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Biology

Determinación de la capacidad reproductiva por confirmar Inicio puberal y de realizar un análisis de fertilidad en ratones y ratas

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

Muchos tratamientos y mutaciones genéticas influyen en la sincronización de la madurez sexual y la fertilidad. Este protocolo describe un método no invasivo para evaluar el inicio puberal en ratones y ratas antes de establecer un estudio de fertilidad en animales sexualmente maduros.

Abstract

Evaluación de la capacidad reproductiva es fundamental para entender el impacto de un tratamiento o manipulación genética en el eje reproductivo, que también se denomina el eje hipotalámico-pituitario-gonadal. El eje reproductivo es un integrador clave de entrada ambiental e interna adaptándose a las condiciones favorables para la reproducción de la fertilidad. Antes de embarcarse en un estudio de fertilidad en ratones y ratas, la madurez sexual se evalúa para excluir la posibilidad de que los fenotipos reproductivos observados son ocasionados por retraso o ausencia de inicio puberal. Este protocolo describe un enfoque no invasivo para determinar el inicio puberal en varones a través de la determinación de separación prepucial y en las hembras a través de la abertura vaginal y el primer estro. Después de la confirmación de la terminación de la pubertad y el logro de la madurez sexual, se puede iniciar un estudio de fertilidad. El procedimiento describe las condiciones de crianza óptimo para ratones y ratas, cómo montar un estudio de fertilidad y qué parámetros para evaluar y determinar si el tratamiento o la canceladura del gene tiene un impacto sobre la fertilidad.

Introduction

La transición a través de la pubertad es necesaria para alcanzar la madurez sexual y capacidad reproductiva. La transición de la pubertad y el mantenimiento de la fertilidad en la edad adulta está regulada por el eje reproductivo, también se denomina el eje hipotalámico-pituitario-gonadal (figura 1). El momento del inicio puberal y mantenimiento de la fertilidad es estrictamente regulados por factores internos como ambientales para aumentar las posibilidades de supervivencia de crías y padres1,2. Este protocolo proporciona un enfoque no invasivo para determinar el inicio puberal en ratones y ratas para confirmar la madurez sexual antes de la creación de un estudio de fertilidad para evaluar competencia reproductiva.

Un estudio de fertilidad se realiza en animales sexualmente maduros y puede iniciarse después de que los animales han pasado por la pubertad. Antes del inicio puberal, el eje reproductivo está quieto, y el factor clave de la maduración sexual, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), se libera en la hipófisis en cantidades suficientes para iniciar la pubertad (figura 1). Inicio puberal es un proceso complejo que resulta en mayor liberación de GnRH en la eminencia media. Promueve la GnRH hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante (FSH) hormona de la pituitaria, dos hormonas esenciales para la maduración gonadal y función reproductiva (figura 1)3,4,5 .

Insultos al eje reproductivo como resultado fertilidad reducida y pueden también avance o retardo de inicio puberal. Condiciones que influyen en el momento del inicio puberal y competencia reproductiva incluyen la exposición a la endocrina interrumpir productos químicos6,7, cuerpo de aumentar o disminuir peso1,8, cambios en día largo2,9 y mutaciones genéticas10,11,12,13,14,15.

El inicio de la madurez sexual es un paso crítico que necesita ser completada antes de la creación de un análisis de fertilidad. Las ventajas de determinar el inicio puberal, a través de separación prepucial, la abertura vaginal y el primer estro, son las características no-invasiva de estos procedimientos, ya que no requieren sangre o sacrificio de los animales16, 17.

Después se determina el inicio puberal, correctamente un estudio de fertilidad proporcionará información importante sobre la integridad del eje reproductivo y tiene generalmente la segunda ventaja de generar animales experimentales para estudios posteriores (refinamiento) 18. la configuración del estudio de fertilidad se describe en este protocolo puede detectar déficits mayores y menores en capacidad reproductiva en machos y hembras. Principales parámetros evaluados incluyen 1) vez a la primera camada, 2) el número de camadas que se generan en un determinado marco de tiempo y 3) camada tamaño. Por último, se incluyen recomendaciones para el tipo de seguimiento de los estudios que pueden realizarse para identificar la causa del deterioro de la fertilidad.

