Summary
Многие процедуры и генетические мутации влияют сроки половой зрелости и плодородия. Этот протокол описывает неинвазивный метод для оценки начала полового созревания в мышей и крыс до создания исследование фертильности в половозрелых животных.
Abstract
Оценка компетентности репродуктивного имеет решающее значение для понимания воздействия лечения или генетические манипуляции на оси репродуктивного, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Репродуктивного ось является ключевым интегратор окружающей и внутренней ввода адаптации рождаемости благоприятные условия для размножения. Прежде чем приступать к исследование фертильности у мышей и крыс, половой зрелости оценивается исключить возможность того, что наблюдаемое репродуктивного фенотипов, вызванных задержкой или отсутствует пубертатном начала. Этот протокол описывает неинвазивная подход к оценке пубертатном начала в мужчины через определение препуция разделения и женщин через влагалище и первая течка. После подтверждения завершения полового созревания и достижения половой зрелости может быть начато исследование фертильности. Процедура описывает условия оптимального размножения для мышей и крыс, как настроить исследование фертильности и какие параметры, чтобы оценить и определить, если лечение или удаление ген влияет на фертильность.
Introduction
Для достижения половой зрелости и репродуктивного компетенции требуется переходного периода полового созревания. Пубертатном переходного периода и поддержания плодородия в зрелом возрасте регулируется репродуктивного оси, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси (рис. 1). Сроки наступления полового созревания и поддержания плодородия жестко регулируется как внутренних, так и экологических факторов, чтобы увеличить шансы на выживание потомства и родители1,2. Этот протокол обеспечивает неинвазивная подход для определения начала полового созревания в мышей и крыс для подтверждения половой зрелости до создания плодородия исследование для оценки репродуктивного компетенции.
Исследование фертильности проводится в половозрелых животных и может быть начато после животные прошли через полового созревания. До начала полового созревания оси репродуктивного покоя, и ключевым фактором полового созревания, гонадолиберин (GnRH), выпускается на гипофиза в недостаточной суммы для начала полового созревания (рис. 1). Наступления полового созревания — сложный процесс, который приводит к увеличению выпуска GnRH на средний возвышение. ГнРГ способствует лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза, два гормоны, гонадной созревания и репродуктивной функции (рис. 1)3,4,5 .
Оскорбления к оси репродуктивного приведет снижение фертильности и может также заранее или задержки начала полового созревания. Условия, знаны, что влияют на сроки начала полового и репродуктивного компетенции включают в себя воздействие на эндокринную, нарушая химических веществ6,7, увеличение/уменьшение тела вес1,8, изменения в 2,длина день9 и генетические мутации10,11,12,13,14,15.
Наступления половой зрелости является важным шагом, который необходимо выполнить до настройки анализа фертильности. Преимущества определения пубертатном начала через препуция разделения, влагалище и первой течки, являются неинвазивные характеристики этих процедур, как они не требуют сбора крови или жертвоприношения животных16, 17.
После начала полового созревания определяется, правильно исследование фертильности обеспечит важную информацию о целостности репродуктивного оси и обычно имеет второе преимущество создания экспериментальных животных для дальнейшего исследования (уточнение) 18. установки исследование фертильности, указанных в настоящем Протоколе может обнаруживать мелкие и крупные дефициты в репродуктивных компетенции у самцов и самок. Основные параметры оценки включают в себя 1) время первый помет, 2) количество пометов, сгенерирована заданного размера сроки и 3) помет. Наконец включены рекомендации для типа последующих исследований, которые могут проводиться для определения причины ухудшения плодородия.
Описывается протокол относится к мышей и репрезентативных данных отражают работу у трансгенных мышей. Однако все включенные протоколы одинаково допустимы в крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Мичиганского государственного университета и проводились в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных.
1. определить наступления полового созревания
- Следуйте институциональных руководящих принципов для одежды, как минимум, надо носить пальто чистой лаборатории и чистые перчатки. Всегда обращайтесь в чистых перчатках мышей.
- Подготовка рабочей области, поместив площадку на столе.
- Место чистой мыши Кейдж Топ с сеткой вверх на клавиатуре.
- Настройка масштаба рабочей области. Место чистой 500 – 1000 мл стакан на шкале и тары.
