Summary
Muitos tratamentos e mutações genéticas impactam o momento da maturidade sexual e fertilidade. Este protocolo descreve um método não-invasivo para avaliar o início puberal em camundongos e ratos antes da criação de um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros.
Abstract
Avaliação da competência reprodutiva é fundamental para a compreensão do impacto de um tratamento ou manipulação genética do eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O eixo reprodutivo é um integrador de chave de entrada interna e ambiental adapta a fertilidade de condições favoráveis para a reprodução. Antes de embarcar em um estudo de fertilidade em ratos e ratos, a maturidade sexual é avaliada para excluir a possibilidade de que os fenótipos reprodutivos observados são causados por atraso ou ausência de início puberal. Este protocolo descreve uma abordagem não-invasivo para avaliar o início puberal em machos através da determinação da separação prepucial e nas fêmeas através da abertura vaginal e do primeiro estro. Após a confirmação da conclusão da puberdade e a consecução da maturidade sexual, um estudo de fertilidade pode ser iniciado. O procedimento descreve as condições de reprodução ideal para ratos e ratos, como configurar um estudo de fertilidade e quais os parâmetros para avaliar e determinar se o tratamento ou supressão do gene tem um impacto sobre a fertilidade.
Introduction
A transição da puberdade é necessário para atingir a maturidade sexual e reprodutiva competência. A transição da puberdade e a manutenção da fertilidade na idade adulta é regulada pelo eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (Figura 1). O calendário de início puberal e manutenção da fertilidade é fortemente regulamentados por fatores internos, bem como ambientais para aumentar as chances de sobrevivência da prole e os pais de1,2. Este protocolo fornece uma abordagem não-invasivo para determinar o início puberal em camundongos e ratos para confirmar a maturidade sexual antes da criação de um estudo de fertilidade para avaliar a competência reprodutiva.
Um estudo de fertilidade é executado em animais sexualmente maduros e pode ser iniciado depois que os animais passaram pela puberdade. Antes início puberal, o eixo reprodutivo é quiescente, e o principal motor da maturação sexual, hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), é liberado para a hipófise em quantidades insuficientes para iniciar a puberdade (Figura 1). Início puberal é um processo complexo que resulta em maior liberação de GnRH na eminência da mediana. GnRH promove o hormônio luteinizante (LH) e folículo-estimulante de secreção de hormônio (FSH) da hipófise, dois hormônios essenciais para a maturação gonadal e função reprodutiva (Figura 1)3,4,5 .
Insultos ao eixo reprodutivo resultam em redução da fertilidade e podem também início puberal adiantamento ou atraso. Condições conhecidas para influenciar o momento do início puberal e competência reprodutiva incluem a exposição a endócrinos produtos químicos6,7,1,do peso de corpo aumentou/diminuiu8, mudanças na comprimento de dia2,9 e mutações genéticas10,11,12,13,14,15.
O início da maturidade sexual é um passo crítico que precisa ser concluído antes da criação de um ensaio de fertilidade. As vantagens de determinar o início puberal através de separação prepucial, abertura vaginal e o primeiro estro, são as características não-invasivo desses procedimentos, que não requerem a coleta de sangue ou sacrifício do animal16, 17.
Após início puberal é determinado, corretamente, configurando um estudo de fertilidade irá fornecer informações importantes sobre a integridade do eixo reprodutivo e geralmente tem a segunda vantagem de gerar animais experimentais para estudos adicionais (refinamento) 18. a instalação de estudo de fertilidade descrita neste protocolo pode detectar pequenos e grandes déficits em competência reprodutiva em machos e fêmeas. Principais parâmetros avaliados incluem 1) tempo para a primeira ninhada, 2) número de ninhadas gerado em um determinado tamanho de tempo e maca 3). Finalmente, as recomendações para o tipo de acompanhamento de estudos, que pode ser realizado para identificar a causa de deficiência de fertilidade estão incluídas.