El protocolo descrito se refiere a los ratones y los datos representativos reflejan el trabajo realizado en ratones transgénicos. Sin embargo, todos los protocolos incluidos son igualmente válidos en ratas.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Michigan State University y realizadas de conformidad con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. determinar el inicio puberal

  1. Siga las directrices para la ropa, como mínimo, es necesario usar una bata limpia y guantes limpios. Siempre manejar ratones con guantes limpios.
  2. Preparar el área de trabajo colocando una almohadilla en la mesa.
    1. Coloque un ratón limpio la jaula con la rejilla hacia arriba en el teclado.
    2. Establecer una escala en el área de trabajo. Coloque un vaso de precipitados limpio 500 – 1000 mL en la balanza y tare.
    3. Coloque una hoja junto a la zona de trabajo registro de peso y separación prepucial, abertura vaginal o primer estro.
  3. Identificar los ratones para el estudio. Realizar inspecciones diarias para el inicio puberal hasta llega a la pubertad. Realizar la inspección a la misma hora del día durante todo el estudio. Inicio puberal puede ocurrir tan pronto como postnatal día 11-1219, sin embargo, en las configuraciones más experimentales, control de inicio puberal comienza en ~ 22 días.
  4. Colocar la jaula del ratón en el área de trabajo (paso 1.2). Abrir la jaula y coloca la tapa, botella de agua y titular de la comida sobre la mesa.
  5. Determinación de separación prepucial en ratones machos.
    1. Mientras sujeta el ratón por la cola, colocar en la tapa de la jaula de ratón limpio de paso 1.2.1. Mientras sostiene suavemente sobre la cola, deje el ratón explorar la rejilla de la parte superior de la jaula para ~ 5 s.
    2. Tire suavemente de la cola al revés; Esto resulta generalmente en el animal avanza sujetando a la red con sus patas delanteras. Enfoque del otro lado de la piel cerca del cuello y orejas.
    3. Sujete la piel flácida entre los hombros y el cuello con el pulgar y el índice. Es importante que un buen asimiento de la piel, ya que evitará que el ratón girando su cabeza a morder.
    4. La piel de la espalda con los dedos restantes del gancho agarrador y mantenga presionando contra la mano. Sujete firmemente, sin obstruir la respiración, sangre flujo o dañar los huesos, músculos o piel. Gire la mano para exponer el vientre del ratón, manteniendo la parte posterior del ratón dentro de la palma de la mano.
    5. Con la otra mano, empuje suavemente hacia atrás la piel alrededor del pene sin forzar. En la separación prepucial, la piel prepucial desliza hacia atrás, exponiendo el glande del pene (figura 2A, flecha mostrando separación prepucial). Registrar la presencia o ausencia de separación prepucial.
    6. Pesar el ratón colocando suavemente en el vaso de precipitados de 500-1000 mL del paso 1.2.2 y registrar el peso.
    7. Reintroducir el ratón en la jaula de la vivienda manteniendo el vaso 0-2 cm sobre el piso de la jaula y volcar lentamente el vaso que permite el ratón para salir por su cuenta. Limpie el vaso con agua y detergente y secarlo antes de regresar a la balanza y Tarar la báscula.