- Поместите лист рядом с рабочей области, чтобы записывать веса и препуция разделения, влагалище или первой течки.
- Идентифицировать мышей для изучения. Выполнение ежедневных проверок для начала полового созревания до достижения половой зрелости. Выполните проверки в то же время дня всей учебы. Наступления полового созревания может произойти как послеродовой день 11-1219, однако, в самых экспериментальных установок, пубертатном начала мониторинга начинается ~ 22 дней.
- Место клетки мыши в рабочей области (шаг 1.2). Откройте отсек и поместите крышку, бутылку воды и продовольствия держатель на столе.
- Определение препуция разделения у мышей-самцов.
- Удерживая мышь за хвост, поместите его на верхней части клетки чистой мыши от шаг 1.2.1. Аккуратно придерживая на хвост, пусть мыши исследовать сетку верхней клетке за ~ 5 s.
- Осторожно потяните хвост назад; Это обычно приводит к двигаться вперед, держа на сетке с его передние конечности животного. Другой подход к коже закрыть, шею и уши.
- Понять дряблая кожа между плеч и шеи с большим и указательным пальцами. Важно получить хорошее владение кожи, как это поможет предотвратить превращение свою голову укусить мыши.
- Grab кожи на спине с оставшиеся пальцы и удерживайте ее, нажимая против руки. Крепко удерживайте без препятствовать дыханию, крови поток, или повреждения костей, мышц или кожи. Поверните руку, чтобы разоблачить живот мыши, поддерживая в задней части мыши в руке.
- Свободной рукой аккуратно отодвинуть кожи вокруг пениса без принуждения. В препуция разделения коже препуция слайды назад подвергая головки полового члена (рис. 2A, стрелка, указывающая препуция разделение). Запись, наличие или отсутствие препуция разделения.
- Весят мыши, аккуратно поставив в 500-1000 мл стакан из шага 1.2.2 и запишите вес.
- Вновь мыши в клетке жилищного строительства путем проведения стакан 0-2 см над полом клетке и медленно перевернуться стакан, позволяя мыши выйти на свой собственный. Очистить стакан с водой и мягким моющим средством и высушить его, прежде чем вернуть масштаб и Довешивание масштаба.
- Определение открытия влагалища у самок мышей.
- Поместите ватный шарик, стакан и бутылка стерильной воды в рабочей области (шаг 1.2). Налейте в стакан воды. Увлажняют ватный шарик стерильной водой и поместите его рядом с верхней клетке от шаг 1.2.1.
- Место клетки мыши в рабочей области (шаг 1.2) и передачи мыши от его дома клетке клетка верхней (шаг 1.2.1), удерживая его у основания хвоста. Осторожно потяните назад хвост, чтобы стимулировать движение вперед мыши.
- Поднимите хвост поддерживая бедра с бесплатным пальцами. Разрешить гомотерия поддерживать контакты с верхней части клетки. Если указатель мыши перемещается слишком много, держите его в руке, как описано в шагах 1.5.1-1.5.4.
- Аккуратно очистите вульвы с увлажненной ватный шарик воды из шага 1.6.1. Для каждой мыши используйте чистые увлажненные ватным тампоном. Чтобы определить влагалище, изучать вульвы и определить, открыта ли полностью во влагалище (рис. 2A, Женский вагинальный открытия).
- Запись, если произошла вагинальный открытия. Весят мыши и вернуть его домой клетку, как описано в шагах 1.5.6-1.5.7.
- Первая течка показатель первой овуляции.
- Поместите стакан с стерильной водой, обозначенные стеклянное скольжение и 200 мкл пипетки с чистой кончиком в рабочей области (шаг 1.2).
- Держите девушки, как описано в шаге 1.6.2-1.6.3. Поместите наконечник пипетки, содержащие ~ 50 мкл стерильной воды на влагалище.
- Осторожно промойте клетки от стенки влагалища, вводя и поглощая ~ 50 мкл воды 2 - 4 раза. Мазок содержание от кончика пипетки на обозначенные стекло микроскопа.
