Summary
Mange behandlinger og genetiske mutasjoner påvirke tidspunktet for seksuell modenhet og fruktbarhet. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv metode for å evaluere pubertale utbruddet i mus og rotter før definere en fruktbarhet studie i seksuell modne dyr.
Abstract
Vurdering av reproduktive kompetanse er avgjørende for å forstå virkningen av en behandling eller genetisk manipulasjon på reproduktive aksen, også kalt hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen. Den reproduktive aksen er en nøkkel integrator miljømessige og intern inngang tilpasse fruktbarhet til gunstige vilkår for reproduksjon. Før embarking på en fruktbarhet studie i mus og rotter, seksuell modenhet evalueres for å utelukke muligheten for at de observerte reproduktive fenotyper skyldes forsinket eller fraværende pubertale utbruddet. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv tilnærming for å vurdere pubertale utbruddet menn gjennom fastsettelse av preputial separasjon og kvinner gjennom skjedeåpningen og første estrus. Etter ferdigstillelse av puberteten og oppnåelse av seksuell modenhet, kan en fruktbarhet studie startes. Prosedyren beskriver optimal avl betingelsene for mus og rotter, hvordan du setter opp en fruktbarhet studie og hvilke parametre for å evaluere og fastslå om behandling eller genet sletting har innvirkning på fruktbarheten.
Introduction
Overgangen gjennom puberteten er nødvendig for å oppnå seksuell modenhet og reproduktive kompetanse. Pubertale overgangen og vedlikehold av fruktbarhet i voksen alder er regulert av den reproduktive aksen, også kalt hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen (figur 1). Tidspunktet for pubertale utbruddet og vedlikehold av fruktbarhet er strengt regulert av interne samt miljømessige faktorer for å øke sjansene for overlevelse av avkom og foreldre1,2. Denne protokollen gir en ikke-invasiv tilnærming for å fastslå pubertale utbruddet i mus og rotter å bekrefte seksuell modenhet før sette opp en fruktbarhet studie for å vurdere reproduktive kompetanse.
En fruktbarhet studie utføres i seksuell modne dyr og kan startes etter dyrene har gått gjennom puberteten. Før pubertale utbruddet, reproduktive aksen er quiescent, og den viktigste driveren av kjønnsmodning, gonadotropin - lanserer hormone (GnRH), er utgitt på hypofysen i utilstrekkelige mengder å starte puberteten (figur 1). Pubertale utbruddet er en komplisert prosess som resulterer i økt GnRH utgivelsen på median eminense. GnRH fremmer luteiniserende hormon (LH) og follicle stimulerende hormone (FSH) sekret fra hypofysen, to hormoner avgjørende for gonadal modning og reproduktive funksjon (figur 1)3,4,5 .
Fornærmelser reproduktive aksen føre til redusert fruktbarhet og kan også advance eller forsinkelse pubertale utbruddet. Kjent for å påvirke tidsberegningen av pubertale utbruddet og reproduktive kompetanse vilkårene eksponering endokrine forstyrre kjemikalier6,7, økt/redusert kroppen vekt1,8, endringer i dag lengde2,9 og genetiske mutasjoner10,11,12,13,14,15.
Utbruddet av seksuell modenhet er et viktig skritt som må fullføres før du setter opp en fruktbarhet analysen. Fordelene med å bestemme pubertale utbruddet gjennom preputial fargeseparasjoner, skjedeåpningen og første estrus, er ikke-invasiv kjennetegner disse prosedyrene, som de ikke krever blod samling eller ofringen av dyr16, 17.
