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Biology

Détermination de la compétence reproduction en confirmant début pubertaire et effectuer un test de fertilité chez des Rats et des souris

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

Beaucoup de traitements et de mutations génétiques incidence sur le calendrier de la maturité sexuelle et la fertilité. Ce protocole décrit une méthode non invasive d’évaluation début pubertaire chez les souris et les rats avant la mise en place d’une étude de fertilité chez des animaux sexuellement matures.

Abstract

Évaluation de la compétence de reproduction est essentielle pour comprendre l’impact d’un traitement ou de la manipulation génétique sur l’axe de reproduction, également appelé l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. L’axe de reproduction est un intégrateur de clés d’entrée interne et environnementaux s’adapter à des conditions favorables pour la reproduction, la fertilité. Avant de se lancer dans une étude de fertilité chez des rats et des souris, la maturité sexuelle est évaluée afin d’exclure la possibilité que les phénotypes de reproduction observés sont dus en retard ou absent début pubertaire. Ce protocole décrit une approche non invasive pour évaluer le début pubertaire chez les mâles grâce à la détermination de séparation préputiale et chez les femmes à travers l’orifice vaginal et premier oestrus. Après la confirmation de l’achèvement de la puberté et l’atteinte de la maturité sexuelle, une étude de fertilité peut être lancée. La procédure décrit les conditions de reproduction optimales pour souris et rats, comment mettre en place une étude sur la fertilité et quels sont les paramètres pour évaluer et déterminer si le traitement ou la délétion du gène a un impact sur la fertilité.

Introduction

La transition à la puberté est nécessaire pour atteindre la maturité sexuelle et génésique compétence. La transition pubertaire et le maintien de la fertilité à l’âge adulte est réglementée par l’axe de reproduction, également appelé l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (Figure 1). Le moment de déclenchement pubertaire et l’entretien de la fertilité sont étroitement contrôlées par des facteurs internes aussi bien qu’environnementales pour augmenter les chances de survie des parents et la progéniture de1,2. Ce protocole prévoit une approche non invasive pour déterminer le début pubertaire chez les souris et les rats pour confirmer la maturité sexuelle avant la mise en place d’une étude de fertilité pour évaluer la compétence de reproduction.

Une étude de fertilité est effectuée chez des animaux sexuellement matures et peut être lancée après que les animaux sont passés par la puberté. Avant début pubertaire, l’axe de reproduction est quiescente, et le principal moteur de la maturation sexuelle, la gonadolibérine (GnRH), est sorti sur l’hypophyse en quantités insuffisantes pour initier la puberté (Figure 1). Début pubertaire est un processus complexe qui se traduit par une libération accrue de GnRH dans l’éminence médiane. GnRH favorise l’hormone lutéinisante (LH) et folliculo-stimulante (FSH) sécrétion par l’hypophyse, deux hormones essentielles pour la maturation des gonades et la fonction de reproduction (Figure 1)3,4,5 .

Insultes à l’axe de reproduction entraînent une fertilité réduite et peuvent aussi avance ou le retard de déclenchement pubertaire. Conditions connues pour influer sur le moment de déclenchement pubertaire et reproduction compétence incluent l’exposition aux produits chimiques6,7, une augmentation/diminution de corps poids1,8, changements de perturbation endocrinienne jour longueur2,9 et mutations génétiques10,11,12,13,14,15.

L’apparition de la maturité sexuelle est une étape essentielle qui doit être achevée avant la mise en place d’un test de fertilité. Les avantages de la détermination de début pubertaire par séparation du prépuce, ouverture du vagin et premier oestrus, sont les caractéristiques non invasif de ces procédures, puisqu’ils ne nécessitent pas de prélèvement de sang ou de sacrifice des animaux16, 17.

Après que le début pubertaire est déterminée, correctement mise en place d’une étude de fertilité fournira des informations importantes concernant l’intégrité de l’axe de la reproduction et a habituellement le deuxième avantage de produire des animaux de laboratoire pour poursuivre ses études (raffinement) 18. l’installation d’étude de fertilité décrite dans le présent protocole peut détecter mineures et majeures des déficits de compétence reproducteur mâles et femelles. Principaux paramètres évalués comprennent 1) temps de la première portée, 2) nombre de portées générées dans une taille donnée de la période de réalisation et de la litière 3). Enfin, les recommandations sur le type d’études qui peuvent être menées pour identifier la cause des troubles de la fertilité de suivi sont incluses.