- Тщательно соблюдать клеточной морфологии на brightfield микроскопа с помощью 10 X или 20 X цели или пусть airdry мазок для ~ 1 час и затем изображение с 0,1% раствора метиленового синего (растворяют в ddH2O) (рис. 2B). Чтобы изображение, окунуть сушеные слайд в 0,1% раствора метиленового синего для ~ 30 s. Пусть слайд воздух сухой за 1 час.
- Наблюдать за слайды из шага 1.7.4 на микроскопе яркий поле 10 X или 20 X. Установите на стадии эстрального цикла (рис. 2B)20 , наблюдая морфологии клеток, который позволяет различать четыре отдельных этапа эстрального цикла (рис. 2B).
Примечание: Metestrus характеризуется сочетанием ороговевшем Плоскоклеточный эпителиальных клеток и лейкоциты, диэструса, лейкоциты, proestrus смесью лейкоциты и ядерных эпителиальных клеток и эструса в ороговевшем эпителиальных клеток (рис. 2B) 20. - Запишите вес тела и вернуть его домой клетку мыши, как описано в шагах 1.5.6-1.5.7. Вагинальных мазков прекращаются в день, когда мышь имеет своей первой течки (Рисунок 2Б).
2. желательно, разведение комнатных условий
- Убедитесь, что номер селекции имеет температуру ~ 20-24 ° C, с 55 ± 10% влажности и однородной обслуживание свет интенсивности ~ 300-400 люкс около 1 м над полом21. Эта интенсивность света позволяет желательно интенсивности света середину клетки 25-80 люкс. Для проверки интенсивности света, используйте свет метр.
- Использование автоматизированной системы для управления освещение в комнате селекции для обеспечения надлежащих сроков освещения на протяжении всего эксперимента. Оптимальные условия день длина для оценки фертильности в диапазоне грызунов от 12 h день (12 ч света и тьмы 12 h, LD12:12), «лето как» условия с 14 h света и 10 h тьмы (LD14:10)21.
- Подготовьте размножения клеток.
- Подготовьте клетку чистой мыши с крышкой, вода, еда, постельные принадлежности и гнездящихся на разводить пары.
- Заполнить клетки карты с всю необходимую информацию, включая пол, Дата рождения, штамм мыши и дату когда сопрягать вверх.
3. рождаемость исследование
- Идентифицировать животных, которые будут использоваться для изучения плодовитости. Убедитесь, что животные являются половозрелыми (шаг 1). Обычно используется возрастной диапазон создать исследование фертильности у мышей-10-16 недель возраста, где было завершено полового созревания в самых экспериментальных условиях.
- На чистый стол место разведения Кейдж, подготовленный в шаге 2.3.
- Поймать и удерживайте кнопку мыши.
- Медленно ввести перчатке в отсек мыши. Оставьте руки в клетке для короткого периода времени (~ 5-30 s), позволяя мышей адаптироваться к запах Перчатки и рук. Избегайте суеты и порывистых движений.
- Опустите чашевидный стороны близко к нижней части клетки и медленно подход к мышей. Они будут бежать. Когда они бегут за руку, поймать хвост одной мыши между большим и указательным пальцем.
- Поднимите мыши хвост для 2-3 s. Если мыши необходимо проходить дольше, держаться на хвост и поместите указатель мыши в чашевидный стороны, поддержание Держись хвост.
- Передача 1 кобель и впоследствии 1 женщин в клетку разведения, держа их за хвост (шаг 3.3). Убедитесь, что женщины находятся в стадии же эстрального при настройке анализа фертильности. Определите стадии эстрального самок, выполняя вагинальный мазок, как описано в шаге 1.7.
- Закройте клетке и убедитесь, что мышей имеют продовольствия, воды и раскроя материала. Прикрепите держатель карты клетке с картой клетки к клетке.
- Место размножения клетку на корпус стойки. Отпуск разведения Кейдж как спокойно можно на весь срок действия исследования плодородия. Провести исследование фертильности за 30 дней. Для каждой пары размножения вести подробный учет и 1 наступления даты сопрягать вверх, 2) дату рождения помета и 3 количество детенышей родился, включая погибших и живых детенышей. Выполните проверку мусор ежедневно на протяжении всего исследования.
