Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Pubertal başlangıçlı teyit ve doğurganlık tahlil fare ve sıçanlar üreme yetkinlik belirlenmesi

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

Birçok tedaviler ve genetik mutasyonlar cinsel olgunluk ve doğurganlık zamanlaması etkisi. Bu iletişim kuralı fare ve sıçanlar cinsel olgun hayvanlar doğurganlık çalışmada kurma önce pubertal başlangıçlı değerlendirmek için non-invaziv bir yöntem açıklanır.

Abstract

Üreme yeterlilik değerlendirmesi bir tedavi veya genetik manipülasyon Ayrıca hipofiz gonad hipotalamik eksen olarak adlandırdığı üreme ekseninde etkisini anlamak için önemlidir. Bir anahtar ıntegrator çevre ve iç giriş koşulları için üreme doğurganlık adapte üreme eksendir. Fare ve sıçanlar doğurganlık çalışmada üzerine başlamadan önce cinsel olgunluğa gözlenen üreme fenotipleri neden olduğu olasılığını dışlamak için değerlendirilir Gecikmeli veya pubertal başlangıçlı yok. Bu iletişim kuralı pubertal başlangıçlı Prepusyal ayrılık belirlenmesi ile erkek ve kadın vajinal açılış ve ilk estrus değerlendirmek için non-invaziv bir yaklaşımı açıklar. Ergenlik tamamlanması ve cinsel olgunluğa başarı onay alındıktan sonra bir doğurganlık çalışma başlatılabilir. Yordamı fareler ve sıçanlar, nasıl bir doğurganlık çalışma ve değerlendirmek ve tedavi veya gen silme etkisi doğurganlık üzerinde olup olmadığını belirlemek için hangi parametreler için optimum üreme koşulları açıklar.

Introduction

Ergenliğe geçiş cinsel olgunluk ve üreme yeterlilik ulaşmak için gereklidir. Pubertal geçiş ve bakım doğurganlık erişkin dönemde de hipofiz gonad hipotalamik eksen (Şekil 1) olarak adlandırdığı üreme eksen tarafından düzenlenir. Pubertal başlangıçlı zamanlaması ve bakım doğurganlık yavru ve anne1,2yaşama şansını artırmak için iç hem de çevresel faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu iletişim kuralı fare ve sıçanlar üreme yetki değerlendirmek için bir doğurganlık çalışma ayarı önce cinsel olgunluğa onaylamak için pubertal başlangıçlı belirlemek için non-invaziv bir yaklaşım sağlar.

Bir doğurganlık çalışma cinsel olgun hayvanlarda gerçekleştirilir ve sonra hayvanlar ergenlik gitti başlatılabilir. Pubertal başlangıçlı önce üreme eksen durgun olduğunu ve cinsel olgunlaşma, gonadotropin - releasing hormon (GnRH), anahtar sürücü ergenlik (Şekil 1) başlatmak için yeterli miktarda hipofiz üzerine serbest bırakılır. Pubertal başlangıçlı medyan Hazretleri, artan GnRH sürümdeki sonuçları karmaşık bir süreçtir. GnRH luteinizan hormon (LH) ve hormon (FSH) salgılanması hipofiz, üzerinden iki hormon gonad olgunlaşma ve üreme işlevi (Şekil 1)3,4,5 için gerekli uyarıcı folikül teşvik .

Hakaret üreme eksenine düşük doğurganlık neden ve ayrıca peşin veya gecikme pubertal başlangıçlı. Pubertal başlangıçlı ve üreme yetkinlik zamanlaması etkilemek için bilinen koşullar kimyasallar6,7, artış/azalma vücut ağırlığı1,8, değişimler engellemeden endokrin maruz yer gün uzunluğu2,9 ve genetik mutasyonlar10,11,12,13,14,15.