  6. Determinar la abertura vaginal en ratones femeninos.
    1. Coloque una bola de algodón, vaso y una botella de agua estéril en el área de trabajo (paso 1.2). Vierta el agua en el vaso. Humedecer la bola de algodón con el agua estéril y colocarlo al lado de la parte superior de la jaula del paso 1.2.1.
    2. Colocar la jaula del ratón en el área de trabajo (paso 1.2) y transferir el ratón de su jaula casera en la parte superior de la jaula (paso 1.2.1) manteniendo en la base de la cola. Suavemente jale hacia atrás la cola para alentar un movimiento hacia adelante del ratón.
    3. Levante la cola manteniendo las caderas con los dedos libres. Permita que los miembros posteriores mantener el contacto con la parte superior de la jaula. Si el ratón se mueve demasiado, sosténgala en la mano como se describe en pasos 1.5.1-1.5.4.
    4. Limpie suavemente la vulva con la bola de algodón humedecido de agua de paso 1.6.1. Utilice una bola de algodón humedecido limpia para cada ratón. Para determinar la abertura vaginal, examinar la vulva y determinar si la vagina está completamente abierta (figura 2A, abertura vaginal femenina).
    5. Registro si se ha producido la apertura vaginal. Pesan el ratón y volver a la jaula del inicio como se describe en pasos 1.5.6-1.5.7.
  7. Primer estro un indicador de la primera ovulación.
    1. Coloque un vaso de precipitados con agua estéril, un portaobjetos de vidrio etiquetados y una pipeta de 200 μL con una punta limpia en el área de trabajo (paso 1.2).
    2. Sostenga la hembra como se describe en el paso 1.6.2-1.6.3. Coloque la punta de la pipeta que contiene ~ 50 μl de agua estéril en el orificio vaginal.
    3. Suavemente limpiar las células de la pared vaginal introduciendo y reabsorción ~ 50 μl de agua 2 - 4 veces. Borrón de transferencia del contenido de la pipeta sobre un portaobjetos de vidrio etiquetados.
    4. Observar cuidadosamente la morfología celular en un microscopio de campo luminoso usando un 10 X o 20 X objetivo o dejar el borrón de transferencia seca al aire para ~ 1 h y luego contratinción con una solución de azul de metileno 0.1% (disuelta en ddH2O) (figura 2B). Para contratinción, sumergir el portaobjetos seco en la solución de azul de metileno 0.1% para ~ 30 s. Airee el portaobjetos durante 1 h.
    5. Observar las diapositivas de paso 1.7.4 en un microscopio de campo brillante 10 X o 20 X. Establecer la etapa del ciclo estral (figura 2B)20 mediante la observación de la morfología celular que permite distinguir las cuatro distintas etapas del ciclo estral (figura 2B).
      Nota: Metestro se caracteriza por una mezcla de leucocitos, cornified las células epiteliales escamosas, proestro, diestro por los leucocitos de una mezcla de leucocitos y células epiteliales nucleadas y celo por las células epiteliales cornified (figura 2B) 20.
    6. Registrar el peso del cuerpo y devolver el ratón a su jaula casera como se describe en pasos 1.5.6-1.5.7. Frotis vaginales se terminan el día en que el ratón tiene su primer estro (figura 2B).