- Продлить плодородия исследование для дополнительных 30-60 дней, если нет или слабое влияние на фертильность устанавливается в шаге 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные результаты являются от двух разных трансгенные мыши модели, где был удален фактор транскрипции в вентральной передней гомеобокс 1 (Vax1) во всем организме на один аллель, здесь называют гетерозиготных мышей (HET)13, или Vax1 условно был удален в течение GnRH нейронов22, здесь называют условным KO (СКО). До создания в исследовании фертильности, важно для подтверждения начала полового созревания у всех мышей.
Во-первых были созданы день и вес на влагалище и препуция разделения. В HET мышей, влагалище и препуция разделение произошло на ту же возраст и вес как и мышь управления (Рисунок 3А и F, соответственно). В противоположность этому, влагалище и препуция разделения значительно задерживается в cKO самок и самцов и связанные с увеличение веса (рисунок 3B и G, соответственно). Наступления полового созревания является в некоторой степени связанных с весом тела, и это особенно справедливо в отношении женщин23. Чтобы определить, если задержки открытия влагалища и препуция разделение было связано с задержками в наборе веса, вес тела на средний возраст открытия влагалища и препуция разделения в элементах управления (4,5 недель возраста) был по сравнению с веса тела в cKO самцов и женщины в возрасте 4,5 недель. В возрасте 4,5 недель женского контроля и cKO имели сопоставимые веса (рис. 3 c), тогда как cKO мужчины были немного тяжелее, чем элементы управления (рис. 3 H). Это указывает, что задержка в влагалище и препуция разделения в cKO связан не с задержкой в наборе веса.
Влагалище является маркер начала полового созревания и первой течки показатель того, что первая овуляция произошла, маркер завершения полового созревания17. Чтобы определить, если HET и cKO женщины достигли первой течки в то же возраст и вес как элементы управления, вагинальных мазков проводились ежедневно со дня открытия влагалища до первой течки (Рисунок 3E и 3D). HET мышей сопоставимых между элементами управления и HETs (рис. 3D) был первой течки и вес при первой течке. В противоположность этому cKO не продвинулись через эстрального цикла и не имеют первой течки в возрасте 80 дней (Рисунок 3E). Эта задержка была не из-за снижения веса (Рисунок 3E).
HET мышей с подтвержденным наступлением пубертатного были использованы для создания исследование фертильности. Assay фертильности был создан в свет 12 h и 12 h темных условиях (LD12:12) у трансгенных мышей на фоне генетических C57BL/6J. Мышей были в возрасте 10-16 недель в начале эксперимента. Были изучены четыре группы мышей: контроль вязки (WTxWT), управляют мужчины с HET женщин (WTxHET), HET мужчины с WT самок (HETxWT) и HET мужчины с HET самок (HETxHET). Во-первых количество пометов, созданный в 3 месяца было определено. Управления вязки (WTxWT) создан в среднем 2,8 литров в 3 месяца, который был сопоставим с HET мужчины в паре с управления самок (HETxWT, спаривания, рис. 4A). HET самок, в паре с WT мужчин (управления), или HET мужской, создаются ли значительно меньше пометов в исследовании фертильности 3 месяца, выявить, что самки HET subfertile13. Чтобы проиллюстрировать важность подтверждения пубертатном начала до настройки анализа фертильности, репродуктивного компетенции оценивалась в cKO мышей, где мужчины задержали препуция разделения (Рисунок 3 g) и женщины не имеют их первый эструса по 80-дневного возраста (Рисунок 3E). Исследование фертильности был создан > 1 недели после того, как мужчины имели препуция разделения и у самок на > 80 дней возраста. Во время исследования 70-дневный плодородия вязки управления генерируется в среднем 2,2 пометов, тогда как не помётов были получены от cKO женской паре с мужчиной WT, или cKO мужчины в паре с женщиной управления (WT) (рис. 4B), показывающие, что эти мыши являются бесплодными5,22.
Лучше охарактеризовать фенотип фертильности женщин HET, мы записали количество дней, которое потребовалось для создания первого помета. WTxWT вязки сгенерирована в среднем 22 дня (рис. 4 c), их первый помет, в который был сопоставим с HET мужчины в паре с WT самок. HET самок, в паре с WT мужчин занимает в среднем 58 дней производить их первый помет, который был похож на HETxHET вязки (рис. 4 c). Однако задержка в создании первого помета HET женщин был весьма разнородные и задержки более в HETxHET вязки, предлагая полу пенетрантностью фенотипа и вклад мужчин HET менструальной, наблюдается в HETxHET вязки13 .