O protocolo descrito refere-se aos ratos e os dados representativos refletem o trabalho realizado em ratos transgénicos. No entanto, todos os protocolos incluídos são igualmente válidos em ratos.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University e conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. determinar o início puberal
- Siga as orientações institucionais para a roupa, no mínimo, é necessário usar um jaleco limpo e luvas esterilizadas. Sempre lidar com ratos usando luvas limpas.
- Prepare a área de trabalho, colocando uma almofada em cima da mesa.
- Coloque um top de gaiola limpa do mouse com a grade virada para cima no teclado.
- Configure uma escala na área de trabalho. Coloque um copo limpo 500 – 1000 mL sobre a escala e a Tara.
- Coloque uma folha ao lado da área de trabalho para registro de peso e separação prepucial, abertura vaginal ou primeiro estro.
- Identifica os ratos para o estudo. Realizar inspecções diárias para início puberal até que seja atingida a puberdade. Execute a inspeção ao mesmo tempo do dia ao longo do estudo. Início puberal pode ocorrer tão cedo quanto pós-Natal dia 11-12,19, no entanto, em configurações mais experimentais, monitoramento de início puberal inicia em ~ 22 dias.
- Coloque a gaiola do rato na área de trabalho (etapa 1.2). Abra a jaula e coloque a tampa, garrafa de água e titular de comida na mesa.
- Determinar a separação prepucial em ratos masculinos.
- Mantendo o mouse pela cauda, coloque-o sobre o topo de gaiola do rato limpo da etapa 1.2.1. Enquanto suavemente, segurando a cauda, deixe o mouse explorar a grade do topo da gaiola para ~ 5 s.
- Puxe delicadamente a cauda para trás; Isso geralmente resulta em seguir em frente, mantendo-se para a grade com suas patas dianteiras o animal. Abordagem a outra mão sobre a pele para fechar o pescoço e orelhas.
- Segure a pele solta entre os ombros e o pescoço com o polegar e o indicador. É importante para obter uma boa preensão da pele, como irá impedir que o mouse virar sua cabeça para morder.
- Pegue a pele na parte de trás com os restantes dedos e segure-a pressionando contra a mão. Segure firmemente sem obstruir a respiração, músculos de fluxo, ou prejudiciais, ossos, sangue ou pele. Vire a mão para expor a barriga do rato, apoiando as costas do mouse dentro da palma da mão.
- Com a mão livre, delicadamente empurre para trás a pele ao redor do pênis sem forçar. Na separação prepucial, a pele prepucial desliza para trás, expondo a glande do pênis (Figura 2A, seta mostrando separação prepucial). Registre a presença ou ausência de separação prepucial.
- Pesar o mouse, suavemente, colocando-o no copo de 500-1000 mL da etapa 1.2.2 e registar o peso.
- Reintroduzir o rato na gaiola habitação, segurando o copo 0-2 cm sobre o piso da gaiola e tombar lentamente o copo permitindo o mouse para sair por conta própria. Limpar o copo com água e detergente neutro e secá-lo bem antes de devolvê-lo à escala e Tarar a balança.
- Determinando a abertura vaginal em ratos fêmeas.
- Coloque uma bola de algodão, copo e uma garrafa de água estéril na área de trabalho (etapa 1.2). Despeje a água no copo. Umidificar a bola de algodão com água estéril e colocá-lo ao lado da parte superior da gaiola da etapa 1.2.1.
- Coloque a gaiola do mouse na área de trabalho (etapa 1.2) e transferir o mouse de sua gaiola em casa para o topo da gaiola (etapa 1.2.1) segurando-o na base da cauda. Suavemente, puxe a cauda para incentivar um movimento do mouse.
- Levante a cauda apoiando os quadris com os dedos grátis. Permitir que os membros traseiros manter contato com a parte superior da gaiola. Se o mouse se move muito, segure na mão conforme descrito em etapas 1.5.1-1.5.4.