2. deseable condiciones de la sala de cría

  1. Asegúrese de que la sala de cría tiene una temperatura de 20-24 ° C, 55 ± 10% de humedad y homogénea sala luz de una intensidad de ~ 300-400 lux aproximadamente 1 m por encima del piso21. Esta intensidad de la luz permite que la intensidad de luz media jaula deseable de 25-80 lux. Para probar la intensidad de la luz, utilice un medidor de luz.
  2. Utilizar un sistema automatizado para el control de la iluminación en la sala de cría para garantizar la adecuada sincronización de iluminación durante todo el experimento. Condiciones óptimas de la duración del día para evaluar la fertilidad en gama de roedores de un día de 12 h (12 h luz y 12 h oscuridad, LD12:12), para "verano" condiciones a 14 h de luz y 10 h oscuridad (LD14:10)21.
  3. Preparación de jaulas de cría.
    1. Preparar una jaula ratón limpio con tapa, agua, comida, ropa de cama y nidificación por pareja de cría.
    2. Llenar las tarjetas de jaula con toda la información requerida, incluyendo sexo, fecha de nacimiento, la cepa de ratón y la fecha cuando el acoplamiento está configurado.

3. fertilidad estudio

  1. Identificar los animales para el estudio de fertilidad. Asegúrese de que los animales son sexualmente maduros (paso 1). Un rango de edad típicamente usada para establecer un estudio de fertilidad en ratones es 10-16 semanas de edad, una edad donde se ha completado la maduración sexual en las condiciones más experimentales.
  2. Sobre una mesa limpia, coloque la jaula de cría preparada en el paso 2.3.
  3. Captura y mantenga presionado el ratón.
    1. Introducir lentamente una mano enguantada en la jaula del ratón. Deja la mano en la jaula durante un período corto de tiempo (~ 5-30 s), permitiendo a los ratones para adaptarse al olor del guante y la mano. Evitar movimientos espasmódicos y agitados.
    2. Baje la mano cónica cerca de la parte inferior de la jaula y lentamente se aproximan a los ratones. A funcionar lejos. Cuando ejecuta sobre la mano, atrapar la cola de un ratón entre el pulgar y el dedo índice.
    3. Levante el ratón por la cola para 2-3 s. Si el ratón tiene que celebrarse más, sostener la cola y colocar el ratón en la mano cónica mantener la espera en la cola.
  4. Transferir 1 macho y 1 hembra en la jaula de cría, sosteniendo por la cola (paso 3.3). Asegúrese de que las hembras están en la misma etapa de estro al configurar el análisis de fertilidad. Determinar la etapa de estro de las hembras realizando un frotis vaginal como se describe en paso 1.7.
  5. Cerrar la caja y asegurarse de que los ratones tienen material alimentos, agua y anidación. Fije el titular de la tarjeta de la jaula con la tarjeta de la jaula a la jaula.
  6. Coloque la jaula de cría en la vivienda. Deje la jaula de cría tan tranquilo como sea posible para la duración completa del estudio de fertilidad. Realizar el estudio de fertilidad por 30 días. Para cada par de crianza, mantener registros detallados y Nota 1) la fecha que del apareamiento está configurado, 2) la fecha nacen camadas y 3) el número de cachorros nacidos, incluyendo cachorros muertos y vivos. Verifica la basura todos los días durante todo el estudio.
  7. Prolongar la fertilidad estudio para un 30-60 días adicionales si no o un débil impacto sobre la fertilidad se estableció en paso 3.6.

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Representative Results

Los resultados presentados son de dos modelos de ratón transgénico diferente donde la transcripción factor Ventral anterior caja homeo 1 (Vax1) se ha eliminado en todo el cuerpo en un alelo, aquí conocido como heterocigoto ratones (HET)13o Vax1 ha sido borrado condicional dentro de GnRH neuronas22, aquí llamado KO condicional (cKO). Antes de establecer el estudio de fertilidad, es importante confirmar Inicio puberal en los ratones.

En primer lugar, el día y el peso en la abertura vaginal y separación prepucial se establecieron. En los ratones HET, apertura vaginal y prepucial separación se produjeron en la misma edad y peso como los ratones de control (Figura 3A y F, respectivamente). En contraste, apertura vaginal y separación prepucial fueron significativamente retrasadas en machos y hembras de cKO y asociadas a mayor peso corporal (figura 3B y G, respectivamente). Inicio puberal es en cierta medida asociado con el peso corporal, y esto es particularmente cierto en mujeres23. Para determinar si el retraso en la apertura vaginal y separación prepucial se asoció con un retraso en el aumento de peso, el peso del cuerpo en la edad media de la abertura vaginal y separación prepucial en los controles (4,5 semanas de edad) fue comparado con el peso del cuerpo en cKO en varones y las hembras a las 4,5 semanas de edad. En la edad 4,5 semanas, controles femeninos y cKO tenían peso comparable (figura 3), mientras que los machos cKO eran ligeramente más pesados que los controles (figura 3 H). Esto indica que el retraso en la apertura vaginal y separación prepucial en cKO no está asociados con un retraso en el aumento de peso.

Abertura vaginal es un marcador precoz de maduración sexual y el primer estro un indicador de que la primera ovulación ha ocurrido, un marcador de finalización de la pubertad17. Para determinar si las hembras HET y cKO alcanzaron primer estro en la misma edad y peso como controles, se realizaron frotis vaginales diariamente desde el día de la abertura vaginal hasta el primer estro (figura 3E y 3D). En los ratones HET, primer estro y el peso al primer estro fue comparable entre los controles y HETs (figura 3D). En cambio, cKO no progresar a través del ciclo estral y no tienen el primer celo a la edad de 80 días (figura 3E). Este retraso no fue debido a la disminución del peso corporal (figura 3E).