Оценивая размер помета может дать важную информацию о овуляции/имплантации и спермы производства. Средний размер первых 3 пометов был определен. Интересно, что все спаривания значительно меньше пометов комбинации (WTxHET, HETxWT, HETxHET) производится по сравнению с элементов управления (WTxWT, Рисунок 4 d), показывая, что мужские и женские мышей HET subfertile.
Рисунок 1: оси гипоталамо гипофизарно гонадной контролирует полового созревания и репродукции. На вершине репродуктивного оси являются нейронов гипоталамуса kisspeptin (желтые круги) и гонадолиберин (GnRH) нейронов (зеленые круги). В отношении несовершеннолетних период (препубертатном) kisspeptin нейронов релиз мало kisspeptin на GnRH нейронов. После начала полового созревания kisspeptin освобождение ГнРГ нейронов увеличивается (после полового созревания). Увеличение выпуска GnRH в конце периода несовершеннолетних резко увеличивает лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) релиз из гипофиза, ведущих к гонадной созревания и репродуктивной функции в зрелом возрасте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: определение наступления полового созревания в мышах. Внешний маркер наступления полового созревания у мышей является препуция разделения (A) у самцов и вагинальный открытия в самок. Шкалы бар = 1 cm. (B) пример изображения от промывания влагалища, используемый для определения первой течки. Слайды были counterstained для 30 s с 0.1% метиленовым синим, airdried и наблюдается при 20-кратном. Черные стрелки указывают ядерных эпителиальных клеток, Желтые стрелки с черным контуром указывают лейкоциты и белые стрелки указывают ороговевшем эпителиальных клеток. Первый эструса произошла на 10 день после открытия влагалища. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: репрезентативных данных, который может быть создан из пубертатном начала исследования. (А, Б) Влагалище и вес на влагалище в моделях трансгенные мыши. (C) вес 4,5 недель в управления и cKO самок. (D, E) Возраст и вес при первой течке. (F, G) Возраст и вес на препуция разделения. (H) вес 4,5 недель в управления и cKO мужчины. Данные представляют собой средства ± SEM. N = 5-10 в группе, статистический анализ студента-t-тест. p< 0,01; p< 0,001. Эти цифры были изменены из предыдущей публикации13,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель анализа фертильности исследования трансгенных мышей. Оценки плодородия мышей Vax1 HET (A) и (B) cKO была исполнена в девственных 10 - для 16-week-old мышей и количество пометов, записанная в указанные сроки. Данные представляют собой средства ± SEM. статистического анализа была исполнена односторонний дисперсионный анализ, следуют Дуннетт множественные сравнения теста. * p< 0,05; p< 0,001. (C) число дней до первого помета (n = 5-12) и (D) средняя помет размер первых трех пометов (n = 10-13) было определено. Данные представляют собой средства ± SEM. статистического анализа было сделано студента-t-тест по сравнению с WT x веса *p< 0,05; p< 0.01. Эти цифры были изменены из предыдущей публикации13,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Настройка анализа фертильности. (A) пример разведение схемы и предлагаемое количество животных, необходимых для анализа фертильности. Общее количество животных, необходимых для исследования с 2 условия, такие как элемент управления против KO или управления диета против высоких жиров, где оценивается фертильность у самцов и самок: 2 мышей за спаривания (1 самец x 1 сука) x 8 животных каждого пола условия x 2 группы x 2 s (для оценки фертильности как мужчин, так и женщин) = в общей сложности 64 животных каждого исследования. Если параллельно проводится исследование мужского и женского плодородия, один набор управления