- Limpe suavemente a vulva com a bola de algodão umidificado água da etapa 1.6.1. Use uma bola de algodão limpo umidificado para cada rato. Para determinar a abertura vaginal, examinar a vulva e determinar se a vagina está completamente aberto (Figura 2A, abertura vaginal feminina).
- Recorde se ocorreu a abertura vaginal. Pesar o mouse e devolvê-lo para a gaiola em casa, conforme descrito em etapas 1.5.6-1.5.7.
- Primeiro estro, um indicador de primeira ovulação.
- Coloca um copo com água estéril, uma lâmina de vidro rotulado e uma pipeta de 200 µ l, com uma ponta limpa na área de trabalho (etapa 1.2).
- Segure a fêmea conforme descrito no passo 1.6.2-1.6.3. Coloque a ponta da pipeta contendo ~ 50 µ l de água estéril na abertura vaginal.
- Lave delicadamente as células da parede vaginal introduzindo e reabsorvendo ~ 50 µ l de água 2 - 4 vezes. Esfregaço do conteúdo da ponta da pipeta numa lâmina de microscópio de vidro rotulado.
- Observar cuidadosamente a morfologia celular em um microscópio de brightfield usando um 10 X ou 20 X de objectivo ou deixe-o muito de esfregaço para ~ 1 h e depois counterstain com uma solução de azul de metileno 0,1% (dissolvida em ddH2O) (Figura 2B). Para counterstain, mergulhe o slide secado para a solução de azul de metileno 0,1% para ~ 30 s. Deixe o ar de slide secar por 1h.
- Observe os slides da etapa 1.7.4 em um microscópio de campo claro em 10x ou 20x. Estabelece o estágio do ciclo estral (Figura 2B)20 , observando a morfologia celular que permite distinguir as quatro fases distintas do ciclo estral (Figura 2B).
Nota: Metestrus é caracterizada por uma mistura de células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos, diestro por leucócitos, proestro por uma mistura de leucócitos e células epiteliais nucleadas e estro por células epiteliais cornificadas (Figura 2B) 20. - Registrar o peso do corpo e retornar o mouse para sua gaiola em casa, conforme descrito em etapas 1.5.6-1.5.7. Esfregaços vaginais são finalizados no dia em que o mouse tem seu primeiro estro (Figura 2B).
2. desejável a criação de condições de sala
- Certifique-se de que a sala de reprodução tem uma temperatura de ~ 20-24 ° C, com 55 ± 10% de humidade e homogénea de quarto luz de uma intensidade de ~ 300-400 lux aproximadamente 1 m acima do piso21. Esta intensidade de luz permite que a intensidade da luz desejável meio da gaiola de 25-80 lux. Para testar a intensidade da luz, use um medidor de luz.
- Use um sistema automatizado para controlar a iluminação na sala de reprodução para garantir o sincronismo adequado de iluminação ao longo do experimento. Condições ideais de dia-comprimento para avaliar a fertilidade no intervalo de roedores de um dia de 12h (12 h luz e escuridão de 12 h, LD12:12), "verão-como" condições com 14 h de luz e 10 h de escuridão (LD14:10)21.
- Prepare as gaiolas de criação.
- Prepare uma gaiola do rato limpo com tampa, água, comida, roupa de cama e ninhos por casal reprodutor.
- Preencher os cartões de gaiola com todas as informações necessárias, incluindo o sexo, data de nascimento, cepa de rato e a data quando o acasalamento é setup.
3. estudo de fertilidade
- Identifica os animais a ser usado para o estudo de fertilidade. Certifique-se de que os animais são sexualmente maduros (etapa 1). Uma gama de idade normalmente usadas para configurar um estudo de fertilidade em ratos é de 10-16 semanas de idade, uma idade onde maturação sexual foi concluída em condições mais experimentais.
- Sobre uma mesa limpa, coloque a gaiola de reprodução, preparada no passo 2.3.
- Pegar e segurar o mouse.
- Lentamente, introduza uma mão enluvada da gaiola do rato. Deixe a mão na gaiola por um curto período de tempo (~ 5-30 s), permitindo que os ratos adaptar-se ao cheiro da luva e mão. Evite movimentos espasmódicos e agitados.