Los ratones HET con confirmado Inicio puberal se utilizaron para el estudio de fertilidad. El análisis de fertilidad se estableció en 12 horas luz y oscuridad de 12 h (LD12:12) en ratones transgénicos en un fondo genético de C57BL/6J. Los ratones fueron envejecidos 10-16 semanas al inicio del experimento. Se estudiaron cuatro grupos de ratones: control de apareamientos (WTxWT), control de machos con hembras HET (WTxHET), HET machos con hembras WT (HETxWT) y varones HET con hembras HET (HETxHET). En primer lugar, se determinó el número de camadas generado en 3 meses. Apareamientos de control (WTxWT) generan un promedio de 2,8 litros en 3 meses, que era comparable a HET machos con las hembras control (HETxWT apareamiento, Figura 4A). Hembras HET, si junto con un peso macho (control), o un hombre, HET generaron camadas significativamente menos en el estudio de fertilidad de 3 meses, revelando que las hembras HET son subfértiles13. Para ilustrar la importancia de confirmar Inicio puberal antes de establecer un análisis de fertilidad, capacidad reproductiva se evaluó en ratones cKO, donde los varones habían retrasado separación prepucial (figura 3) y las hembras no tienen su primer estro por 80 días de edad (figura 3E). Se creó el estudio de fertilidad > 1 semana después de que los machos tenían separación prepucial y en hembras en > 80 días de edad. Durante el estudio de fertilidad de 70 días, apareamientos de control generaron un promedio de 2,2 litros, considerando que no hay camadas se generaron a partir el cKO mujer emparejada con un hombre de peso, o el cKO macho emparejado con una hembra de control (WT) (Figura 4B), mostrando que estos ratones son estériles5,22.

Para mejor caracterizar el fenotipo de la fertilidad de las hembras HET, se registró el número de días que se tardó en generar la primera camada. WTxWT apareamientos generan su primera camada en un promedio de 22 días (figura 4), que era comparable a HET machos con las hembras de peso. Hembras HET emparejadas con machos de peso tuvo un promedio de 58 días para producir su primera camada, que era similar a los acoplamientos HETxHET (figura 4). Sin embargo, el retraso en la generación de la primera camada de las hembras HET era muy heterogéneo y demora más en apareamientos HETxHET, sugiriendo un semi-penetrancia del fenotipo y una contribución del macho HET a la subfertilidad observado en apareamientos HETxHET13 .

Evaluar el tamaño de camada puede dar importante información sobre la producción de la implantación de la ovulación y el espermatozoide. Se determinó el tamaño promedio de las 3 primeras camadas. Curiosamente, todos los apareamiento combinaciones (WTxHET, HETxWT, HETxHET) producidas camadas significativamente menores en comparación con controles (WTxWT, figura 4), mostrando que tanto hombres como mujeres los ratones HET son subfértiles.