Le protocole décrit se réfère à des souris et les données représentatives représentent les travaux effectués chez des souris transgéniques. Cependant, tous les protocoles inclus sont également valables chez les rats.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’utilisation de la Michigan State University et d’institutionnels animalier et menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Déterminez le début pubertaire

  1. Suivez les directives institutionnelles pour l’habillement, au minimum, il est nécessaire de porter une blouse propre et gants propres. Toujours manipuler les souris portant des gants propres.
  2. Préparer la zone de travail en plaçant un coussin sur la table.
    1. Placez une cage propre souris avec la grille vers le haut sur le pavé.
    2. Mettre en place une échelle dans la zone de travail. Placer un bécher propre 500 – 1000 mL sur l’ampleur et la tare.
    3. Placer une feuille à côté de l’aire de travail au poids record et séparation préputiale, ouverture vaginale ou premier oestrus.
  3. Identifier les souris pour l’étude. Effectuer des inspections quotidiennes pour début pubertaire jusqu'à ce que la puberté est atteinte. Procéder à l’inspection en même temps de la journée tout au long de l’étude. Début pubertaire peut survenir dès le jour après la naissance, 11 et 12,19, cependant, dans des configurations plus expérimentales, suivi début pubertaire commence à ~ 22 jours.
  4. Placer la cage de la souris dans la zone de travail (étape 1.2). Ouvrez la cage et placez le couvercle, la bouteille d’eau et le titulaire de la nourriture sur la table.
  5. Déterminer la séparation du prépuce chez les souris mâles.
    1. Tout en maintenant la souris par la queue, placez-le sur le dessus de cage souris propre de l’étape 1.2.1. Tout en maintenant doucement sur la queue, laissez la souris explorer la grille du haut cage pendant ~ 5 s.
    2. Tirez doucement la queue en arrière ; Cela se traduit généralement par l’animal, aller de l’avant tout en tenant à la grille avec ses pattes avant. Approche de l’autre main sur la peau à proximité par le cou et les oreilles.
    3. Saisissez la peau entre les épaules et le cou avec le pouce et l’index. Il est important d’obtenir une bonne prise de la peau, car il va empêcher la souris de tourner sa tête de mordre.
    4. Prenez la peau sur le dos avec les doigts restants et maintenez-le en pressant contre la main. Tenez fermement sans entraver la respiration, de sang écoulement, ou dommageable d’os, des muscles ou de peau. Tourner à la main pour exposer le ventre de la souris, tout en soutenant le dos de la souris dans la paume de la main.
    5. Avec la main libre, doucement repousser la peau autour du pénis sans forcer. À la séparation du prépuce, la peau préputiale glisse vers l’arrière, exposant ainsi le gland du pénis (Figure 2 a, flèche indiquant séparation préputiale). Enregistrer la présence ou l’absence de séparation préputiale.
    6. Peser la souris en le plaçant délicatement dans le bécher de 500-1000 mL de l’étape 1.2.2 et consignez le poids.