Etter pubertale utbruddet bestemmes, riktig å sette opp en fruktbarhet studie vil gi viktig informasjon om integriteten av reproduktive aksen, og vanligvis har den andre fordelen å generere forsøksdyr for videre studier (raffinement) 18. fruktbarhet studie oppsettet beskrevet i denne protokollen kan oppdage både små og store underskudd i reproduktive kompetanse hos menn og kvinner. Viktige parametere vurdert inkluderer 1) tid til det første kullet, 2) antall kull genereres i en gitt tidsramme og 3) søppel størrelse. Til slutt, anbefalinger for typen oppfølging studier som kan gjennomføres for å identifisere årsaken til ufrivillig verdifall er inkludert.
Beskrevet protokollen refererer til mus og representant data gjenspeiler arbeidet i transgene mus. Alle inkludert protokollene er imidlertid like gyldig i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Michigan State University og gjennomført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr.
1. Bestem pubertale utbruddet
- Følge institusjonelle retningslinjer for klær, minst, er det nødvendig å ha en ren labfrakk og ren hansker. Håndter mus iført ren hansker.
- Forberede arbeidsområdet ved å plassere en blokk på bordet.
- Sett en ren mus bur topp med rutenett vendt oppover på puten.
- Angi en skala i arbeidsområdet. Sett en ren 500-1000 mL kanne skala og tare.
- Plass et ark ved siden av arbeidsområdet for å registrere kroppsvekt og preputial separasjon, skjedeåpningen eller første estrus.
- Identifisere mus for studier. Utføre daglig inspeksjoner for pubertale utbruddet før puberteten er nådd. Utføre inspeksjon på samme tid på dagen gjennom hele studiet. Pubertale utbruddet kan skje så tidlig som postnatal dag 11-12-19, men i mest oppsett, pubertale utbruddet overvåking begynner ~ 22 dager.
- Plass musen buret i arbeidsområdet (trinn 1.2). Åpne buret og plassere lokket, vannflaske og mat holderen på bordet.
- Avgjøre preputial separasjon i mannlige mus.
- Mens du holder musen etter halen, plassere den på ren mus bur toppen fra trinn 1.2.1. Mens forsiktig holder på halen, la musen utforske rutenettet øverst bur for ~ 5 s.
- Trekk forsiktig halen bakover; Dette fører vanligvis dyret fremover mens du holder til rutenettet med sin forbena. Tilnærming derimot på huden i nærheten nakke og ører.
- Forstå løs huden mellom skuldre og nakke med tommelen og pekefingeren. Det er viktig å få en god tak av huden, som vil forhindre musen slår hodet å bite.
- Grab huden på ryggen med gjenværende fingrene og holde det ved å trykke mot hånden. Hold fast uten hindrer puste, blod strømning, eller skadelige bein, muskler og hud. Slå hånden for å avsløre magen museklikk, samtidig som baksiden av musen i håndflaten av hånden.
- Med den ledige hånden, skyv tilbake huden rundt penis uten å tvinge. Ved preputial lysbilder preputial huden bakover utsette glans penis (figur 2A, pil som viser preputial separasjon). Registrere tilstedeværelse eller fravær av preputial separasjon.
- Veie musen ved forsiktig å plassere den i 500-1000 mL begeret fra trinn 1.2.2 og ta vekten.
- Gjeninnføre musen i bolig buret ved å holde den kanne 0-2 cm over bur gulvet og sakte velter begeret slik at musen å gå ut på egen hånd. Rengjør begeret med vann og mildt vaskemiddel og tørk den før tilbake til skalaen og taring skala.
- Avgjøre skjedeåpningen i kvinnelige mus.
- Plass en bomullsdott, kanne og en flaske sterilt vann i arbeidsområdet (trinn 1.2). Hell vannet i begeret. Humidify bomullsdott med sterilt vann og plassere den ved siden av bur toppen fra trinn 1.2.1.
- Plasser musen buret i arbeidsområdet (trinn 1.2) og overføre musen fra buret sitt hjem til de bur (trinn 1.2.1) ved å holde ved foten av halen. Trekk forsiktig tilbake halen å oppmuntre en fremover bevegelse av musen.