- Abaixe a mão em concha perto do fundo da gaiola e abordá-lo lentamente para os ratos. Eles vão fugir. Quando eles correm sobre a mão, prenda o rabo de um rato entre o polegar e o dedo indicador.
- Levante o mouse pela cauda para 2-3 s. Se o mouse precisa ser mantido por mais, segurar a cauda e posicione o mouse na mão em concha mantendo a espera na cauda.
- Transferi 1 masculino e, posteriormente, 1 fêmea para a gaiola de reprodução por segurando-os pela cauda (passo 3.3). Certifique-se de que as fêmeas estão na mesma fase estral ao configurar o ensaio de fertilidade. Determine a fase estral das fêmeas através da realização de um esfregaço vaginal conforme descrito na etapa 1.7.
- Fechar a gaiola e certifique-se de que os ratos têm comida, água e assentamento do material. Anexe o titular do cartão de gaiola com o cartão da gaiola para a gaiola.
- Coloque a gaiola de reprodução na prateleira a habitação. Deixe a gaiola de reprodução tão intacta quanto possível por toda a duração do estudo da fertilidade. Conduza o estudo de fertilidade por 30 dias. Para cada par de reprodutores, manter registros detalhados e Nota 1) a data que do acasalamento está configurado, 2) a data ninhadas nascem e 3) o número de filhotes nascidos, incluindo filhotes mortos e vivos. Execute verificações de lixo diariamente ao longo do estudo.
- Prolongar a fertilidade do estudo para um adicional de 30-60 dias se não ou um fraco impacto na fertilidade é estabelecido no passo 3.6.
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Representative Results
Os resultados apresentados são de dois modelos de mouse diferente de transgênicos, onde o fator dos transcrição, nomeadamente a homeobox anterior Ventral 1 (Vax1) foi excluído em todo o corpo em um alelo, aqui referido como heterozigoto ratos (HET)13, ou Vax1 foi condicionalmente excluído dentro de GnRH neurônios22, aqui denominado KO condicional (cKO). Antes de configurar o estudo de fertilidade, é importante confirmar o início puberal em todos os ratos.
Em primeiro lugar, o dia e o peso na abertura vaginal e prepucial separação foram estabelecidas. Em camundongos a HET, abertura vaginal e prepucial separação ocorreram na mesma idade e peso como os ratos controle (Figura 3A e F, respectivamente). Em contraste, abertura vaginal separação prepucial foram significativamente atrasada em CKO em fêmeas e machos e associado com o aumento de peso corporal (Figura 3B e G, respectivamente). Início puberal é algum grau de associado com o peso do corpo, e isto é particularmente verdadeiro em fêmeas23. Para determinar se o atraso na abertura vaginal e prepucial separação foi associado com um atraso no ganho de peso, o peso do corpo na idade média da abertura vaginal e prepucial separação em controles (4,5 semanas de idade) foi comparado com o peso do corpo em cKO em machos e fêmeas com 4,5 semanas de idade. Com 4,5 semanas de idade, controles femininos e cKO tinham peso comparável (Figura 3), enquanto os machos cKO eram ligeiramente mais pesados do que controles (Figura 3 H). Isso indica que o atraso na abertura vaginal e prepucial separação em cKO não está associadas um atraso no ganho de peso.
Abertura vaginal é um marcador precoce da maturação sexual e o primeiro estro um indicador de que a primeira ovulação ocorreu, um marcador da conclusão da puberdade17. Para determinar se o HET e cKO fêmeas alcançado primeiro estro na mesma idade e peso como controles, esfregaços vaginais foram realizados diariamente desde o dia da abertura vaginal até primeiro estro (Figura 3E e 3D). Nos ratos, HET primeiro estro e o peso no primeiro estro foi comparável entre os controles e ele morreu (Figura 3D). Em contraste, cKO não progredir através do ciclo estral e não teve o primeiro cio com a idade de 80 dias (Figura 3E). Este atraso não foi devido ao peso reduzido (Figura 3E).