    7. Réintroduire la souris dans la cage de logement en tenant le bécher 0-2 cm sur le plancher de la cage et lentement basculer dans le bécher permettant la souris sortir par ses propres. Nettoyer le bol avec l’eau et un détergent doux et séchez avant de retourner à l’échelle et le tarage de la balance.
  6. Déterminer l’ouverture vaginale chez les souris femelles.
    1. Placer une boule de coton, gobelet et une bouteille d’eau stérile dans la zone de travail (étape 1.2). Versez l’eau dans le bécher. Humidifier la boule de coton avec l’eau stérile et placez-le à côté le dessus de la cage de l’étape 1.2.1.
    2. Placer la cage de la souris dans la zone de travail (étape 1.2) et passer la souris de sa cage maison vers le haut de la cage (étape 1.2.1) en le tenant à la base de la queue. Tirez doucement la queue afin d’encourager un mouvement vers l’avant de la souris.
    3. Soulevez la queue tout en soutenant les hanches avec les doigts libres. Permettre à des membres postérieurs de rester en contact avec le dessus de la cage. Si la souris se déplace trop, tenez-le dans la main comme décrit dans les étapes 1.5.1-1.5.4.
    4. Nettoyer doucement la vulve avec la boule de coton humidifié d’eau de l’étape 1.6.1. Utilisez une boule de coton humidifié propre pour chaque souris. Pour déterminer l’ouverture vaginale, d’examiner la vulve et de déterminer si le vagin est complètement ouvert (Figure 2 a, femelle ouverture vaginale).
    5. Compte rendu si ouverture vaginale s’est produite. Peser la souris et remettez-le dans la cage, comme décrit dans les étapes 1.5.6-1.5.7.
  7. Premier oestrus un indicateur de la première ovulation.
    1. Placer un bécher avec l’eau stérile, une lame de verre étiquetées et une pipette de 200 µL avec un embout propre dans la zone de travail (étape 1.2).
    2. Tenir la femelle comme décrit dans l’étape 1.6.2-1.6.3. Placer l’embout de la pipette contenant environ 50 µL d’eau stérile à l’ouverture du vagin.
    3. Doucement, rincer les cellules de la paroi vaginale en introduisant et en résorbant ~ 50 µL d’eau 2 - 4 fois. Etaler le contenu de la pipette sur une lame de microscope de verre étiquetées.
    4. Observer attentivement la morphologie cellulaire sur un microscope à fond clair à l’aide d’un 10 X ou 20 X, objectif ou laisser l’airdry frottis pendant environ 1 h et puis contre-coloration avec une solution de bleu de méthylène de 0,1 % (dissoute dans ddH2O) (Figure 2 b). Pour contre-coloration, trempez la lame séchée dans la solution de bleu de méthylène de 0,1 % pour ~ 30 s. Sécher l’air de glisser pendant 1 h.
    5. Observer les diapositives de l’étape 1.7.4 à un microscope à champ lumineux à 10 X ou 20 X. Mettre en place la phase du cycle oestral (Figure 2 b)20 en observant la morphologie cellulaire qui permet de distinguer les quatre étapes distinctes du cycle oestral (Figure 2 b).
      Remarque : Le métoestrus se caractérise par un mélange de cellules épithéliales squameuses cornéocytaire et leucocytes, dioestrus par les leucocytes, pro-oestrus par un mélange de leucocytes et cellules épithéliales nucléées et oestrus par les cellules épithéliales cornéocytaire (Figure 2 b) 20.
    6. Noter le poids du corps et regagner sa cage maison de la souris comme décrit dans les étapes 1.5.6-1.5.7. Frottis vaginal sont terminent le jour quand la souris a son premier oestrus (Figure 2 b).