Figure 1
Figura 1: el eje hipotalámico-pituitario-gonadal controla la maduración sexual y reproducción. En el ápice del eje reproductivo son las neuronas hipotalámicas kisspeptin (círculos amarillos) y hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) neuronas (círculos verdes). En el periodo juvenil (prepúberes), neuronas kisspeptin suelte poco kisspeptin en las neuronas de GnRH. Después del inicio puberal, liberación de kisspeptin en las neuronas de GnRH está aumentada (posterior a la pubertad). Mayor liberación de GnRH en el último período juvenil aumenta dramáticamente la hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante de la liberación de la hormona (FSH) de la pituitaria, llevando a la maduración gonadal y función reproductiva en la edad adulta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: determinación del inicio puberal en los ratones. Un marcador externo del inicio puberal en ratones es (A) separación prepucial en machos y vaginal en las hembras. Barra de escala = 1 cm. (B) imágenes de ejemplo de lavado vaginal para determinar el primer estro. Diapositivas se contratinción durante 30 s con azul de metileno 0,1%, enjabonarse y observado con 20 aumentos. Las flechas negras indican las células epiteliales nucleadas, flechas amarillas con contorno negro indican leucocitos y flechas blancas indican cornified las células epiteliales. Primer estro ocurrió el día 10 después de la apertura vaginal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: datos representativos que pueden generarse desde un estudio de inicio puberal. (A, B) Abertura vaginal y el peso en la abertura vaginal en los modelos de ratón transgénico. (C) peso a las 4,5 semanas en las hembras control y cKO. (D, E) Edad y peso al primer estro. (F, G) Edad y peso en la separación prepucial. (H) peso a las 4,5 semanas en machos control y cKO. Los datos representan medios ± SEM. N = 5-10 por prueba de grupo análisis estadístico t de Student. p< 0.01; p< 0.001. Estas cifras se han modificado desde la anterior publicación13,22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: análisis representativos de un estudio de fertilidad de los ratones transgénicos. Evaluación de la fertilidad de los ratones (A) Vax1 HET y cKO (B) fue realizado en ratones de 10 a 16 semanas de edad Virgen y registró el número de camadas en los plazos indicados. Los datos representan medios ± SEM. estadístico análisis fue realizado por ANOVA de una vía seguido de prueba de comparación múltiple de Dunnett. * p< 0.05; p< 0.001. (C) el número de días a la primera camada (n = 5-12) y (D) tamaño de camada promedio de las tres primeras camadas (n = 10-13) se determinó. Los datos representan medios ± SEM. estadístico análisis fue hecho por la prueba t de Student en comparación con el peso x peso *p< 0.05; p< 0.01. Estas cifras se han modificado desde la anterior publicación13,22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: configuración de un análisis de fertilidad. (A) ejemplo de esquema y la propuesta número de animales requeridos para un análisis de fertilidad. El número total de animales requeridos para un estudio con 2 condiciones tales como un control versus dieta KO o control versus dieta alta en grasas donde se evalúa la fertilidad en machos y hembras: 2 ratones por apareamiento (1 macho x 1 hembra) x 8 animales por género de las condiciones x 2 de grupo x 2 s (para evaluar la fertilidad masculina y femenina) = total de 64 animales por estudio. Si el estudio de fertilidad masculina y femenina se realiza en paralelo, un sistema de control x control apareamientos puede servir generalmente para comparar tanto el impacto sobre la reproducción masculina y femenina. (B) al establecer un análisis de fertilidad, los ratones utilizados necesitan haber alcanzado la madurez sexual. Diferentes cepas de ratones tienen características reproductivas diferentes y alcanzan la madurez sexual a las diferentes edades24. Para obtener información sobre las ratas, ver publicación anterior25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El bienestar general de los ratones es crítico para una fertilidad exitoso ensayo21. Cuando se realiza un análisis de fertilidad, es importante controlar no físicamente en los ratones cada día ya que esto puede causar estrés. Además evitar cambios frecuentes de la jaula, ya que también son estresantes. Idealmente se realizará cambios de jaula no más de 1 - 2 veces por semana. Exposición a la luz durante la fase oscura afecta negativamente la reproducción en roedores nocturnos. No se encienden las luces en la sala de cría durante las horas oscuras. Si la entrada a la sala es necesaria durante las horas oscuras, use luz roja tenue iluminación. Otro factor estresante es la presencia de olores excesivos, vibraciones o ruido en el vivero para la totalidad o partes del estudio. Para ayudar a aliviar el estrés y mejorar la crianza y bienestar del ratón, dar los ratones anidando materiales u otros tipos de enriquecimiento. Nido es un comportamiento importante en ratones y aumentar el éxito reproductivo. Los nidos también permiten a los ratones un lugar para esconderse y jugar. Raza de animales sanos y bien alimentados bien, por lo tanto, es importante proporcionar acceso ad libitum a agua y alimentos de alta calidad. Si las parejas reproductoras comienzan a exhibir síntomas de la enfermedad, tales como dermatitis (frecuente en C57BL/6J), maloclusión dental u otros, excluir estos ratones del estudio. Además, si se hace el estudio en ratones inmunodeficientes, es clave que la sala del ratón se mantiene limpia para preservar fertilidad.