- Løft halen samtidig hoftene gratis fingrene. Tillate hindlimbs å opprettholde kontakt med toppen av byrået. Hvis musen beveger seg for mye, hold den i hånden som beskrevet i trinn 1.5.1-1.5.4.
- Forsiktig rengjøre vulva med vann fuktet bomullsdott fra trinn 1.6.1. Bruk en ren fuktet bomullsdott for hver musen. Bestemme skjedeåpningen, undersøke vulva og avgjøre om vagina er helt åpent (figur 2A, kvinnelige skjedeåpningen).
- Post hvis skjedeåpningen oppstod. Veie musen og gå tilbake til hjem byrået som beskrevet i trinn 1.5.6-1.5.7.
- Første estrus angir første eggløsning.
- Plass et beaker med sterilt vann, en merket objektglass og en 200 µL pipette med ren tips i arbeidsområdet (trinn 1.2).
- Hold kvinnelige som beskrevet i trinn 1.6.2-1.6.3. Plassere pipette inneholder ~ 50 µL av sterilt vann ved skjedeåpningen.
- Forsiktig flush cellene fra vaginal veggen ved å innføre og reabsorbing ~ 50 µL vann 2 - 4 ganger. Smøre innholdet fra pipette spissen på en merket barometer microscope skyve.
- Nøye observere mobilnettet morfologi på brightfield mikroskop med en 10 X eller 20 X målet eller la smøre airdry ~ 1 h og deretter counterstain med en 0,1% methylene blåfarge løsning (oppløst i ddH2O) (figur 2B). For å counterstain, dyppe tørket lysbildet i 0,1% methylene blåfarge løsningen for ~ 30 s. La lysbildet luften tørr 1t.
- Observere lysbildene fra trinn 1.7.4 på en lysende felt mikroskopet på 10 X eller 20 X. Opprette scenen av estrous syklus (figur 2B)20 ved å observere cellen morfologi som gjør det mulig for å skille de fire forskjellige stadiene av estrous syklusen (figur 2B).
Merk: Metestrus er preget av en blanding av cornified plateepitel epitelceller og leukocytter, diestrus av leukocytter, proestrus av en blanding av leukocytter og kjerne epitelceller og estrus av cornified epitelceller (figur 2B) 20. - Registrere kroppsvekten og tilbake musen til buret sitt hjem som beskrevet i trinn 1.5.6-1.5.7. Vaginal utstryk er avsluttet på dagen når musen har sin første estrus (figur 2B).
2. ønskelig avl romforhold
- Sikre at avl rommet har en temperatur på ~ 20-24 ° C, med 55 ± 10% fuktighet, og homogen rom lys av en intensitet av ~ 300-400 lux ca. 1 meter over gulvet21. Denne lysintensiteten lar ønskelig midt bur lysintensiteten til 25-80 lux. For å teste lysintensiteten, bruk en lysmåler.
- Bruk et automatisert system for å styre lys i avl rommet for å sikre riktig timing av belysning i hele eksperimentet. Optimale lengden på dagen forhold å vurdere fruktbarhet i gnagere område fra en 12 h dag (12 h lys og 12t mørke, LD12:12), "sommer-like" forhold med 14 h lys og 10t mørke (LD14:10)21.
- Forberede avl merder.
- Forberede en ren mus bur med lokk, vann, mat, sengetøy og hekkende per hekkende par.
- Fyll ut av buret kortene med all nødvendig informasjon, inkludert sex, fødselsdato, musen belastning og datoen når mating er definert.
3. fruktbarhet studie
- Identifisere dyrene skal brukes for fruktbarhet studier. Kontroller at dyrene er kjønnsmoden (trinn 1). En typisk brukt aldersgruppe å sette opp en fruktbarhet studie i mus er 10-16 ukens av alderen, en alder hvor kjønnsmodning er fullført i mest eksperimentelle forhold.
- På en ren tabell, sett avl buret i trinn 2.3.