Os ratos HET com início puberal confirmado foram usados para configurar o estudo de fertilidade. O ensaio de fertilidade foi criado em 12 h luz e escuro 12 h (LD12:12) em ratos transgênicos sobre um fundo genético C57BL/6J. Os ratos estavam com idade entre 10-16 semanas no início do experimento. Quatro grupos de camundongos foram estudados: controle acasalamentos (WTxWT), controle os machos com fêmeas HET (WTxHET), HET machos com fêmeas WT (HETxWT) e os machos HET com fêmeas HET (HETxHET). Primeiro, determinou-se o número de ninhadas geradas em 3 meses. Acasalamentos de controle (WTxWT) gerou uma média de 2,8 litros em 3 meses, que era comparável ao HET machos emparelhados com fêmeas de controle (HETxWT, acasalamento, Figura 4A). Fêmeas HET, se emparelhado com um WT masculino (controle), ou um HET masculino, gerados ninhadas significativamente menor no estudo de fertilidade de 3 mês, revelando que as fêmeas HET subfertile13. Para ilustrar a importância de confirmar o início puberal antes da criação de um ensaio de fertilidade, competência reprodutiva foi avaliada em CKO em ratos, onde os machos tinham atrasado separação prepucial (Figura 3) e as fêmeas não teve sua primeira estro por 80 dias de idade (Figura 3E). O estudo de fertilidade foi configurar > 1 semana depois que os machos tinham separação prepucial e nas fêmeas em > 80 dias de idade. Durante o estudo de fertilidade de 70 dias, controle acasalamentos gerou uma média de 2,2 litros, Considerando que não há ninhadas foram geradas a partir do cKO feminino emparelhado com um macho WT, ou o macho cKO emparelhado com uma fêmea de controle (WT) (Figura 4B), mostrando que estes ratos são inférteis5,22.
Para melhor caracterizar o fenótipo de fertilidade das fêmeas HET, registramos o número de dias que levou para gerar a primeira ninhada. WTxWT acasalamentos gerou sua primeira ninhada em uma média de 22 dias (Figura 4), que era comparável a HET machos emparelhados com fêmeas WT. As fêmeas HET emparelhadas com machos WT levaram uma média de 58 dias para produzir sua primeira ninhada, que era similar a acasalamentos HETxHET (Figura 4). No entanto, o atraso na geração da primeira ninhada de fêmeas HET era muito heterogênea e retardada mais em acasalamentos HETxHET, sugerindo uma penetrância semi do fenótipo e uma contribuição do macho HET para a Subfertilidade observada em acasalamentos HETxHET13 .
Avaliar o tamanho da ninhada pode dar informações importantes sobre a produção da ovulação/implantação e esperma. Determinou-se o tamanho médio das 3 primeiras ninhadas. Curiosamente, todos acasalamento combinações (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produzidas ninhadas significativamente menores em comparação aos controles (WTxWT, Figura 4), mostrando que os ratos HET masculinos e femininos são subfertile.