Cinsel olgunluğa başlangıçlı bir doğurganlık tahlil ayarlama önce tamamlanması gereken kritik bir adımdır. Prepusyal ayırma, vajinal açılış ve ilk estrus pubertal başlangıçlı belirleme avantajları vardır bu yordamları, non-invaziv özellikleri kanı toplama ve fedakarlık hayvan16, gerekmez 17.

Pubertal başlangıçlı belirlenir sonra düzgün bir doğurganlık çalışma ayarı üreme eksen bütünlüğü hakkında önemli bilgiler sağlar ve genellikle daha fazla çalışmalar (arıtma) deneysel hayvan üreten ikinci bir avantaja sahiptir 18. bu protokol için açıklanan doğurganlık çalışma Kur hem küçük ve büyük açıkları ve erkeklerde üreme yeterlilik algılayabilir. Anahtar değerlendirilen parametreler yer 1) zaman ilk çöp, 2) belirli bir zaman dilimi ve 3) çöp boyutu oluşturulan çöp sayısı için. Son olarak, doğurganlık bozulma nedenini belirlemek için yapılan çalışmalar takip türü için öneriler yer almaktadır.

Açıklanan protokol fareler için başvurur ve transgenik Farelerde yapılan işler temsilcisi verileri yansıtacak. Ancak, dahil tüm iletişim kuralları fareler aynı derecede geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Michigan State University tarafından onaylanmış ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu uygun olarak yürütülen.