- Fangst og hold musen.
- Langsomt introdusere en gloved hånd inn i musen bur. La hånden på buret for en kort periode (~ 5-30 s), slik at mus til å tilpasse seg lukten av hansken og hånd. Unngå hektisk og hakkete bevegelser.
- Senk cupped hånd nær bunnen av byrået og sakte nærmer det til mus. De kjører bort. Når de kjører over hånden, fange halen av en mus mellom tommelen og pekefingeren.
- Løfte musen ved halen for 2-3 s. Hvis musen må bli holdt lenger, holde på halen og Plasser musen i cupped hånd som holder på halen.
- Overføre 1 mannlig og deretter 1 kvinnelige i avl buret ved å holde dem etter halen (trinn 3.3). Sikre at kvinner har samme estrous scenen når fruktbarhet analysen. Bestemme estrous scenen av kvinner ved å utføre en vaginal smøre som beskrevet i trinn 1.7.
- Lukk buret, og sikre at mus har mat, vann og hekkende materiale. Sy kortholderen bur bur kortet til buret.
- Plass avl buret på bolig stativet. La avl byrået som uforstyrret som mulig for hele varigheten av fruktbarhet studien. Gjennomføre fruktbarhet studien i 30 dager. For hvert par, holde detaljert oversikt og Merk 1) datoen mating defineres, 2) datoen søppel er født og 3) antall valpene født, inkludert slaktede og levende pups. Utføre søppel sjekker daglig gjennom hele studiet.
- Forlenge fruktbarhet studie for ytterligere 30-60 dager hvis ingen eller en svak effekt på fruktbarheten er etablert i trinn 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presentert resultatene er fra to forskjellige transgene musen modeller der den transkripsjon faktor ventrale fremre homeobox 1 (Vax1) har blitt slettet i hele kroppen på en allelet, her referert til som heterozygot mus (HET)13eller Vax1 er slettet betinget i GnRH neurons22, her kalt betinget KO (cKO). Før du konfigurerer fruktbarhet studien, er det viktig å bekrefte pubertale utbruddet i alle mus.
Først ble dagen og vekt ved skjedeåpningen og preputial separasjon etablert. I HET mus, skjedeåpningen og preputial separasjon skjedde på samme alder og vekt som kontroll mus (figur 3A og F, henholdsvis). Derimot skjedeåpningen og preputial separasjon var betydelig forsinket i cKO kvinner og menn og forbundet med økt kroppsvekt (figur 3B og G, henholdsvis). Pubertale utbruddet er til en viss grad knyttet kroppsvekt, og dette gjelder særlig i kvinner23. For å fastslå om forsinkelsen i skjedeåpningen og preputial separasjon med en forsinkelse i vektøkning, ble kroppsvekten i en gjennomsnittlig alder av skjedeåpningen og preputial separasjon i kontroller (4,5 ukens av alderen) sammenlignet av kroppsvekten i cKO hos menn og kvinner 4,5 uker gamle. Åring 4,5 uker hadde kvinnelige kontroller og cKO tilsvarende kroppsvekt (Figur 3 c), mens cKO menn var litt tyngre enn kontroller (Figur 3 H). Dette indikerer at forsinkelsen i skjedeåpningen og preputial separasjon i cKO ikke er knyttet til en forsinkelse i vektøkning.
Skjedeåpningen er en tidlig kjønnsmodning og første estrus en indikator som første eggløsning har oppstått, en markør av ferdigstillelse av puberteten17. For å avgjøre hvis HET og cKO kvinner nådd første estrus på samme alder og vekt som kontroller, ble vaginal utstryk utført daglig fra dag av skjedeåpningen før første estrus (figur 3E og 3D). I HET mus var første estrus og vekten på første estrus sammenlignbar mellom kontroller og HETs (figur 3D). I kontrast, cKO fremgang ingen gjennom estrous syklusen og hadde ikke første estrus på 80 dager (figur 3E). Denne forsinkelsen var ikke på grunn av redusert kroppsvekt (figur 3E).
