt door vertraagde of afwezige pubertijd begin. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve aanpak om te beoordelen van de pubertijd begin bij mannen door middel van de bepaling van de preputiale scheiding, inzonderheid vrouwen door middel van de vaginale opening en eerste estrus. Na de bevestiging van de voltooiing van de puberteit en de totstandbrenging van seksuele volwassenheid, kan een vruchtbaarheidsonderzoek worden gestart. De procedure beschrijft de optimale fokken voorwaarden voor muizen en ratten, het instellen van een vruchtbaarheidsonderzoek en welke parameters te evalueren en te bepalen of de behandeling of de verwijdering van het gen een effect op de vruchtbaarheid heeft.
Introduction
De overgang door de puberteit is te bereiken seksuele volwassenheid en reproductieve bevoegdheid vereist. De pubertijd overgang en het behoud van de vruchtbaarheid in volwassenheid wordt geregeld door de reproductieve as, ook wel genoemd de hypothalamische-hypofyse-gonadale as (Figuur 1). De timing van pubertijd intreden en onderhoud van de vruchtbaarheid wordt strak gereguleerd door zowel interne als ecologische factoren verhogen de kans op overleving van nakomelingen en ouders1,2. Dit protocol biedt een niet-invasieve benadering om te bepalen van de begin van de pubertijd in muizen en ratten te bevestigen seksuele volwassenheid vóór het opzetten van een vruchtbaarheidsonderzoek reproductieve bekwaamheden te beoordelen.
Een vruchtbaarheidsonderzoek in seksueel volwassen dieren wordt uitgevoerd en kan worden gestart nadat de dieren zijn gegaan door de puberteit. Voorafgaand aan het begin van de pubertijd, de reproductieve as is rustig, en de belangrijkste bestuurder van seksuele rijping, gonadotropin - releasing hormone (GnRH), wordt losgelaten op de hypofyse in onvoldoende hoeveelheden tot puberteit (Figuur 1). Begin van de pubertijd is een complex proces dat in verhoogde GnRH release op de mediane eminence resulteert. GnRH bevordert luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) afscheiding uit de hypofyse, twee hormonen essentieel voor gonadale rijping en reproductieve functie (Figuur 1)3,4,5 .
Beledigingen aan de reproductieve as leiden tot verminderde vruchtbaarheid en kunnen ook vooraf of vertraging pubertijd begin. Voorwaarden gekend om te beïnvloeden de timing van het begin van de pubertijd en reproductieve bevoegdheid omvatten de blootstelling aan hormoonontregelende chemische stoffen6,7, toegenomen/afgenomen lichaam gewicht1,8, veranderingen in dag lengte2,9 en genetische mutaties10,11,12,13,14,15.
Het begin van de seksuele volwassenheid is een cruciale stap die worden afgerond moet vóór het opzetten van een test van de vruchtbaarheid. De voordelen van het bepalen van de begin van de pubertijd door preputiale scheiding, vaginale opening en eerste estrus, zijn de niet-invasieve kenmerken van deze procedures, zoals zij vereisen geen bloedinzameling of opoffering van de dierlijke16, 17.
Nadat pubertijd begin is vastgesteld, correct instellen van een vruchtbaarheidsonderzoek zal leveren belangrijke informatie over de integriteit van de reproductieve as en meestal heeft het tweede voordeel van het genereren van proefdieren voor verdere studies (verfijning) 18. de vruchtbaarheid studie setup beschreven in dit protocol kan detecteren zowel kleine en grote tekorten in reproductieve competentie in de mannetjes en vrouwtjes. Belangrijkste parameters geëvalueerd omvatten 1) tijd om de eerste nestje, 2) aantal nesten gegenereerd in een bepaald tijdsbestek en 3) nestje grootte. Ten slotte, aanbevelingen voor het type van follow-up studies die kan worden uitgevoerd om te identificeren van de oorzaak van waardevermindering van de vruchtbaarheid zijn opgenomen.
Het beschreven protocol verwijst naar muizen en de representatieve gegevens overeen met werk in transgene muizen. Alle opgenomen protocollen zijn echter even geldig bij ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Michigan State University en uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. bepalen van de begin van de pubertijd
- Volg institutionele richtlijnen voor kleding, ten minste, is het noodzakelijk om een schone lab-jas en schone handschoenen te dragen. Altijd behandelen muizen schone handschoenen.
- Het werkgebied voor te bereiden door een pad op de tabel te plaatsen.
- Plaats een schoon muis kooi top met het raster naar boven zijn gericht op het pad.