2. souhaitable salle Conditions de reproduction

  1. S’assurer que la chambre d’élevage a une température d’environ 20-24 ° C, avec 55 ± 10 % d’humidité et homogène la salle lumière d’une intensité de ~ 300-400 lux à 1 m environ au-dessus de l' étage21. Cette intensité lumineuse permet l’intensité moyenne cage souhaitable de 25-80 lux. Pour tester l’intensité de la lumière, utiliser un posemètre.
  2. Un système automatisé permet de contrôler l’éclairage dans la salle de reproduction pour s’assurer le moment approprié de l’éclairage tout au long de l’expérience. Conditions optimales de longueur de la journée afin d’évaluer la fertilité dans la gamme de rongeurs d’une journée de 12 h (12 h de lumière et l’obscurité de 12 h, LD12:12), aux conditions « estival » avec 14 h de lumière et 10 h d’obscurité (LD14:10)21.
  3. Préparer des cages d’élevage.
    1. Préparer une cage propre souris avec couvercle, eau, nourriture, literie et de nidification par couple nicheur.
    2. Remplir les cartes de cage avec toutes les informations requises, y compris le sexe, date de naissance, souche de souris et la date où l’accouplement est mis en place.

3. étude de fertilité

  1. Identifier les animaux destinés à être utilisés pour l’étude de fertilité. Veiller à ce que les animaux sont sexuellement matures (étape 1). Une tranche d’âge généralement utilisé pour mettre en place une étude sur la fertilité chez la souris est de 10 à 16 semaines d’âge, un âge où la maturation sexuelle est terminée dans des conditions plus expérimentales.
  2. Sur une table propre, placez la cage de reproduction préparée à l’étape 2.3.
  3. Attraper et maintenez le pointeur de la souris.
    1. Introduire lentement une main gantée dans la cage de la souris. Laisser la main dans la cage pendant une courte période de temps (~ 5-30 s), ce qui permet des souris pour s’adapter à l’odeur du gant et main. Éviter les mouvements trépidantes et saccadés.
    2. Abaisser la main creuse près du fond de la cage et approcher lentement à la souris. Il vont s’enfuir. Lorsqu’ils sont exécutés sur la main, piège à la queue d’une souris entre le pouce et l’index.
    3. Soulevez la souris par la queue pour 2-3 s. Si la souris doit être maintenu plus, agripper la queue et placer la souris dans la main creuse conservant la mainmise sur la queue.
  4. Transférer 1 mâle et par la suite 1 femelle dans la cage d’élevage en les tenant par la queue (étape 3.3). Veiller à ce que les femelles sont en phase d’oestrus même lorsque vous configurez le test de fertilité. Déterminer le stade de œstrus des femelles en réalisant un frottis vaginal comme décrit dans l’étape 1.7.
  5. Fermer le boîtier et veiller à ce que les souris ont matériel alimentaire et hydrique et imbrication. Visser le support de carte de cage avec la carte de la cage sur la cage.
  6. Placer la cage de reproduction sur la grille du logement. Laisser la cage de reproduction aussi intacte que possible pendant toute la durée de l’étude de la fertilité. Procéder à l’étude de fertilité pendant 30 jours. Pour chaque paire de reproducteurs, des registres détaillés et note 1) la date de que l’accouplement est mis en place, 2) la date portées naissent et 3) le nombre de chiots nés, dont les petits morts ou vivants. Effectuer des vérifications de la litière par jour tout au long de l’étude.
  7. Prolonger la fertilité étude pour une extension de 30 à 60 jours si aucun ou un faible impact sur la fertilité est établi en étape 3.6.

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Representative Results

Les résultats présentés sont de deux modèles de souris transgéniques différente lorsque la transcription factor boîte homéotique antérieure ventrale 1 (Vax1) a été supprimée dans le corps entier sur un allèle, ici dénommé hétérozygote souris (HET)13, ou Vax1 a été supprimé sous certaines conditions au sein de la GnRH neurones22, ici appelée KO conditionnel (cKO). Avant la mise en place de l’étude de fertilité, il est important de confirmer début pubertaire chez toutes les souris.

Tout d’abord, le jour et le poids à l’ouverture du vagin et de la séparation préputiale ont été établis. Chez les souris HET, ouverture du vagin et la séparation préputiale est survenu au même âge et du même poids que les souris témoins (Figure 3 a et F, respectivement). En revanche, ouverture du vagin et la séparation préputiale étaient significativement retardées chez les mâles et les femelles cKO et associées à une augmentation de poids corporel (Figure 3 b et G, respectivement). Début pubertaire est dans une certaine mesure associée à du poids corporel, et cela est particulièrement vrai dans les femelles23. Pour déterminer si le retard dans l’ouverture du vagin et de la séparation préputiale était associé à un retard dans la prise de poids, le poids du corps à l’âge moyen de l’orifice vaginal et séparation du prépuce chez les témoins (4,5 semaines d’âge) a été comparé à la masse corporelle à cKO chez les mâles et les femelles à 4,5 semaines d’âge. À l’âge de 4,5 semaines, contrôles femelles et cKO avaient poids comparable (Figure 3), tandis que les mâles cKO étaient légèrement plus lourds que les témoins (Figure 3 H). Cela indique que le retard dans l’ouverture du vagin et la séparation préputiale à cKO ne sont pas associées à un retard dans la prise de poids.

Ouverture du vagin est un marqueur précoce de la maturation sexuelle et premier oestrus un indicateur que la première ovulation s’est produite, un marqueur de fin de la puberté,17. Pour déterminer si les femelles HET et cKO atteint premier oestrus au même âge et du poids sous forme de contrôles, les frottis vaginaux ont été effectués tous les jours de la journée d’ouverture du vagin jusqu’au premier oestrus (Figure 3E et 3D). Chez les souris HET, premier oestrus et le poids au premier oestrus était comparable entre les contrôles et HETs (Figure 3D). En revanche, cKO n’a pas progressé au cours du cycle oestral et n’a pas eu de premier oestrus à l’âge de 80 jours (Figure 3E). Ce délai n’était pas en raison de la diminution du poids corporel (Figure 3E).