HET mus med bekreftede pubertale utbruddet ble brukt til å definere fruktbarhet studien. Fruktbarhet analysen ble satt opp i 12 h lys og 12t mørke forhold (LD12:12) i transgene mus på C57BL/6J genetisk bakgrunn. Mus var i alderen 10-16 uker i begynnelsen av eksperimentet. Fire grupper av mus ble studert: kontroll parring (WTxWT), styre menn med HET kvinner (WTxHET), HET menn WT kvinner (HETxWT) og HET menn HET kvinner (HETxHET). Først identifiserte antall kull generert i 3 måneder. Kontroll parring (WTxWT) generert et gjennomsnitt på 2,8 kull i 3 måneder, som var sammenlignes med HET menn sammen med kontroll kvinner (HETxWT parring, figur 4A). HET kvinner, generert om forbundet med en WT mannlige (kontroll), eller en HET mann, betydelig færre kull i 3 måneders fruktbarhet studien, avslører at HET kvinner er subfertile13. For å illustrere betydningen av bekrefter pubertale utbruddet før definere en fruktbarhet analysen, ble reproduktive kompetanse evaluert i cKO mus, der menn hadde forsinket preputial separasjon (Figur 3 g) og kvinner ikke hadde sin første estrus av 80 dager gammel (figur 3E). Fruktbarhet studien ble satt opp > 1 uke etter menn hadde preputial separasjon, og hunnene > 80 dager gammel. I løpet av 70-dagers fruktbarhet studie, kontroll parring generert gjennomsnitt 2,2 kull, mens ingen kull ble generert fra enten cKO kvinnelige sammen med WT menn, eller cKO mannlige sammen med en kontroll (WT) kvinner (figur 4B), viser at disse musene er infertile5,22.
Bedre betegner fruktbarhet fenotypen av HET kvinner, registrerte vi antall dager det tok for å generere det første kullet. WTxWT parring generert deres første kull i gjennomsnitt 22 dager (figur 4C), som var sammenlignes med HET menn sammen med WT kvinner. HET kvinner sammen med WT menn tok gjennomsnitt 58 dager å produsere sin første kull, som var lik HETxHET parring (figur 4C). Men var forsinkelsen i genererer det første kullet HET kvinner veldig heterogene og forsinket mer i HETxHET parring, antyder en semi penetrance av fenotypen og bidrag av HET mann subfertility observert i HETxHET parring13 .
Evaluere søppel størrelsen kan gi viktig informasjon om eggløsning/implantasjon og sperm produksjon. Den gjennomsnittlige størrelsen på de 3 første søppel var bestemt. Interessant, alle parring kombinasjoner (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produsert betydelig mindre søppel i forhold til kontroller (WTxWT, Figur 4 d), viser at både mannlige og kvinnelige HET mus er subfertile.