Para configurar adecuadamente un estudio de fertilidad, es importante decidir si se realizará el estudio en ratones vírgenes o criadores probados así como cuidadosamente selecciona los ratones utilizados para el control de los acoplamientos. Apareamientos de control se deben ejecutar en paralelo con los criadores experimentales. Esto es imperativo como estresores desconocidos o imprevistos y cambios en el ambiente pueden causar cambios en la tasa de reproducción. Apareamientos de control se componen preferentemente de compañeros de camada a los ratones experimentales (figura 5A). Esto es particularmente importante cuando se realiza el estudio de fertilidad en ratones con fondo genético mixto debido a las variaciones grandes en la crianza de características entre cepas de ratón (figura 5B).

Identificación de un fenotipo de subfertilidad puede ser difícil debido a la prolongada duración del estudio y la necesidad de analizar parámetros adicionales para revelar su causa. El ratón HET en datos representativos es un buen ejemplo de un fenotipo de subfertilidad moderada (figura 4), y el análisis extendido necesaria para identificar la subfertilidad masculina. Como se muestra en los Resultados de la representante de (figura 3 y 4), Inicio normal de la pubertad (Figura 3A, Dy F) puede ser asociado con subfertilidad masculina y femenina (Figura 4A, C, D ). En este caso, los ratones eran solamente el fértiles, y por lo tanto la duración del estudio fue ampliada a 120 días. Esto es importante, como un estudio de fertilidad más corto (por ej., 60 días) no habría sido capaz de revelar el fenotipo. La subfertilidad masculina era modesta y revelado por primera vez cuando los machos HET se aparearon con hembras HET, que también eran subfértiles (Figura 4A). De hecho, la subfertilidad de machos HET se confirmó al evaluar el tamaño medio de camadas deseada (figura 4). Seguimiento de estudios confirmó la subfertilidad masculina y reveló una calidad pobre de la esperma en los varones HET, con una reducción de ~ 80% de espermatozoides móviles13.

Cuándo realizar una fertilidad y pubertad Inicio estudio en ratones con un importante retraso en el inicio puberal (> 5 días), es importante considerar los diferentes factores que regulan el inicio puberal26. Aunque la apertura vaginal y el primer estro ocurren más a menudo concomitante en ratas, primer estro en ratones ocurre generalmente aproximadamente 10 días después de la apertura vaginal25,27. Por lo tanto, se recomienda asegurar que abertura vaginal y primer estro se establecen cuando se trabaja en ratas y ratones de18,28. Inicio puberal está vinculado al estado metabólico y peso corporal en hembras y en menor grado en los machos1,7,9,29, y como tal, será un tratamiento o una mutación genética desaceleración del crecimiento animal en el resultado de algunos casos en un inicio puberal retrasado. Para determinar si el retraso/adelanto en el inicio puberal puede asociarse con crecimiento lento rápido, es importante sopesar los ratones diariamente durante la evaluación del inicio puberal. Como se ve en la figura 3B y C, así como G y H, el retraso en el inicio puberal no se asoció con disminución del peso corporal, pero fue un cierto retraso en el inicio puberal, según lo confirmado por histología gonadal y hormonal que circula los niveles de22. Una de las principales limitaciones de separación prepucial y abertura vaginal como marcadores del inicio puberal es que ambos a menudo ocurrirá finalmente con el tiempo debido a mecanismos de mayor actividad del eje reproductivo18, 30 , 31 (figura 1). Un ejemplo de ello es la apertura vaginal retrasada en las hembras de cKO (figura 3B). Las hembras cKO no ser fértiles debido a una ausencia de ovulación22 (figura 3E). De hecho, más estudios que evalúen los niveles hormonales y la histología gonadal de los ratones de cKO demostraron que estos ratones nunca completaron pubertad y estériles22 (Figura 4B). Esto muestra el límite de uso de marcadores externos para determinar el inicio puberal. Terminación de la pubertad y alcanzar la madurez sexual requiere mayor liberación de GnRH y la activación del eje reproductivo (figura 1), y para confirmar plenamente la madurez sexual morfología gonadal y niveles de hormonas circulantes deben evaluarse 22 , 31. en varones, testosterona de medición y evaluación de tamaño de la vesícula seminal y morfología del testículo y además de la calidad del esperma confirmará la pubertad fue alcanzado16,22,32. En las hembras, medir los niveles de progesterona y el estrógeno en combinación con morfología y peso uterino y ovárico confirmará la finalización de la pubertad17,19,22,33.