Figura 1: O eixo hipotálamo-hipófise-gonadal controla maturação sexual e reprodução. No ápice do eixo reprodutivo são os neurônios do hipotálamo kisspeptin (círculos amarelos) e hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios (círculos verdes). Na fase juvenil (pré-púberes), neurônios kisspeptin liberar pouco kisspeptin para os neurônios do GnRH. Após início puberal, lançamento de kisspeptin em neurônios GnRH é aumentado (pós puberal). Aumentada liberação de GnRH no final do período juvenil aumenta dramaticamente o hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante a liberação de hormônio (FSH) da hipófise, levando à maturação gonadal e função reprodutora na idade adulta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: determinação de início puberal em camundongos. Marcador externo de início puberal em ratos é (A) separação prepucial nos machos e vaginal de abertura nas fêmeas. Barra de escala = 1 cm. (B) imagens de exemplo de lavagem vaginal usado para determinar o primeiro estro. Slides foram counterstained por 30 s, com 0,1% de azul de metileno, airdried e observado na ampliação de 20 X. As setas pretas indicam células epiteliais nucleadas, setas amarelas com contorno preto indicam leucócitos e setas brancas indicam células epiteliais cornificadas. Primeiro estro ocorreu no dia 10, depois da abertura vaginal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: dados representativos que podem ser gerados a partir de um estudo de início puberal. (A, B) Abertura vaginal e peso na abertura vaginal em modelos do rato transgénico. (C) peso com 4,5 semanas no controle e cKO fêmeas. (D, E) Idade e peso no primeiro cio. (F, G) Idade e peso à separação prepucial. (H) peso de 4,5 semanas no controle e CKO em machos. Dados representam meios ± SEM. N = 5-10 por teste de Student-t grupo de análises estatísticas. p< 0,01; p< 0,001. Estes números foram modificados de anterior publicação13,22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise representativa de um estudo de fertilidade de ratos transgénicos. Avaliação da fertilidade de ratos HET de Vax1 (A) e (B) cKO foi realizada em ratos virgens de 10 a 16 semanas de idade e o número de ninhadas registadas nos quadros de tempo indicados. Dados representam meios ± SEM. estatística análise foi realizada por One-Way ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. * p< 0,05; p< 0,001. (C) o número de dias para a primeira ninhada (n = 5-12) e o tamanho de areia média (D) dos primeiro três ninhadas (n = 10-13) foi determinada. Dados representam meios ± SEM. estatística análise foi feita pelo teste de Student-t em comparação com WT x peso *p< 0,05; p< 0,01. Estes números foram modificados de anterior publicação13,22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: criação de um ensaio de fertilidade. (A) exemplo de esquema e sugerido número de animais necessários para um ensaio de fertilidade de reprodução. O número total de animais necessários para um estudo com 2 condições, tais como um controle versus KO ou controle dieta versus dieta gorda alta onde a fertilidade é avaliada em machos e fêmeas é: 2 ratos por acasalamento (1 macho x 1 fêmea) x 8 animais por sexo de condições x 2 do grupo x 2 s (para avaliar a fertilidade masculina e feminina) = total de 64 animais por estudo. Se o estudo de fertilidade masculina e feminina é feito em paralelo, um conjunto de controle x controle acasalamentos geralmente pode servir para comparar os dois o impacto sobre a reprodução masculina e feminina. (B) quando a criação de um ensaio de fertilidade, os ratos usados precisam ter atingido a maturidade sexual. Diferentes cepas de ratos têm diferentes características reprodutivas e atingem a maturidade sexual em diferentes idades de24. Para obter informações sobre ratos, consulte anterior publicação25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O bem-estar geral dos ratos é fundamental para um ensaio de fertilidade bem sucedida21. Ao realizar um ensaio de fertilidade, é importante verificar fisicamente não nos ratos todos os dias pois isso pode causar estresse. Mais Evite mudanças frequentes de gaiola, como estas também são estressantes. Idealmente as alterações gaiola serão feitas não mais do que 1 - 2 vezes por semana. Exposição à luz durante a fase de escura impacta negativamente reprodutores em roedores noturnos. Não ligue as luzes na sala de reprodução durante as horas escuras. Se a entrada para a sala é exigida durante as horas escuras, use iluminação ofuscante luz vermelha. Outro fator de estresse é a presença de odores excessivos, vibrações ou ruídos no viveiro para todos ou partes do estudo. Para ajudar a aliviar o estresse e melhorar o bem-estar de rato e reprodução, dar os ratos aninhamento de materiais ou outros tipos de enriquecimento. Construção do ninho é um comportamento importante em camundongos e irá aumentar o sucesso reprodutivo. Os ninhos também permitem que os ratos um lugar para se esconder e jogar. Raça de animais saudáveis e bem nutridas bem, portanto é importante fornecer acesso ad libitum para água e comida de alta qualidade. Se casais reprodutores começam a apresentar sintomas da doença, como dermatite (frequente em C57BL/6J), má oclusão dentária ou outro, exclua esses ratos do estudo. Além disso, se o estudo está sendo feito em camundongos imunodeficientes, é chave para que a sala de rato é mantida limpa para preservar a fertilidade.