x управления вязки можно обычно служат сравнить влияние на мужские и женские воспроизводства. (B) при настройке анализа фертильности, используется мышей нужно достигли половой зрелости. Различных штаммов мышей имеют различные характеристики репродуктивного и достигают половой зрелости в разных возрастов24. Информация о крысах предыдущие публикации25см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Общее самочувствие мышей имеет решающее значение для успешного плодородия пробирного21. При выполнении анализа фертильности, важно не физически проверить на мышей каждый день, как это может вызвать стресс. Далее Избегайте частых Кейдж изменения, как они также напряженный. Идеально клетка изменений будет проводиться не более чем 1 - 2 раза в неделю. Воздействия света на темной этапе негативно влияет на разводить в ночной грызунов. Не включайте свет в комнате разведения во время темных часов. Если во время темных часов не требуется вход в комнату, используйте освещение тусклое красный свет. Еще один стресс является наличие чрезмерного запахов, вибраций и шума в виварий для всех или части исследования. Чтобы помочь облегчить стресс и улучшить самочувствие мыши и разведения, дать мышей, раскроя материала или других видов обогащения. Здание гнездя является важным поведение у мышей и увеличит успех размножения. Гнезда позволяют мышей место, чтобы скрыть и играть. Здоровые и получающие нормальное питание животных породы хорошо, поэтому важно предоставить ad libitum доступ к высоким качеством пищи и воды. Если разведения пары начинают проявлять симптомы болезней, таких как дерматит (часто в C57BL/6J), зубов исправление прикуса или другой, исключите эти мышей из исследования. Кроме того если это исследование проводится в иммунодефицитных мышей, это ключ, что мыши номер содержится в чистоте для сохранения плодородия.
Чтобы надлежащим образом настроить исследование фертильности, важно решить, если исследование будет осуществляться в девственных мышей или проверенных заводчиков также тщательно выбрать мышей, используемые для управления вязки. Вязки управления следует параллельно с экспериментальной заводчиков. Это важно, как неизвестные или непредвиденные факторы стресса и изменения в окружающей среде может вызвать изменения в разведении ставки. Управления вязки преимущественно состоят из помета товарищей к экспериментальной мышей (Рисунок 5A). Это особенно важно, когда исследование фертильности делается в мышах с смешанными генетический фон за большие вариации в разведении характеристики мыши штаммов (Рисунок 5B).
Выявление менструальной фенотип может быть сложным из-за длительного длина исследования, и на необходимость проанализировать дополнительные параметры выявить ее причины. HET мышь в репрезентативных данных является хорошим примером скромного менструальной фенотип (рис. 4), и расширенного анализа необходимы для выявления мужчин менструальной. Как показывают Результаты представитель (рис. 3 и 4), нормальный по достижении половой зрелости (рис. 3A, Dи F) может быть связан с мужского и женского менструальной (рис. 4A, C, D ). В этом случае мышей были только югу плодородной, и таким образом продолжительность обучения был увеличен до 120 дней. Это имеет важное значение, как короче исследование фертильности (например., 60 дней) не смогли выявить фенотипа. Мужской менструальной был скромным и впервые показал когда HET мужчины были в паре с HET самок, которые также были subfertile (рис. 4A). Действительно менструальной HET мужчины было подтверждено при оценке средний размер помета хряков (рис. 4 d). Последующие исследования подтвердили мужской менструальной и показал качество плохое спермы в HET самцов, с ~ 80% сокращения в подвижных сперматозоидов13.