Figur 1: hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen kontrollerer kjønnsmodning og reproduksjon. På toppen av den reproduktive aksen er hypothalamus kisspeptin neurons (gule sirkler) og gonadotropin - lanserer hormone (GnRH) neurons (grønne sirkler). I juvenile perioden (prepubertal) slipper kisspeptin neurons liten kisspeptin på GnRH neurons. Etter pubertale utbruddet, er kisspeptin utgivelse på GnRH neurons utvidet (etter pubertale). Økt GnRH utgivelse i slutten juvenile perioden øker dramatisk luteiniserende hormon (LH) og follicle stimulerende hormone (FSH) utgivelse fra hypofysen, fører til gonadal modning og reproduktive funksjon i voksen alder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bestemmelse av pubertale utbruddet i mus. En ekstern markør for pubertale utbruddet i mus er (A) preputial separasjon i menn, og vaginal åpningen i kvinner. Skala bar = 1 cm. (B) eksempel bilder fra vaginal lavage brukes til å bestemme første estrus. Lysbilder var counterstained for 30 s med 0,1% methylene blåfarge, airdried og observert på 20 X forstørrelse. Svarte piler indikerer kjerne epitelceller, gule piler med svart omriss angir leukocytter og hvite piler angir cornified epitelceller. Første estrus oppstod på dag 10 etter skjedeåpningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant data som kan genereres fra en pubertale utbruddet studie. (A, B) Skjedeåpningen og vekt ved skjedeåpningen transgene musen modeller. (C) vekt på 4,5 uker i kontroll og cKO kvinner. (D, E) Alder og vekt på første estrus. (F, G) Alder og vekt ved preputial. (H) vekt på 4,5 uker i kontroll og cKO menn. Data representerer betyr ± SEM. N = 5-10 per Student t-test for gruppen, statistisk analyse. p< 0.01; p< 0,001. Disse tallene er endret fra forrige publikasjonen13,22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant analyse fra en fruktbarhet studie av transgene mus. Fruktbarhet vurdering av (A) Vax1 HET mus og (B) cKO ble utført i jomfru 10 - 16-uke-gamle mus og antallet kull registrert i angitte tidsrammer. Data representerer betyr ± SEM. statistisk analyse var utført av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts flere sammenligning test. * p< 0,05; p< 0,001. (C) antall dager til første kull (n = 5-12), og (D) gjennomsnittlig søppel størrelsen på de tre første kull (n = 10-13) ble bestemt. Data representerer betyr ± SEM. statistisk analyse ble gjort av Student t-test mot WT x WT. *p< 0,05; p< 0,01. Disse tallene er endret fra forrige publikasjonen13,22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: sette opp en fruktbarhet analysen. (A) eksempel på oppdrett ordningen og foreslått antall dyr kreves for en fruktbarhet analysen. Antall dyr kreves for en studie med 2 forhold som en kontroll versus KO eller kontroll diet versus høy fett diett der fruktbarhet er vurdert i både menn og kvinner er: 2 mus per parring (1 mann x 1 kvinnelige) x 8 dyr per gruppe x 2 forhold x 2 kjønn s (for å evaluere både mannlige og kvinnelige fruktbarheten) = totalt 64 dyr per studie. Hvis den mannlige og kvinnelige fruktbarheten studien er gjort i parallell, kan ett sett av kontroll x kontroll parring vanligvis tjene sammenligne begge virkningen på mannlige og kvinnelige reproduksjon. (B) når en fruktbarhet analysen, musene som brukes må ha nådd seksuell modenhet. Ulike stammer mus har ulike reproduktive egenskaper og når seksuell modenhet på ulike aldre24. Se forrige publikasjonen25for informasjon på rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det totale wellbeing av mus er avgjørende for en vellykket fruktbarhet analysen21. Når du utfører en fruktbarhet analysen, er det viktig å ikke fysisk kontrollere på mus hver dag som dette kan føre til stress. Videre unngå hyppige bur endringer som disse er også stressende. Ideelt vil bur endringer bli gjort mer enn 1 - 2 ganger per uke. Lyseksponering i mørke fasen påvirker negativt avl i nattlige gnagere. Ikke slå på lysene i avl rommet i de mørke timene. Hvis oppføringen til rommet er nødvendig i de mørke timene, bruke dim rødt lys. En stressor er tilstedeværelsen av overdreven lukt, vibrasjoner eller støy i vivarium for hele eller deler av studien. For å lindre stress og forbedre musen velvære og avl, gi musene hekke materiale eller andre typer berikelse. Redebygging er en viktig atferd i mus og vil øke avl suksess. Reir også tillate musene et sted å skjule og spille. Sunt og godt næret dyr rase godt, derfor er det viktig å gi annonsen libitum tilgang til høykvalitets mat og vann. Hvis avl par begynner å vise symptomer som dermatitt (ofte i C57BL/6J), dental malocclusion eller andre, utelukke disse musene fra studien. I tillegg hvis studien blir gjort i immunodeficient mus, er det nøkkelen at musen rommet holdes rene å bevare fruktbarhet.