- Instellen van een schaal in het werkgebied. Plaats een schoon 500-1000 mL-bekerglas over de omvang en de tarra.
- Leg een vel naast het werkgebied te registreren lichaamsgewicht en preputiale scheiding, vaginale opening of eerste estrus.
- Het identificeren van de muizen voor de studie. Dagelijkse inspecties voor pubertijd begin uitvoeren totdat puberteit is bereikt. Het uitvoeren van de inspectie op hetzelfde moment van de dag tijdens de studie. Begin van de pubertijd kan optreden zo spoedig postnatale dag 11-1219, echter in meest experimentele opstellingen, pubertijd begin toezicht begint bij ~ 22 dagen.
- Plaats de muis kooi in het werkgebied (stap 1.2). De kooi open en plaats de deksel, fles water en voedsel houder op de tafel.
- Het bepalen van preputiale scheiding in mannelijke muizen.
- Houd de muis door de staart en plaats deze op de bovenkant van de kooi schoon muis uit stap 1.2.1. Zachtjes Houd op de staart en laat de muis verkennen van het raster van de bovenkant van de kooi voor ~ 5 s.
- Trek voorzichtig aan de staart achteruit; Dit resulteert meestal in het vooruit terwijl het vasthouden aan het raster met zijn voorpoten dier. Aanpak van de andere hand de huid sluit door de hals en oren.
- Pak de losse huid tussen de schouders en de nek met de duim en wijsvinger. Het is belangrijk om een goede greep van de huid, zoals het zal voorkomen dat de muis zijn hoofd draaien om te bijten.
- Pak de huid op de rug met de overige vingers en houd het door te drukken tegen de hand. Houdt vast, zonder te belemmeren, ademhaling, bloed stroom of schadelijke beenderen, spieren of huid. Draai de hand om de buik van de muis, terwijl de ondersteuning van de rug van de muis in de palm van de hand bloot te stellen.
- Met de vrije hand, duw voorzichtig terug de huid rond de penis zonder te forceren. Bij preputiale scheiding, de preputiale huid dia's achteruit bloot de eikel (figuur 2A, pijl toont preputiale scheiding). Het opnemen van de aanwezigheid of afwezigheid van preputiale scheiding.
- Weeg de muis voorzichtig door deze te plaatsen in het bekerglas van 500-1000 mL vanaf stap 1.2.2 en het gewicht.
- De muis in de kooi huisvesting opnieuw door het bekerglas 0-2 cm te houden over de vloer van de kooi en langzaam tip over het bekerglas waardoor de muis om af te sluiten op zijn eigen. Het bekerglas met water en een mild afwasmiddel schoon en droog het af voordat het terug te keren naar de omvang en de schaal tarreren.
- Het bepalen van vaginale opening in vrouwelijke muizen.
- Plaats een katoenen bal, bekerglas en een fles steriel water in het werkgebied (stap 1.2). Giet het water in het bekerglas. Humidify van de katoenen bal met het steriel water en plaats deze naast de bovenkant van de kooi uit stap 1.2.1.
- Plaats de muis kooi in het werkgebied (stap 1.2) en de muis uit haar kooi overdragen naar de bovenkant van de kooi (stap 1.2.1) houdt het aan de voet van de staart. Voorzichtig terugtrekken van de staart om aan te moedigen een voorwaartse beweging van de muis.
- Til de staart en de ondersteuning van de heupen met de vrije vingers. Laat de hindlimbs contact te onderhouden met de bovenkant van de kooi. Als de muis teveel beweegt, houd hem in de hand, zoals beschreven in stappen 1.5.1-1.5.4.
- Voorzichtig schoon de vulva met de water bevochtigde katoenen bal uit stap 1.6.1. Gebruik een schone bevochtigde katoenen bal voor elke muis. Bepalen van de vaginale opening, de vulva onderzoeken en bepalen of de vagina volledig geopend is (figuur 2A, vrouwelijke vaginale opening).
- Record als vaginale opening heeft plaatsgevonden. Weeg de muis en terug te sturen naar de kooi zoals beschreven in stappen 1.5.6-1.5.7.
- Eerste estrus een indicator van de eerste eisprong.
- Plaats een bekerglas met steriel water, een gelabelde glasplaatje en een 200 µL Pipetteer met een schone tip in het werkgebied (stap 1.2).
- Houd het vrouwtje zoals beschreven in stap 1.6.2-1.6.3. Plaats het uiteinde van de pipet met ~ 50 µL van steriel water bij de vaginale opening.