Tamaño de camada puede afectar la longitud de la gestación y la edad de inicio puberal. Mayoría de las cepas de ratón tiene un período de gestación de 18-22 días. Sin embargo, si la madre está esperando una camada grande, el periodo de gestación suele ser reducido34,35. Por otro lado, si la madre amamanta a la camada anterior, esto puede resultar en una extensión del período gestacional5. Cachorros en camadas grandes tienden también a han retrasado el inicio puberal. Esto es causado por su crecimiento siendo un poco retrasado1,9,34,35. Si se realiza un estudio de fertilidad y uno de los grupos de ratón (control o experimental) produce camadas muy grandes, se recomienda homogeneizar tamaños de camada, también se denomina sacrificio, permitiendo que las camadas estudiadas que tienen tamaños comparables.

Reproducción sólo puede ser evaluado en vivo debido a los múltiples órganos implicados en la reproducción (figura 1) y los mecanismos de retroalimentación extensa regulación reproductiva eje3. Ciertos aspectos de la competencia reproductiva pueden ser evaluadas rápidamente a través de un ensayo de taponamiento vaginal, donde la capacidad del macho para montar a la hembra y dejar un tapón físico en la vagina se observa13,36. Aunque este es un método útil para evaluar el comportamiento sexual masculino, este tipo de estudios no permite la detección de problemas de menor importancia en la reproducción, ni hace evaluar mantener fertilidad durante un largo periodo de tiempo o tamaño de la camada resultante y el comportamiento parental. El protocolo descrito aquí presenta numerosas ventajas frente a un ensayo de taponamiento, los principales siendo la capacidad de identificar los impactos mayores y menores en la capacidad reproductiva en machos y hembras (figura 4).

La fertilidad disminuye con la edad, y además el ciclo estral femenino se convierte en más largo e irregular durante el envejecimiento5,28. Por lo tanto se recomienda iniciar un estudio de fertilidad en jóvenes y maduros sexualmente animales. Un rango de edad típicamente usada para un estudio de fertilidad es 10-16 semanas de edad. Sin embargo, es importante estar familiarizado con las características específicas de la reproducción de la cepa de ratón utilizada en el estudio, existen diferencias importantes en la reproducción y la madurez sexual entre diferentes ratón o rata cepas (figura 5B). Puede encontrar información adicional acerca de características reproductivas en el https://phenome.jax.org/ base de datos de JAX ratón Fenoma. Realizar un más largo (> 4 meses) estudio de fertilidad tiene la ventaja de ser capaces de detectar la declinación reproductiva temprana, donde los ratones pueden reproducirse normalmente durante los primeros meses de 1-2 de la prueba de fertilidad, pero luego tienen un declive temprano en la reproducción antes de 6 meses de edad.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

Agradezco a los autores que contribuyen a la labor inicial que es la base de esta publicación. Gracias a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan y Erica L. Schoeller ayuda a preparar el manuscrito. Gracias a Jessica Sora Lee y barbilla de Austin para asistencia técnica con el manuscrito. H.M.H. fue apoyado por Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R00HD084759.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

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References

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Biología número 140 Inicio puberal análisis de fertilidad capacidad reproductiva separación prepucial abertura vaginal primer estro ratón roedor rata hombre mujer peso
Determinación de la capacidad reproductiva por confirmar Inicio puberal y de realizar un análisis de fertilidad en ratones y ratas
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Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

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