Riktig sette opp en fruktbarhet studie, er det viktig å bestemme om studien vil bli utført i jomfru mus eller bevist oppdrettere også så nøye velger musene som brukes for kontroll parring. Kontroll parring bør kjøres parallelt med eksperimentelle oppdrettere. Dette er viktig som ukjente eller uventede stressfaktorer og endringer i miljøet kan forårsake endringer i avl rate. Kontroll parring består fortrinnsvis av søppel mates til eksperimentelle mus (figur 5A). Dette er spesielt viktig når fruktbarhet studien er gjort i mus med blandet genetisk miljøet på grunn av store variasjoner i avl egenskaper mellom musen stammer (figur 5B).
Identifisere en subfertility fenotypen kan være utfordrende langvarig lang studien, og behovet for å analysere flere parametere for å avdekke årsaken. HET musen i representant data er et godt eksempel på en beskjeden subfertility fenotypen (Figur 4), og utvidet analyse må identifisere de mannlige subfertility. Som vist i Representant resultater (Figur 3 og 4), kan vanlig utbruddet av puberteten (figur 3A, Dog F) være knyttet til både mannlige og kvinnelige subfertility (figur 4A, C, D ). I dette tilfellet mus var bare sub fruktbare, og dermed hvor studien ble utvidet til 120 dager. Dette er viktig, som en kortere fruktbarhet studie (f.eks. 60 dager) ville ikke ha vært kunne avsløre fenotypen. Den mannlige subfertility var beskjeden, og først avslørt når HET menn var sammen med HET kvinner, som også var subfertile (figur 4A). Faktisk ble subfertility HET menn bekreftet når du vurderer den gjennomsnittlige størrelsen på kull far (Figur 4 d). Oppfølging studier bekreftet den mannlige subfertility og avdekket en fattig sperm kvalitet HET menn, med en ~ 80% reduksjon i motile sperm13.
Når fruktbarhet og pubertale utbruddet studier i mus med en stor forsinkelse i pubertale utbruddet (> 5 dager), er det viktig å vurdere ulike faktorer som regulerer pubertale utbruddet26. Selv om skjedeåpningen og første estrus ofte skje samtidig i rotter, oppstår første estrus i mus vanligvis ~ 10 dager etter skjedeåpningen25,27. Derfor er det anbefalt å sikre at både skjedeåpningen og første estrus opprettes når du arbeider i både rotter og mus18,28. Pubertale utbruddet er knyttet til metabolske status og kroppsvekt i kvinner og i mindre grad i menn1,7,9,29, og som sådan, en behandling eller genetisk mutasjon bremse dyr vekst vil i noen tilfeller føre en forsinket pubertale utbruddet. For å fastslå om forsinkelse/fremme i pubertale utbruddet kan være forbundet med rask/langsom vekst, er det viktig å veie musene daglig under vurdering av pubertale utbruddet. Som vist i figur 3B og C, samt G og H, forsinkelse i pubertale utbruddet var ikke forbundet med redusert kroppsvekt, men var en ekte forsinkelse i pubertale utbruddet, som bekreftes av gonadal histologi og sirkulerende hormon nivå22. En av store begrensningene ved hjelp preputial fargeseparasjoner og skjedeåpningen som markører for pubertale utbruddet er at begge vil ofte skje til slutt over tid på grunn av mekanismer enn økt aktivitet av reproduktive aksen18, 30 , 31 (figur 1). Et eksempel på dette er forsinket skjedeåpningen i cKO kvinner (figur 3B). CKO kvinner blir aldri fruktbare på grunn av fravær av eggløsning22 (figur 3E). Faktisk videre vist studier vurdere hormonelle nivåer og gonadal histology av cKO mus at disse musene aldri fullført puberteten og var ufruktbare22 (figur 4B). Dette viser grensen på bruke eksterne markører for å avgjøre pubertale utbruddet. Puberteten og rekkevidde seksuell modenhet krever økt GnRH utgivelse og aktivering av reproduktive aksen (figur 1), og for å bekrefte fullt seksuell modenhet både gonadal morfologi og sirkulerende hormonnivået må evalueres 22 , 31. i menn, måler testosteron, og evaluere seminal vesicle størrelse og testikkel morfologi og størrelse i tillegg kvaliteten vil bekrefte puberteten ble oppnådd16,22,32. I kvinner, vil måle progesteron og estrogen nivåer i kombinasjon med livmor og eggstokkreft vekt og morfologi bekrefte ferdigstillelse av puberteten17,19,22,33.