- Spoel zachtjes door de invoering en geabsorbeerd ~ 50 µL van water 2 - 4 keer de cellen van de vaginale muur. Uitstrijkje van de inhoud van het uiteinde van de pipet op een gelabelde Microscoop glasplaatje.
- Zorgvuldig observeren de cellulaire morfologie op een helderveld Microscoop met behulp van een 10 X en 20 X doelstelling of laat het uitstrijkje airdry voor ~ 1 h en vervolgens counterstain met een 0,1% methyleenblauwoplossing (ontbonden in ddH2O) (figuur 2B). Als u wilt counterstain, dompel de gedroogde dia in de 0,1% methyleen blauw oplossing voor ~ 30 s. Laat de dia lucht drogen gedurende 1 uur.
- Let op de dia's uit stap 1.7.4 op een heldere veld microscoop op 10 X en 20 X. De fase van de oestrische cyclus (figuur 2B)20 vast door het observeren van de morfologie van de cel die het mogelijk maakt om te onderscheiden van de vier verschillende fasen van de oestrische cyclus (figuur 2B).
Opmerking: Metestrus wordt gekenmerkt door een mengsel van cornified squamous epitheliaale cellen en leukocyten, diestrus door leukocyten, proestrus door een mengsel van leukocyten en genucleëerde epitheliale cellen en estrus door cornified epitheliale cellen (figuur 2B) 20. - Opnemen van het lichaamsgewicht en de muis terug naar haar kooi zoals beschreven in stappen 1.5.6-1.5.7. Vaginale uitstrijkjes worden beëindigd op de dag wanneer de muis zijn eerste estrus (figuur 2B heeft).
2. wenselijk fokken kamer voorwaarden
- Zorgen dat de fok kamer een temperatuur van ~ 20-24 heeft ° C, 55 ± 10% vochtigheid, en homogene kamer licht met een intensiteit van ~ 300-400 lux ongeveer 1 m boven de vloer21. Deze lichtintensiteit kan het wenselijk mid cage lichtsterkte van 25-80 lux. Om te testen lichtintensiteit, gebruik van een lichtmeter.
- Gebruik van een geautomatiseerd systeem om de verlichting in de kamer fokken om de juiste timing van verlichting gedurende het gehele experiment. Optimale daglengte omstandigheden te beoordelen van de vruchtbaarheid in knaagdieren bereik vanaf een 12u-dag (12 uur licht en 12 h duisternis, LD12:12), "zomer-achtige" voorwaarden met 14 h van licht en 10 uur donker (LD14:10)21.
- Voorbereiding kweek kooien.
- Een schone muis kooi met deksel, water, voedsel, beddengoed en nesten per paar fokken voor te bereiden.
- Invullen van de kaarten van de kooi met alle vereiste informatie, met inbegrip van geslacht, geboortedatum, muis stam, en de datum wanneer de paring is ingesteld.
3. de vruchtbaarheidsonderzoek
- Het identificeren van de dieren moet worden gebruikt voor de studie van de vruchtbaarheid. Ervoor zorgen dat de dieren seksueel volwassen (stap 1). Een typisch gebruikte leeftijdscategorie instellen een vruchtbaarheidsonderzoek in muizen is 10-16 weken oud, een leeftijd waar seksuele rijping is voltooid in de meest experimentele omstandigheden.
- Op een schoon tafel, plaatst u de kooi van de fokkerij in stap 2.3 voorbereid.
- Vangen en houd de muis.
- Een gehandschoende hand in de kooi van de muis langzaam te introduceren. Laat de hand in de kooi voor een korte periode van tijd (~ 5-30-s), waardoor de muizen aan te passen aan de geur van de handschoen en een hand. Vermijd hectische en schokkerige bewegingen.
- Verlaag de holle hand dicht bij de bodem van de kooi en het langzaam benadering van de muizen. Zij zullen weglopen. Wanneer ze worden uitgevoerd over de hand, overlappen de staart van een muis tussen duim en wijsvinger.
- Til de muis door de staart voor 2-3 s. Als de muis langer worden gehouden moet, vasthouden aan de staart en plaatst u de muisaanwijzer in de holle hand handhaving van de greep op de staart.
- Pipetteer 1 mannelijke en daarna 1 vrouwelijke in de fok kooi door hen te houden door de staart (stap 3.3). Ervoor zorgen dat de vrouwtjes in de dezelfde Oestrische fase bij het opzetten van de bepaling van de vruchtbaarheid. Bepaal de oestrische fase van de vrouwtjes door een vaginaal uitstrijkje uit te voeren zoals beschreven in stap 1.7.