Les souris HET confirmés début pubertaire servaient à mettre en place l’étude de fertilité. Le test de fertilité a été mis en place dans les 12 h de lumière et d’obscurité 12 h (LD12:12) chez des souris transgéniques sur un fond génétique C57BL/6J. Les souris étaient âgés de 10 à 16 semaines au début de l’expérience. Quatre groupes de souris ont été étudiés : contrôle des accouplements (WTxWT), contrôler les mâles avec des femelles HET (WTxHET), HET avec des femelles WT (HETxWT) et HET les mâles avec des femelles HET (HETxHET). Tout d’abord, le nombre de portées générée en 3 mois a été déterminé. Accouplements de contrôle (WTxWT) généré une moyenne de 2,8 portées en 3 mois, qui est comparable aux mâles HET jumelés avec femelles témoins (HETxWT accouplement, Figure 4 a). Femelles HET, si associé à un mâle de WT (témoin), ou un mâle, HET généré beaucoup moins portées dans l’étude de fertilité de 3 mois, révélant que les femelles HET sont subfertile13. Pour illustrer l’importance de la confirmation de début pubertaire avant la mise en place d’un test de fertilité, compétence de reproduction a été évaluée chez des souris de cKO, où les mâles avaient retardé la séparation préputiale (Figure 3) et les femelles n’ont pas leur premier oestrus en 80 jours d’âge (Figure 3E). L’étude de fertilité a été mis en place > 1 semaine après que les hommes avaient la séparation préputiale et chez les femelles à > 80 jours d’âge. Au cours de l’étude de fertilité de 70 jours, accouplements de contrôle généré une moyenne de 2,2 portées, alors qu’aucun portées ont été générées depuis la cKO femelle jumelé avec un mâle WT, ou le mâle cKO jumelé avec une femelle de contrôle (WT) (Figure 4 b), montrant que ces souris sont infertiles5,22.

Afin de mieux caractériser le phénotype de la fertilité des femelles HET, nous avons enregistré le nombre de jours qu’il a fallu pour produire la première portée. Accouplements de WTxWT généré leur première portée en moyenne 22 jours (Figure 4), qui était comparable aux mâles HET jumelés avec des femelles WT. HET les femelles accouplées avec les mâles WT prenait en moyenne 58 jours pour produire leur première portée, qui était semblable aux accouplements HETxHET (Figure 4). Toutefois, le retard dans la création de la première portée des femelles HET était très hétérogène et retardé davantage dans les accouplements de HETxHET, ce qui suggère une pénétrance semi du phénotype, ainsi qu’une contribution du mâle HET de l’hypofertilité chez les accouplements HETxHET13 .

Évaluer la taille de la portée peut donner des informations importantes concernant la production ovulation/implantation et de sperme. La taille moyenne des 3 premières portées a été déterminée. Fait intéressant, tout accouplement combinaisons (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produits significativement plus petites portées comparativement aux groupes témoins (WTxWT, Figure 4), montrant que les souris mâles et femelles HET sont subfertile.