Para definir adequadamente um estudo de fertilidade, é importante decidir se o estudo será realizado em ratos virgens ou criadores comprovados também cuidadosamente selecionar os ratos usados para controle acasalamentos. Acasalamentos de controle devem ser executados em paralelo com os criadores de experimentais. Isto é imperativo como estressores desconhecidos ou imprevistos e mudanças no ambiente podem causar mudanças na taxa de reprodução. Acasalamentos de controle são compostos preferencialmente de companheiros de ninhada aos ratos experimentais (Figura 5A). Isto é particularmente importante quando o estudo de fertilidade é feito em ratos com fundo genético misto devido às grandes variações na criação de características entre estirpes de rato (Figura 5B).
Identificar um fenótipo de Subfertilidade pode ser um desafio devido à prolongada duração do estudo e a necessidade de analisar parâmetros adicionais para revelar a sua causa. O mouse HET nos dados representativos é um bom exemplo de um fenótipo de Subfertilidade modesto (Figura 4), e a análise estendida necessários para identificar a Subfertilidade masculina. Conforme os Resultados do representante (Figura 3 e 4), normal início da puberdade (Figura 3A, De F) pode ser associado a Subfertilidade masculina e feminina (Figura 4A, C D ). Neste caso, os ratos foram apenas sub fértil, e, portanto, o comprimento do estudo foi ampliado para 120 dias. Isto é importante, como um estudo de fertilidade mais curto (por exemplo., 60 dias) não teria sido capaz de revelar o fenótipo. A Subfertilidade masculina foi modesta e primeiro revelou quando machos HET foram emparelhados com fêmeas HET, que também foram subfertile (Figura 4A). Com efeito, a Subfertilidade de machos HET foi confirmada ao avaliar o tamanho médio das ninhadas que procriou (Figura 4). Acompanhamento de estudos confirmou a Subfertilidade masculina e revelou uma qualidade pobre do esperma nos machos HET, com uma redução de ~ 80% de esperma motile13.
Quando executar uma fertilidade e início puberal estuda em ratos com um grande atraso no início puberal (> 5 dias), é importante considerar os diferentes fatores que regulam o início puberal26. Embora a abertura vaginal e do primeiro estro mais frequentemente acontecem concomitantemente em ratos, em ratos o primeiro cio geralmente ocorre ~ 10 dias após a abertura vaginal25,27. Portanto, é recomendável para assegurar que tanto a abertura vaginal e primeiro estro são estabelecidos quando se trabalha em ambos os ratos e camundongos18,28. Início puberal está ligado ao estado metabólico e peso corporal em mulheres e em menor grau no machos1,7,9,29, e como tal, um tratamento ou uma mutação genética, desaceleração do crescimento animal será em algum resultado de casos em um início puberal retardado. Para determinar se o atraso/avanço no início de puberdade podem ser associado com crescimento rápido/lento, é importante pesar os ratos diariamente durante a avaliação de início puberal. Como visto na Figura 3B e C, bem como G e H, o atraso no início puberal não foi associado a peso corporal reduzida, mas foi um verdadeiro atraso no início puberal, como confirmado pela histologia gonadal e circulantes de hormônio níveis de22. Uma das principais limitações do uso de separação prepucial e abertura vaginal como marcadores de início puberal é que ambos muitas vezes vão acontecer eventualmente ao longo do tempo devido a mecanismos além de aumento da atividade do eixo reprodutivo18, 30 , 31 (Figura 1). Um exemplo disso é a abertura vaginal atrasada nas fêmeas cKO (Figura 3B). As fêmeas de cKO nunca se tornará fértil devido à ausência de ovulação22 (Figura 3E). Com efeito, mais estudos de avaliação dos níveis hormonais e histologia gonadal dos ratos cKO demonstraram que estes ratos nunca completada a puberdade e inférteis22 (Figura 4B). Isto mostra o limite do uso de marcadores externos para determinar o início puberal. Conclusão da puberdade e atingindo a maturidade sexual requer maior liberação de GnRH e ativação do eixo reprodutivo (Figura 1), e para confirmar totalmente maturidade sexual tanto morfologia gonadal e níveis de hormônio circulante precisam ser avaliadas 22 , 31. nos machos, medição de testosterona e avaliar o tamanho da vesícula seminal e testículo morfologia e tamanho, além da qualidade do esperma vão confirmar puberdade foi alcançado16,22,32. Nas fêmeas, medir os níveis de estrogênio e progesterona em combinação com peso uterino e ovariano e morfologia irá confirmar a conclusão da puberdade17,19,22,33.