- Sluit de kooi en ervoor zorgen dat de muizen voedsel, water en nesten materiaal hebben. Bevestig de kooi-kaarthouder met de kaart van de kooi naar de kooi.
- Plaats de fok kooi op het rek behuizing. De fok kooi zo ongestoord mogelijk verlof voor de volledige duur van de studie van de vruchtbaarheid. Het gedrag van de studie van de vruchtbaarheid voor 30 dagen. Voor elk paar fokken, gedetailleerde registers bijhouden en noteer 1) de datum waarop die de paring is ingesteld, 2) de datum nesten zijn geboren en 3) het aantal pups geboren, met inbegrip van dode en levende pups. Nest controles dagelijks gedurende de studie uit te voeren.
- Verlengen van de vruchtbaarheid studie voor een extra 30-60 dagen indien geen of een zwak effect op de vruchtbaarheid is gevestigd in stap 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde resultaten zijn uit twee verschillende transgene muismodellen waar de transcriptie factor ventrale anterior homeobox 1 (Vax1) in het hele lichaam op één allel, aangeduid als de heterozygote muizen (HET)13of Vax1 is verwijderd voorwaardelijk is verwijderd binnen GnRH neuronen22, hier genoemd voorwaardelijke KO (cKO). Voorafgaand aan het vruchtbaarheidsonderzoek instelt, is het belangrijk om te bevestigen pubertijd aanvang in alle de muizen.
Ten eerste, de dag en het gewicht op de vaginale opening en preputiale scheiding werden opgericht. In de HET muizen, vaginale opening en preputiale scheiding plaatsgevonden op dezelfde leeftijd en gewicht als in de controle-muizen (figuur 3A en F, respectievelijk). In tegenstelling, vaginale opening preputiale scheiding waren aanzienlijk vertraagd in cKO vrouwtjes en mannetjes en verhoogd lichaamsgewicht is gekoppeld (figuur 3B en G, respectievelijk). Begin van de pubertijd is tot op zekere hoogte lichaamsgewicht is gekoppeld, en dit geldt met name in vrouwen23. Om te bepalen als de vertraging bij de vaginale opening en preputiale scheiding werd geassocieerd met een vertraging in de aanwinst van het gewicht, het lichaamsgewicht op de gemiddelde leeftijd van de vaginale opening en preputiale scheiding in besturingselementen (4,5 weken van leeftijd) was ten opzichte van het lichaamsgewicht in cKO bij mannen en vrouwtjes op 4,5 weken leeftijd. Op de leeftijd van 4,5 weken hadden vrouwelijke besturingselementen en cKO vergelijkbare lichaamsgewicht (Figuur 3 c), terwijl cKO mannen iets zwaarder dan controles (Figuur 3 H waren). Dit geeft aan dat de vertraging bij de vaginale opening en preputiale scheiding in cKO niet gekoppeld aan een vertraging in gewichtstoename is.
Vaginale opening is een vroege marker van seksuele rijping en eerste estrus een indicator die de eerste ovulatie heeft plaatsgevonden, een marker van voltooiing van puberteit17. Om te bepalen als HET en cKO vrouwtjes eerste estrus op de dezelfde leeftijd en gewicht als besturingselementen bereikt, werden vaginale uitstrijkjes uitgevoerd dagelijks vanaf de dag van de vaginale opening tot eerste estrus (figuur 3E en 3D). In de HET muizen, zijn de eerste estrus en het gewicht op de eerste estrus was vergelijkbaar tussen besturingselementen en HETs (figuur 3D). In tegenstelling, cKO niet verlopen via de oestrische cyclus en had geen eerste estrus op de leeftijd van 80 dagen (de 3E figuur). Deze vertraging was niet te wijten aan verminderd lichaamsgewicht (figuur 3E).