Figure 1
Figure 1 : l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique contrôles maturation sexuelle et la reproduction. Au sommet de l’axe de reproduction sont les les neurones hypothalamiques kisspeptin (cercles jaunes) et la gonadolibérine (GnRH) neurones (cercles verts). Dans la période juvénile (prépubères), kisspeptin neurones libèrent peu kisspeptin sur les neurones GnRH. Après le début pubertaire, kisspeptin communiqué sur les neurones GnRH est augmentée (post pubertaire). Une libération accrue de GnRH dans la fin de la période juvénile augmente de façon spectaculaire l’hormone lutéinisante (LH) et folliculo-stimulante de la libération d’hormones (FSH) par l’hypophyse, conduisant à la maturation des gonades et la fonction reproductrice à l’âge adulte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : détermination du début pubertaire chez la souris. Un marqueur externe de début pubertaire chez la souris est séparation préputiale (A) chez les mâles et vaginale d’ouverture chez les femelles. Echelle = 1 cm. (B) exemple images de lavage vaginal permet de déterminer le premier oestrus. Diapositives ont été Eosine pour 30 s avec 0,1 % de bleu de méthylène, peaux et observé à un grossissement de 20 X. Les flèches noires indiquent presque les cellules épithéliales, flèches jaunes avec contour noir indiquent leucocytes et flèches blanches indiquent les cellules épithéliales cornéocytaire. Premier oestrus a eu lieu le lendemain 10 ouverture vaginale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : données représentatives qui peuvent être générées à partir d’une étude début pubertaire. (A, B) Ouverture du vagin et le poids à l’ouverture du vagin dans les modèles de souris transgéniques. (C) poids à 4,5 semaines chez les femelles contrôle et cKO. (D, E) Âge et le poids au premier oestrus. (F, G) Âge et le poids à la séparation préputiale. (H) poids à 4,5 semaines chez les mâles contrôle et cKO. Les données représentent des moyens ± SEM. N = 5-10 par le test t de Student-analyse de groupe, statistiques. p< 0,01 ; p< 0,001. Ces chiffres ont été modifiés depuis la précédente publication13,22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : analyse représentative d’une étude de la fertilité des souris transgéniques. Évaluation de la fertilité des souris de HET Vax1 (A) et (B) cKO a été réalisée chez des souris de 10 à 16-week-old virgin, et le nombre de portées enregistrées dans les délais indiqués. Les données représentent des moyens ± SEM. statistique analyse a été réalisée par ANOVA à suivie de test de comparaison multiple de Dunnett. * p< 0,05 ; p< 0,001. (C) le nombre de jours à la première portée (n = 5-12) et (D) la taille des portées moyennes des trois premières portées (n = 10-13) a été déterminée. Les données représentent des moyens ± SEM. statistique analyse a été faite par le test t de Student par rapport au WT x m/m *p< 0,05 ; p< 0,01. Ces chiffres ont été modifiés depuis la précédente publication13,22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : mise en place d’un test de fertilité. (A) exemple de schéma et suggéré nombre d’animaux requis pour un test de fertilité de reproduction. Le nombre total d’animaux nécessaires à une étude avec 2 conditions tels qu’est un contrôle par rapport à une diète KO ou contrôle versus régime riche en graisses où la fécondité est évaluée chez les mâles et les femelles : 2 souris par accouplement (1 mâle x 1 femelle) x 8 animaux par sexe de groupe x 2 conditions x 2 s (pour évaluer la fertilité des mâle et femelle) = total 64 animaux par l’étude. Si l’étude de la fertilité des mâles et femelles se fait en parallèle, un ensemble de contrôle x contrôle accouplements servent habituellement pour comparer les deux les effets sur la reproduction des mâle et femelle. (B) lorsque vous configurez un test de fertilité, les souris utilisées doivent avoir atteint la maturité sexuelle. Différentes souches de souris ont différentes caractéristiques reproductives et atteignent la maturité sexuelle à différents âges,24. Pour plus d’informations sur des rats, voir précédente publication25. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le bien-être global des souris est essentiel pour un succès de fertilité test21. Lorsque vous effectuez un test de fertilité, il est important de ne vérifier pas physiquement sur les souris tous les jours car cela peut causer un stress. Éviter les changements fréquents de cage, car ce sont aussi stressantes. Changements de la cage se fera idéalement pas plus de 1 à 2 fois par semaine. Exposition à la lumière pendant la période d’obscurité un impact négatif sur la reproduction chez les rongeurs nocturnes. Ne pas allumer les lumières dans la salle de reproduction durant les heures d’obscurité. Si l’entrée de la salle est nécessaire pendant les heures d’obscurité, utilisez éclairage de lumière rouge. Un autre facteur de stress est la présence d’odeurs excessives, de vibrations ou de bruit dans le vivarium pour tout ou partie de l’étude. Pour aider à atténuer le stress et améliorer l’élevage et le bien-être de la souris, donner les souris nichant matérielles ou d’autres types d’enrichissement. Construction du nid est un comportement important chez les souris et augmentera le succès de reproduction. Les nids permettent également les souris à un endroit pour se cacher et jouer. Race d’animaux sains et bien nourris bien, donc il est important de fournir un accès ad libitum à haute qualité nourriture et d’eau. Si les couples reproducteurs commencent à montrer des symptômes de la maladie, telles que la dermatite (fréquente chez C57BL/6J), malocclusion dentaire ou autre, exclure ces souris de l’étude. En outre, si l’étude se faite dans des souris immunodéficientes, il est essentiel que la chambre de la souris est maintenue propre à préserver la fertilité.