Søppel størrelse kan påvirke både svangerskapet lengde og pubertale debutalder. De fleste mus stammer har gestation perioden 18-22 dager. Men hvis mor er venter en stor søppel, pleier drektighetstid å være redusert34,35. Derimot, hvis mor er sykepleier en tidligere søppel, kan dette resultere i en utvidelse av svangerskapsdiabetes perioden5. Pups inne stor søppel pleier også å ha forsinket pubertale utbruddet. Dette er forårsaket av deres vekst er litt forsinket1,9,34,35. Hvis en fruktbarhet studie utføres og en av de mus (kontroll eller eksperimentell) produserer meget stor søppel, bør homogenize søppel størrelser, også kalt culling, slik at de studerte søppel har sammenlignbare størrelser.
Reproduksjon bare kan vurderes i vivo flere organer som er involvert i reproduksjon (figur 1) og utstrakt tilbakemelding mekanismer regulere reproduktive akse3. Visse aspekter av reproduktive kompetanse kan evalueres raskt gjennom en vaginal koble analysen, der kapasiteten til den mannlige å montere kvinnelige og la en fysisk plugg i vagina er observert13,36. Selv om dette er en nyttig tilnærming å vurdere mannlig seksuell atferd, denne typen studier tillater ikke gjenkjenning av små problemer i reproduksjon, eller gjør det vurdere opprettholdt fruktbarhet i lang tid eller resulterende søppel størrelse og foreldrenes atferd. Protokollen beskrevet her presenterer mange fordeler over en koble analysen, store blir kapasitet til å identifisere både små og store virkninger på reproduktive kompetanse hos menn og kvinner (Figur 4).
Fruktbarhet reduseres med alderen, og i tillegg kvinnelige estrous syklusen blir lengre og uregelmessig under aldring5,28. Det anbefales derfor å starte en fruktbarhet studie i unge og seksuell modne dyr. En typisk brukt aldersgruppe å sette opp en fruktbarhet studie er 10-16 ukens av alderen. Det er imidlertid viktig å bli kjent med reproduktiv Karakteristika av musen påkjenningen brukes i studien, som store forskjeller i reproduksjon og seksuell modenhet finnes mellom annen mus eller rotte stammer (figur 5B). Tilleggsinformasjon om reproduktive egenskaper finnes i JAX musen Phenome Database https://phenome.jax.org/. Utføre en lengre (> 4 måneders) fruktbarhet studie har fordelen av å kunne oppdage tidlige reproduktive nedgang, der mus kan avle normalt for de første 1-2 månedene til fruktbarhet analysen, men har en tidlig nedgang i reproduksjon starter før 6 måneders alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Jeg takker forfatterne bidrar til det første arbeidet som er grunnlaget for denne publikasjonen. Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan og Erica L. Schoeller for hjelpe forbereder manuskriptet. Takk til Jessica Sora Lee og Austin hake for kundestøtte for manuskriptet. H.M.H. ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig utvikling av National Institutes of Health under prisen nummer R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