De HET muizen met bevestigde pubertijd begin werden gebruikt om het vruchtbaarheidsonderzoek instellen. De bepaling van de vruchtbaarheid werd opgericht in 12 uur licht en 12 h donkere omstandigheden (LD12:12) in transgene muizen op een C57BL/6J genetische achtergrond. De muizen waren de leeftijd van 10-16 weken aan het begin van het experiment. Vier groepen van muizen werden bestudeerd: controle verparingen (WTxWT), controle van de mannen met HET vrouwtjes (WTxHET), HET mannetjes met WT vrouwtjes (HETxWT) en HET mannetjes met HET vrouwtjes (HETxHET). Ten eerste, het aantal nesten gegenereerd in 3 maanden werd vastgesteld. Controle verparingen (WTxWT) gegenereerd een gemiddelde van 2,8 nesten in 3 maanden, die vergelijkbaar is met HET mannetjes gekoppeld besturingselement vrouwtjes (HETxWT paring, figuur 4A). HET koeien betreft, of gekoppeld aan een mannelijke WT (control) of een mannelijke, HET gegenereerd aanzienlijk minder nesten in de 3 maanden vruchtbaarheidsonderzoek, onthullend dat HET vrouwtjes basale13 zijn. Om te illustreren het belang van de bevestiging van de pubertijd begin vóór het opzetten van een test van de vruchtbaarheid, werd reproductieve bevoegdheid beoordeeld in cKO muizen, waar de mannen had vertraagd preputiale scheiding (Figuur 3 g) en de vrouwtjes hebben niet hun eerste Estrus door leeftijd (figuur 3E) van 80-dagen. Het vruchtbaarheidsonderzoek opgericht > 1 week na mannen preputiale scheiding hadden, en bij vrouwen op > 80 dagen oud. Tijdens de 70 dagen vruchtbaarheidsonderzoek, controle verparingen gegenereerd een gemiddelde van 2.2 nesten, overwegende dat geen nesten werden gegenereerd op basis van de vrouwelijke cKO gecombineerd met een mannetje WT of het cKO mannetje gekoppeld aan een besturingselement (WT) vrouw (figuur 4B), waaruit blijkt dat deze muizen zijn onvruchtbaar5,22.
We registreerden beter karakteriseren het fenotype van de vruchtbaarheid van de vrouwtjes HET, het aantal dagen dat het duurde tot de eerste nestje. WTxWT verparingen gegenereerd hun eerste nest in een gemiddelde van 22 dagen (figuur 4C), die vergelijkbaar was met HET mannetjes WT vrouwtjes gekoppeld. HET vrouwtjes gecombineerd met WT mannetjes nam een gemiddelde van 58 dagen tot hun eerste nestje, die vergelijkbaar met HETxHET verparingen (figuur 4C was). De vertraging bij het genereren van het eerste nestje van de vrouwtjes HET was echter zeer heterogeen, en vertraagde meer in HETxHET verparingen, suggereren een halve doordringendheid van het fenotype, en een bijdrage van de man HET naar de subfertility waargenomen in HETxHET verparingen13 .
Evaluatie van de grootte van het nest kan geven belangrijke informatie over de ovulatie/implantatie en sperma productie. De gemiddelde grootte van de eerste 3 nesten werd vastgesteld. Interessant is dat alle paring combinaties (WTxHET, HETxWT, HETxHET) geproduceerd aanzienlijk kleinere nesten in vergelijking met besturingselementen (WTxWT, Figuur 4 d), waaruit blijkt dat zowel mannelijke als vrouwelijke HET muizen zijn basale.
Figuur 1: de hypothalamische-hypofyse-gonadale as beheerst seksuele rijping en reproductie. Op de top van de reproductieve-as zijn de hypothalamische kisspeptin neuronen (gele cirkels) en gonadotropin - releasing hormoon (GnRH) neuronen (groene cirkels). Gedurende de jonge (prepuberale) vrij kisspeptin neuronen weinig kisspeptin op GnRH neuronen. Na het begin van de pubertijd, wordt kisspeptin release op GnRH neuronen (na pubertijd) aangevuld. Verhoogde GnRH release in de late jonge periode verhoogt drastisch luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) vrijlating uit de hypofyse, wat leidt tot gonadale rijping en reproductieve functie in de volwassenheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: bepaling van de pubertijd aanvang in muizen. Een externe marker van pubertijd intreden in muizen is (A) preputiale scheiding van de mannelijke kandidaten, en vaginale opening in de vrouwtjes. Schaal bar = 1 cm. (B) voorbeeldafbeeldingen van vaginale lavage gebruikt om te bepalen van de eerste estrus. Dia's werden counterstained voor 30 s met 0,1% methyleenblauw, airdried en waargenomen bij 20 X vergroting. Zwarte pijlen geven aan genucleëerde epitheliale cellen, gele pijlen met zwarte omtrek geven leukocyten en witte pijlen geven cornified epitheliale cellen. Eerste estrus vond plaats op dag 10 na vaginale opening. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve gegevens die kunnen worden gegenereerd uit een onderzoek van het begin van de pubertijd. (A, B) Vaginale opening en gewicht bij vaginale opening in de transgene muismodellen. (C) gewicht op 4,5 weken in controle en cKO vrouwtjes. (D, E) Leeftijd en gewicht op eerste estrus. (F, G) Leeftijd en gewicht op preputiale scheiding. (H) gewicht op 4,5 weken in controle en cKO mannetjes. Gegevens vertegenwoordigen middelen ± SEM. N = 5-10 per groep, statistische analyse van Student-t-test. p< 0,01; p< 0,001. Deze cijfers zijn gewijzigd van eerdere publicatie13,22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve analyse uit een studie van de vruchtbaarheid van transgene muizen. Vruchtbaarheid beoordeling van (A) Vax1 HET muizen en (B) cKO werd uitgevoerd in Maagd 10 - tot 16-weken oude muizen en het aantal nesten opgenomen in de aangegeven termijnen. Gegevens vertegenwoordigen middelen ± SEM. statistische analyse werd uitgevoerd door one-way ANOVA gevolgd door Dunnett van meerdere vergelijkingstest. * p< 0,05; p< 0,001. (C) het aantal dagen tot de eerste nestje (n = 5-12), en (D) de draagstoel van de gemiddelde grootte van de eerste drie nestjes (n = 10-13) werd bepaald. Gegevens vertegenwoordigen middelen ± SEM. statistische analyse werd gedaan door Student-t test ten opzichte van WT x pm *p< 0,05; p< 0,01. Deze cijfers zijn gewijzigd van eerdere publicatie13,22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: opzetten van een test van de vruchtbaarheid. (A) voorbeeld van het fokken van de regeling en voorgestelde aantal dieren nodig voor een test van de vruchtbaarheid. Het totale aantal dieren dat nodig is voor een studie met 2 voorwaarden zoals een besturingselement versus KO of besturingselement dieet versus hoog vet dieet waar de vruchtbaarheid is beoordeeld in zowel de mannetjes als de vrouwtjes is: 2 muizen per paring (1 man x 1 vrouw) x 8 dieren per groep x 2 voorwaarden x 2 geslacht s (om te evalueren zowel vrouwelijke als mannelijke vruchtbaarheid) = totaal 64 dieren per studie. Als de mannelijke en vrouwelijke vruchtbaarheid studie parallel wordt gedaan, kan een set van besturingselement x besturingselement verparingen meestal dienen te vergelijken beide de impact op de mannelijke en vrouwelijke voortplanting. (B) bij het opzetten van een test van de vruchtbaarheid, moeten de muizen gebruikt hebben geslachtsrijp. Verschillende stammen van muizen hebben verschillende kenmerken van de reproductieve en geslachtsrijp op verschillende leeftijden24. Zie voor informatie over ratten, eerdere publicatie25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het algemene welzijn van de muizen is essentieel voor een succesvolle vruchtbaarheid assay21. Bij het uitvoeren van een test van de vruchtbaarheid, is het belangrijk om niet fysiek controleren op de muizen elke dag omdat dit leiden stress tot kan. Verder voorkomen dat frequente kooi veranderingen, zoals deze ook stressvolle zijn. Idealiter zal de kooi wijzigingen niet meer dan 1 - 2 keer per week moet gebeuren. Blootstelling aan licht tijdens de donkere fase impact negatieve fokkerij in nachtelijke knaagdieren. Verrichten niet zwenking voort verlichting in de kamer van de fok tijdens de donkere uren. Als toegang tot de kamer tijdens de donkere uren vereist is, gebruikt u dim Roodlicht verlichting. Een ander stressor is de aanwezigheid van buitensporige geuren, trillingen of lawaai in het vivarium voor geheel of gedeeltelijk van de studie. Om te helpen verlichten stress en muis welzijn verbeteren en kweken, geven de muizen nesten van materiële of andere soorten van de verrijking. Nest gebouw is een belangrijk probleem in muizen en fokken succes zal toenemen. De nesten ook toestaan de muizen een plek om te verbergen en te spelen. Gezond en goed gevoed dieren RAS goed, daarom is het belangrijk om ad libitum toegang tot hoge kwaliteitsvoedsel en water. Deze muizen uitsluiten de studie als fok paren begint te vertonen symptomen van ziekte, zoals dermatitis (frequent in C57BL/6J), tandheelkundige malocclusie of anderzijds. Bovendien, als de studie wordt gedaan in immunodeficiëntie muizen, is het sleutel dat de muis kamer is schoon voor het behoud van de vruchtbaarheid.