Pour configurer correctement une étude sur la fertilité, il est important de décider si l’étude sera réalisée en souris vierges ou éleveurs éprouvés ainsi aussi soigneusement sélectionner les souris utilisées pour les accouplements de contrôle. Accouplements de contrôle doit être exécuté en parallèle avec les éleveurs expérimentales. Il est impératif que des agresseurs inconnus ou imprévus et changements dans l’environnement peuvent provoquer des changements dans le taux de reproduction. Accouplements de contrôle sont préférentiellement composés de compagnons de la litière des souris expérimentales (Figure 5 a). Ceci est particulièrement important lors de l’étude de fertilité se fait chez la souris avec le bagage génétique mixte en raison des variations de grandes dans l’élevage des caractéristiques entre les souches de souris (Figure 5 b).

Identifier un phénotype hypofertilité peut être difficile en raison de la durée prolongée de l’étude et la nécessité d’analyser des paramètres supplémentaires à révéler sa cause. La souris HET dans les données représentatives est un bon exemple d’un phénotype d’hypofertilité modeste (Figure 4), et l’analyse étendue nécessaire pour identifier l’hypofertilité masculine. Comme le montre les Résultats de représentant (figures 3 et 4), normale début de la puberté (Figure 3 a, Det F) peut être associé à hypofertilité mâle et femelle (Figure 4 a, C, D ). Dans ce cas, les souris étaient seulement des fertiles, et donc la durée de l’étude a été étendue à 120 jours. C’est important, car une courte étude de fertilité (e.g., 60 jours) n'aurait pas été en mesure de révéler le phénotype. L’hypofertilité masculine était modeste et tout d’abord révélé quand les mâles HET ont été jumelés à HET les femelles, qui ont également étaient subfertile (Figure 4 a). En effet, l’hypofertilité de mâles HET a été confirmée lors de l’évaluation de la taille moyenne des portées sired (Figure 4). Suivi des études ont confirmé l’hypofertilité masculine et a révélé une qualité pauvre de sperme chez les mâles HET, avec une réduction d’environ 80 % de spermatozoïdes mobiles13.

Quand effectuer une fertilité et début pubertaire étudier chez les souris avec un retard important dans le début pubertaire (> 5 jours), il est important de tenir compte des différents facteurs qui régulent début pubertaire26. Bien que l’ouverture du vagin et premier oestrus plus souvent arriver en même temps que chez le rat, premier oestrus chez la souris survient habituellement ~ 10 jours après l’ouverture du vagin25,27. Il est donc recommandé pour s’assurer que l’ouverture vaginale et premier oestrus sont établies lorsque vous travaillez dans les rats et les souris18,28. Début pubertaire est lié au statut métabolique et du poids corporel chez les femelles et à un degré moindre dans les hommes1,7,9,29, et par conséquent, un traitement ou une mutation génétique ralentissant la croissance des animaux seront dans un résultat de cas dans une apparition retardée pubertaire. Pour déterminer si la retard/promotion au début pubertaire peut être associée à croissance rapide/lent, il est important de peser les souris par jour lors de l’évaluation de début pubertaire. Comme on le voit dans la Figure 3 b et C, ainsi que G et H, le délai d’apparition pubertaire n’était pas liée à la réduction du poids corporel, mais a été un vrai retard dans le début pubertaire, tel que confirmé par l’histologie gonadal et hormones en circulation niveau22. Une des principales limites de l’utilisation de séparation préputiale et ouverture vaginale comme marqueurs de début pubertaire est que les deux souvent arrivera finalement au fil du temps en raison des mécanismes autres qu’a augmenté l’activité de l’axe de reproduction18, 30 , 31 (figure 1). Un exemple de ceci est l’ouverture vaginale retardée chez les femelles de cKO (Figure 3 b). Les femelles de cKO jamais devient fertiles en raison de l’absence d’ovulation22 (Figure 3E). En effet, outre les études évaluant les niveaux hormonaux et l’histologie gonadal des souris cKO démontrent que ces souris jamais achevé la puberté et ont été infertiles22 (Figure 4 b). Cela montre la limite de l’utilisation de marqueurs externes pour déterminer le début pubertaire. Achèvement de la puberté et la maturité sexuelle exige une augmentation libération de GnRH et l’activation de l’axe de reproduction (Figure 1), et pour confirmer pleinement la maturité sexuelle tant morphologie gonadique, hormones circulantes doivent être évalués 22 , 31. chez les mâles, mesurant de testostérone et évaluer la taille de la vésicule séminale et morphologie des testicules et en plus la qualité du sperme confirmera la puberté a atteint16,22,32. Chez les femelles, mesurer les niveaux de progestérone et de œstrogène en combinaison avec des poids utérin et ovarien et morphologie confirmera la fin de la puberté17,19,22,33.