Когда выполнение плодородия и пубертатном начала учиться в мышей с основных задержка полового созревания начала (> 5 дней), важно учитывать различные факторы, которые регулируют пубертатном начало26. Хотя влагалище и первой течки чаще всего бывают сопутствующе обстоятельств в крыс, первой течки у мышей обычно происходит ~ 10 дней после открытия влагалища25,27. Поэтому рекомендуется обеспечить, что влагалище и первой течки устанавливаются при работе в крыс и мышей18,28. Наступления полового созревания связано с метаболического статуса и веса тела у самок и в незначительной степени в мужчины1,7,9,29, и как таковой, лечения или генетической мутации, замедление роста животных будет в некоторых случаях результат в задержки начала полового созревания. Чтобы определить, если задержки/улучшения в пубертатном начала может быть связано с быстрым/медленный рост, важно взвесить мышей ежедневно в ходе оценки начала полового созревания. Как показано на рисунке 3B и C, а также G и H, задержки с началом полового созревания не был связан с снижение веса, но был истинный задержка в начале полового созревания, что подтверждается гонадной гистологии и циркулирующих гормонов уровни22. Одним из основных ограничений использования препуция разделения и влагалище, как маркеры наступления полового созревания является, что оба часто случаются в конечном итоге со временем за счет механизмов другой чем повышенную активность репродуктивного оси18, 30 , 31 (рис. 1). Примером этого является задержках открытия влагалища в cKO самок (рис. 3B). CKO женщины никогда не стать плодородной из-за отсутствия овуляции22 (Рисунок 3E). Действительно дальнейшие исследования, оценки уровня гормонов и гонадной гистология cKO мышей продемонстрировали, что эти мыши никогда не завершено полового созревания и бесплодных22 (Рисунок 4B). Это показывает предел использования внешних маркеры для определения наступления полового созревания. Завершение созревания и достижения половой зрелости требует увеличение выпуска ГнРГ и активации репродуктивного оси (рис. 1), и полностью подтвердить половой зрелости гонадной морфологии и циркулирующих гормонов необходимо оценивать 22 , 31. в мужчины, измерения тестостерона и оценки семенных пузырьков размер и морфология семенников и размер Помимо качества спермы будет подтвердить полового созревания было достигнуто16,22,32. У самок измерение уровня прогестерона и эстрогена в сочетании с веса матки и яичников и морфология подтвердит завершение созревания17,19,22,33.
Помет размер может повлиять на беременность длины и возраст наступления полового созревания. Большинство штаммов мышь имеют периода беременности, 18-22 дней. Однако если мать ждет большой помет, период беременности, как правило, быть сокращение34,35. С другой стороны если мать кормит предыдущий помет, это может привести к расширению гестационного периода5. Детенышей в больших пометах, как правило, привели к задержке начала полового созревания. Это обусловлено их рост немного задерживается1,9,34,35. Если выполняется исследование фертильности и одной из групп мыши (управления или экспериментальных) производит очень большие пометы, рекомендуется для гомогенизации помет размеров, также называют забой, позволяя изучал пометов иметь сопоставимые размеры.
Воспроизведение может быть только начисленных в естественных условиях из-за нескольких органов, участвующих в репродукции (рис. 1) и обширной обратной связи механизмы, регулирующие репродуктивного оси3. Определенные аспекты репродуктивного компетенции можно быстро оценить через вагинальный подключения пробирного, где потенциал мужчин и смонтировать самка и оставить физической вилкой в влагалище наблюдается13,36. Хотя это является полезным подходом для оценки сексуального поведения мужчин, этот тип исследования не позволяют обнаружения незначительных проблем воспроизводства, ни делает это оценить поддерживал рождаемости для длительного периода времени или итоговый размер помета и родительского поведения. Протокол, описанные здесь представлены многочисленные преимущества над подключения пробирного, майор является способность идентифицировать мелкие и крупные воздействие на репродуктивные компетенции у самцов и самок (рис. 4).
Рождаемость уменьшается с возрастом, и Кроме того женщины эстральный цикл становится длиннее и нерегулярных во время старения5,28. Поэтому рекомендуется начинать исследование фертильности в молодые и пожилые сексуально животных. Обычно используется возрастной диапазон для настройки исследование фертильности является возраст 10-16 недель. Однако важно, чтобы ознакомиться с конкретными характеристиками, репродуктивное штамма мыши, используемых в исследовании, как между различными мыши или крысы штаммов (Рисунок 5B) существуют значительные различия в размножение и половой зрелости. Дополнительная информация о репродуктивных характеристики можно найти в JAX феном мыши базы данных https://phenome.jax.org/. Выполнение больше (> 4 месяца) исследование рождаемости имеет преимущество в состоянии обнаруживать ранние репродуктивного упадка, где мышей может породы обычно за первые 1-2 месяцев анализа рождаемости, но затем раннего спад в репродукции, начинающихся с до 6 месяцев возраста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Я благодарю авторов первоначальной работы, которая является основой этого издания. Благодаря Aitor Aguirre, Женевьев э. Райан и Эрика л Schoeller за помощь в подготовке рукописи. Благодаря ли Джессика Сора и Остин Чин для оказания технической помощи с рукописью. H.M.H. была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала национальных институтов здоровья под награду номер R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