Als u wilt instellen op de juiste wijze een vruchtbaarheidsonderzoek, is het belangrijk om te beslissen als het onderzoek zal worden uitgevoerd in Maagd muizen of bewezen kwekers evenals zo zorgvuldig de muizen gebruikt voor controle verparingen selecteren. Controle verparingen moet worden uitgevoerd in parallel met de experimentele fokkers. Dit is noodzakelijk als onbekende of onverwachte stressoren en veranderingen in de omgeving kunnen leiden tot veranderingen in het kweken van tarief. Controle verparingen zijn bij voorkeur samengesteld uit nest stuurlieden met de experimentele muizen (figuur 5A). Dit is vooral belangrijk wanneer het vruchtbaarheidsonderzoek is gedaan in muizen met gemengde genetische achtergrond wegens de grote verschillen in de fokkerij kenmerken tussen muis stammen (figuur 5B).
Identificatie van het fenotype van een subfertility kan lastig zijn als gevolg van de langdurige lengte van de studie, en de noodzaak om aanvullende parameters te analyseren te onthullen de oorzaak. De muis van HET in het representatieve gegevens is een goed voorbeeld van een bescheiden subfertility fenotype (Figuur 4), en de uitgebreide analyse vereist ter aanduiding van de mannelijke subfertility. Zoals blijkt uit de Resultaten van de vertegenwoordiger (Figuur 3 en 4), kan normale begin van de puberteit (figuur 3A, Den F) worden geassocieerd met zowel mannelijke als vrouwelijke subfertility (figuur 4A, C, D ). In dit geval de muizen waren alleen sub vruchtbaar, en dus de lengte van de studie werd verlengd tot 120 dagen. Dit is belangrijk, als een kortere vruchtbaarheidsonderzoek (bv., 60 dagen) niet geweest kundig voor onthullen het fenotype. De mannelijke subfertility was bescheiden, en eerst geopenbaard wanneer HET mannen werden gecombineerd met HET vrouwelijke dieren betreft, die ook basale (figuur 4A waren). Inderdaad, de subfertility van HET mannetjes werd bevestigd bij de beoordeling van de gemiddelde grootte van nesten gewenste (Figuur 4 d). Follow-up studies bevestigd van de mannelijke subfertility en een slechte zaadkwaliteit bij de mannetjes HET met een ~ 80% vermindering in motile sperma13geopenbaard.
Wanneer het uitvoeren van een vruchtbaarheid en pubertijd begin studeren in muizen met een grote vertraging in de pubertijd begin (> 5 dagen), het is belangrijk dat de verschillende factoren die pubertijd begin26regelen. Hoewel vaginale opening en eerste estrus meestal gelijktijdig bij ratten gebeuren, eerste estrus in muizen treedt meestal op ~ 10 dagen na vaginale opening25,27. Daarom is het raadzaam om ervoor te zorgen dat zowel de vaginale opening en de eerste estrus worden vastgesteld bij het werken in zowel de ratten en de muizen18,28. Begin van de pubertijd is gekoppeld aan de status van de metabolische en lichaamsgewicht bij vrouwtjes en in kleine mate van mannetjes1,,7,,9,29, en als zodanig een behandeling of een genetische mutatie vertragende dierlijke groei zal in sommige gevallen leiden tot een vertraagde pubertijd begin. Om te bepalen als de vertraging/vooruitgang in de pubertijd begin kan gepaard gaan met snelle/langzame groei, is het belangrijk te wegen van de muizen dagelijks tijdens de beoordeling van pubertijd intreden. Zoals te zien in figuur 3B en C, evenals G en H, de vertraging bij het begin van de pubertijd niet gekoppeld verminderd lichaamsgewicht, maar was een ware vertraging in pubertijd begin, zoals bevestigd door gonadale histologie en circuleren hormoon niveaus van22. Een van de belangrijkste beperkingen van het gebruik van de preputiale scheiding en vaginale opening als markers van pubertijd begin is dat beide vaak zal gebeuren uiteindelijk na verloop van tijd als gevolg van mechanismen andere dan verhoogde activiteit van de reproductieve as18, 30 , 31 (Figuur 1). Een voorbeeld hiervan is de vertraagde vaginale opening in de cKO vrouwtjes (figuur 3B). Nooit worden de cKO-vrouwtjes vruchtbaar als gevolg van afwezigheid van ovulatie22 (figuur 3E). Inderdaad, verdere studies evalueren van hormonale niveaus en gonadale histologie van de cKO muizen aangetoond dat deze muizen nooit voltooid van puberteit en onvruchtbaar22 (figuur 4B waren). Dit toont de limiet van het gebruik van externe markeringen om te bepalen van de begin van de pubertijd. Voltooiing van puberteit en bereiken van seksuele volwassenheid vereist verhoogde GnRH release en activering van de reproductieve as (Figuur 1), en controleer volledig seksuele volwassenheid zowel gonadale morfologie en circuleren hormoonniveaus moeten worden geëvalueerd 22 , 31. bij mannetjes meten van testosteron en het evalueren van zaadblaasje grootte en morfologie van de testis en grootte naast de kwaliteit van het sperma zal bevestigen puberteit was bereikt16,22,32. Bij vrouwtjes, het meten van progesteron en oestrogeen niveaus in combinatie met het gewicht van de baarmoeder en eierstokken en morfologie zal bevestigen de voltooiing van de puberteit17,19,22,33.