Tamanho de ninhada pode afetar o comprimento de gestação e idade de início puberal. Maioria das cepas de rato tem um período de gestação de 18 a 22 dias. No entanto, se a mãe estiver esperando uma ninhada grande, o período de gestação tende a ser reduzida34,35. Por outro lado, se a mãe está cuidando de uma ninhada anterior, isso pode resultar em uma extensão do período gestacional5. Filhotes em ninhadas grandes também tendem a ter retardado o início puberal. Isto é causado pelo seu crescimento, sendo ligeiramente atrasada1,9,34,35. Se é realizado um estudo de fertilidade e um dos grupos de rato (controle ou experimental) produz ninhadas muito grandes, é recomendável para homogeneizar a ninhada tamanhos, também denominados abate, permitindo que as ninhadas estudadas ter tamanhos comparáveis.
Reprodução só pode ser avaliada no vivo devido os múltiplos órgãos envolvidos na reprodução (Figura 1) e os mecanismos de feedback extensa regulação do eixo reprodutivo3. Certos aspectos da competência reprodutiva podem ser avaliados rapidamente através de um ensaio de obstrução vaginal, onde a capacidade do macho montar a fêmea e deixar uma ficha física na vagina é observada de13,36. Embora esta é uma abordagem útil para avaliar o comportamento sexual masculino, este tipo de estudo não permite a detecção de pequenos problemas na reprodução, nem faz é avaliar mantida fertilidade durante um longo período de tempo ou tamanho da ninhada resultante e comportamento parental. O protocolo descrito aqui apresenta inúmeras vantagens sobre um ensaio de obstrução, o major sendo a capacidade de identificar impactos menores e principais competência reprodutiva em machos e fêmeas (Figura 4).
Fertilidade diminui com a idade, e além do ciclo estral feminino torna-se mais longo e irregular durante o envelhecimento5,28. Portanto, recomenda-se iniciar um estudo de fertilidade em jovens e maduros sexualmente animais. Uma gama de idade normalmente usadas para configurar um estudo de fertilidade é de 10-16 semanas de idade. No entanto, é importante estar familiarizado com as características específicas de reprodução da estirpe do mouse utilizado no estudo, como existem diferenças importantes na reprodução e maturidade sexual entre mouse diferente ou estirpes de rato (Figura 5B). Informações adicionais sobre características reprodutivas podem ser encontradas em https://phenome.jax.org/ o JAX Mouse Phenome banco de dados. Realizando mais um (> 4 meses) estudo de fertilidade tem a vantagem de ser capaz de detectar cedo declínio reprodutivo, onde os ratos podem procriar normalmente durante os primeiros meses de 1-2 do ensaio da fertilidade, mas então um declínio precoce na reprodução começando antes 6 meses de idade.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradeço os autores que contribuem para o trabalho inicial, que é a base desta publicação. Graças a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan e Erica L. Schoeller para ajudar a preparar o manuscrito. Graças a Jessica Lee de Sora e queixo de Austin para assistência técnica com o manuscrito. H.M.H. foi apoiado por Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
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