Taille de la portée peut avoir des répercussions aussi bien durée de la gestation et l’âge au début pubertaire. La plupart des souches de souris ont une période de gestation de 18 à 22 jours. Toutefois, si la mère attend une grande portée, la période de gestation tend à être réduite de34,,35. En revanche, si la mère allaite une portée précédente, cela peut entraîner une prolongation de la période gestationnelle5. Chiots de grandes portées tendent également à ont retardé le début pubertaire. Ceci est causé par leur croissance étant légèrement retardé1,9,34,35. Si une étude de fertilité est effectuée et un des groupes de souris (contrôle ou expérimental) produit de très grandes portées, il est recommandé d’homogénéiser la litière tailles, aussi appelées mise à la réforme, permettant les litières étudiés à ont des tailles comparables.

Reproduction ne peut être évaluée en vivo en raison de multiples organes impliqués dans la reproduction (Figure 1) et les mécanismes de nombreux commentaires régulant la reproduction axe3. Certains aspects de la compétence de reproduction peuvent être rapidement évaluées par un essai d’obturation vaginal, où la capacité de l’homme de monter la femelle et de laisser une fiche physique dans le vagin est observée13,36. Bien qu’il s’agit d’une approche utile pour évaluer le comportement sexuel des hommes, ce type d’étude ne permet pas la détection de problèmes mineurs en reproduction, ni elle n’évalue pas maintenu la fertilité pendant une longue période de temps ou de taille de la portée qui en résulte et de comportement parental. Le protocole décrit ici présente de nombreux avantages par rapport à un essai de colmatage, les principaux étant la capacité d’identifier les effets mineures et majeures sur la compétence de reproduction chez les mâles et les femelles (Figure 4).

La fertilité diminue avec l’âge, et en outre, le cycle oestral féminin devient longs et irréguliers au cours du vieillissement5,28. Il est donc recommandé de commencer une étude sur la fertilité chez les jeunes et la maturité sexuelle des animaux. Une tranche d’âge généralement utilisé pour mettre en place une étude de fertilité est de 10 à 16 semaines d’âge. Cependant, il est important de se familiariser avec les caractéristiques spécifiques de reproduction de la souche de souris utilisées dans l’étude, des différences majeures dans la reproduction et la maturité sexuelle existant entre autre souris ou souches de rats (Figure 5 b). Plus d’informations sur les caractéristiques de reproduction se trouvent dans la base de données de JAX souris autant https://phenome.jax.org/. Exécution d’un plus long (> 4 mois) étude de fertilité a l’avantage d’être capable de détecter la baisse de reproduction précoce, où les souris pourraient se reproduisent normalement pendant les premiers mois de 1-2 de l’analyse de la fécondité, mais ont ensuite un déclin rapide en reproduction à partir avant 6 mois d’âge.

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Disclosures

L’auteur n’a rien à divulguer.

Acknowledgments

Je remercie les auteurs ayant contribué à le œuvre initiale qui est la base de cette publication. Merci à Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan et Erica L. Schoeller pour aider à préparer le manuscrit. Merci à Jessica Sora Lee et Austin Chin pour l’assistance technique avec le manuscrit. H.M.H. a été pris en charge par Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & le développement humain de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R00HD084759.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

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References

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Détermination de la compétence reproduction en confirmant début pubertaire et effectuer un test de fertilité chez des Rats et des souris
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Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

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