Nest grootte kan invloed hebben op zowel de drachtduur en de leeftijd bij aanvang van de pubertijd. Meeste muis stammen hebben een draagtijd van 18-22 dagen. Echter, als de moeder een groot nest verwacht is, de draagtijd neigt te zijn van verminderde34,35. Aan de andere kant, als de moeder is een vorig nestje verpleging, kan dit resulteren in een verlenging van de zwangerschapsduur periode5. Pups in grote nesten hebben ook de neiging hebben vertraagd begin van de pubertijd. Dit wordt veroorzaakt door hun groei wordt iets vertraagd1,9,34,35. Als een vruchtbaarheidsonderzoek wordt uitgevoerd en een van de groepen van de muis (controle of experimentele) produceert zeer grote nesten, wordt u geadviseerd te homogeniseren nest maten, ook wel genoemd ruimen, zodat de bestudeerde nestjes hebben van vergelijkbare grootte.
Reproductie kan alleen worden beoordeeld in vivo als gevolg van de verschillende organen die betrokken zijn bij reproductie (Figuur 1) en de uitgebreide feedback-mechanismen tot regeling van de reproductieve as3. Bepaalde aspecten van reproductieve bevoegdheid kunnen snel worden geëvalueerd door middel van een vaginale aansluiten assay, waar de capaciteit van het mannetje het vrouwtje mount en laat een fysieke stekker in de vagina13,36wordt waargenomen. Hoewel dit is een nuttige aanpak van mannelijk seksueel gedrag beoordelen, dit type onderzoek is niet toegestaan de opsporing van kleine problemen in reproductie, noch het beoordeelt onderhouden vruchtbaarheid voor een lange periode van tijd of resulterende nest grootte en ouderlijke gedrag. Het protocol hier beschreven biedt talrijke voordelen ten opzichte van een aansluiten assay, de belangrijkste zijn het vermogen om te identificeren zowel kleine en grote gevolgen voor reproductieve bevoegdheid in mannetjes en vrouwtjes (Figuur 4).
Vruchtbaarheid vermindert met de leeftijd, en daarnaast de vrouwelijke oestrische cyclus wordt langer en onregelmatige tijdens veroudering5,28. Het wordt daarom aanbevolen om te beginnen een vruchtbaarheidsonderzoek in jonge en seksueel volwassen dieren. Een typisch gebruikte leeftijdscategorie instellen een vruchtbaarheidsonderzoek is 10-16 weken oud. Het is echter belangrijk om vertrouwd te zijn met de specifieke reproductieve kenmerken van de stam van de muis gebruikt in de studie, zoals grote verschillen in de voortplanting en seksuele volwassenheid bestaan tussen verschillende muis of rat stammen (figuur 5B). Meer informatie over reproductieve kenmerken kan worden gevonden in de JAX muis Phenome Database https://phenome.jax.org/. Uitvoeren van een langere (> 4 maand) vruchtbaarheid studie heeft het voordeel dat het kundig voor speurder vroege reproductieve daling, waar de muizen kunnen fokken normaal voor de eerste 1-2 maanden van de bepaling van de vruchtbaarheid, maar dan heb een vroege daling in de voortplanting beginnen voordat 6 maanden oud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Ik dank de auteurs bij te dragen tot het eerste werk dat de basis van deze publicatie is. Dankzij Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan en Erica L. Schoeller voor help voorbereiden van het manuscript. Dank aan Jessica Sora Lee en Austin kin voor technische bijstand met het manuscript. H.M.H. werd gesteund door Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development van de National Institutes of Health onder Award nummer R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