1. belirlemek Pubertal başlangıçlı

  1. Giyim, en azından kurumsal yönergeleri izleyin, temiz bir önlük ve temiz eldiven giymek gereklidir. Her zaman temiz eldiven giymiş fareler başa.
  2. Çalışma alanının masaya bir yastık koyarak hazırlamak.
    1. Bir temiz fare kafes üst kılavuz belgili tanımlık yastık üzerinde yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
    2. Çalışma alanının bir ölçekte ayarlayın. Temiz 500 – 1000 mL kabı ölçek ve dara yerleştirin.
    3. Kayıt vücut ağırlığı ve Prepusyal ayırma, vajinal açılış veya ilk estrus çalışma alanının yanındaki bir sayfa yerleştirin.
  3. Fareler çalışma için tanımlayın. Ergenlik ulaşılana kadar günlük teftiş için pubertal başlangıçlı gerçekleştirin. Çalışma boyunca günün aynı zamanda kontrol edin. Pubertal başlangıçlı gibi erken postnatal gün 11-1219, ortaya çıkabilir ancak en deneysel kurulumları, pubertal başlangıçlı ~ 22 gün başlar3dakika.
  4. Çalışma alanı (adım 1.2) fare kafeste bir yer. Kafesi açın ve kapak, su şişesi ve gıda sahibi masaya koyun.
  5. Erkek farelerde Prepusyal ayrılık belirleniyor.
    1. Fareyi kuyruğundan tutarak, adım 1.2.1 temiz fare kafesi üzerine yerleştirin. Yavaşça kuyruk tutarken, fareyi ~ 5 için kafes üst kılavuz keşfetmek izin s.
    2. Yavaşça kuyruk geriye çekin; Bu genellikle onun ayaklarından kılavuzla tutarken ilerlemeye hayvan olur. Yaklaşım diğer yandan cilde yakın boyun ve kulak tarafından.
    3. Omuz ve boyun başparmak ve işaret parmağı ile arasında gevşek cilt kavramak. Bu fare etrafında dönen kafasını ısırmaya önleyecektir gibi cilt, iyi bir tutun almak önemlidir.
    4. Geri kalan parmak ile ciltte kapmak ve el karşı basarak basılı tutun. Solunum, kan akışı veya zarar verici kemikler, kaslar veya cilt tıkayan olmadan sıkıca tutun. Elin avuç içinde fare arkası desteklerken fare, göbek ortaya çıkarmak için el açmak.
    5. Serbest el ile yavaşça geri zorlamadan penis etrafında deri itin. Prepusyal ayırma geriye doğru glans penis (Şekil 2A, prepusyal ayrılık gösterilen ok) açığa Prepusyal cilt slaytlar. Prepusyal ayrılık olup kaydedin.
    6. Fareyi yavaşça 500-1000 mL ölçek 1.2.2. adımdaki yerleştirerek tartmak ve ağırlığı kaydetmek.
    7. Ölçek 0-2 cm kafes yere basılı tutarak fareyi konut kafeste reintroduce ve yavaş yavaş kendi başına çıkmak için fare izin kabı bahşiş. Su ve hafif deterjan ile kabı temiz ve ölçek için dönen ve ölçek taring önce kurulan.
  6. Vajinal açılış dişi farelerde belirlenmesi.
    1. Bir pamuk topağı, kabı ve steril su bir şişe çalışma alanında (adım 1.2) yerleştirin. Su kabı dökün. Pamuk steril su ile nemlendirmek ve adım 1.2.1 kafes üstten yanındaki yerleştirin.
    2. Fare kafesi çalışma alanında (adım 1.2) yerleştirin ve fare ev onun kafes kafes üst (adım 1.2.1) kuyruk tabanında tutarak aktarmak. Yavaşça fare ileri hareketi teşvik etmek için kuyruk geri çekin.
    3. Kalça ücretsiz parmak ile desteklerken kuyruğunu kaldır. Kafesin üstündeki ile temas korumak hindlimbs izin verir. Fare çok fazla hareket ederse, adımları 1.5.1-1.5.4 içinde açıklandığı gibi elinde tut.
    4. Yavaşça vulva adım 1.6.1 su oksijen pamuk topla temizle. Temiz oksijen pamuk için her fare kullanın. Vajinal açılış belirlemek, incelemek vulva ve vajina tamamen açık olup olmadığını belirlemek için (Şekil 2A, kadın vajinal açılış).
    5. Vajinal açılış oluştuysa kaydı. Fare tartmak ve adımları 1.5.6-1.5.7 içinde açıklandığı gibi ev kafese geri.
  7. İlk estrus ilk yumurtlama bir göstergesidir.
    1. Bir ölçek steril su, etiketli cam slayt ve temiz bir ipucu ile 200 µL pipet ile çalışma alanı (adım 1.2) yerleştirin.
    2. Adım 1.6.2-1.6.3 içinde açıklandığı gibi erkek tutun. ~ 50 µL vajinal açılışında steril su içeren pipet ucu yerleştirin.
    3. Yavaşça hücreleri tanıtan ve 2 - 4 kez ~ 50 µL su reabsorbing vajinal duvardan sifonu çek. Pipet Ucu etiketli cam mikroskop slayda içerikten yayma.
    4. Hücresel morfoloji X 10 ya da 20 X amacı istimal aydınlık alan mikroskop üzerinde dikkatle gözlemlemek veya karalama airdry ~ 1 h için izin ve % 0.1 metilen mavisi çözümle (GKD2içinde O çözünmüş) counterstain (Şekil 2B). Counterstain için % 0,1 metilen mavisi çözüm için içine kurutulmuş slayt daldırma ~ 30 s. 1s için kuru slayt hava girsin.
    5. Adım 10 X veya 20 X parlak alan mikroskop 1.7.4 slaytlardan gözlemlemek. Estrous döngüsü (Şekil 2B)20 sahne estrous döngüsünün (Şekil 2B) dört farklı aşamaları ayırt etmek sağlayan hücre morfolojisi gözlemleyerek kurmak.
      Not: Metestrus cornified skuamöz epitel hücreleri ve lökosit, lökosit tarafından diestrus, proestrus karışımı lökosit ve çekirdekli epitel hücreleri ve cornified epitel hücreleri (Şekil 2B) tarafından estrus karışımı ile karakterizedir 20.
    6. Vücut ağırlığı kaydetmek ve fare için ev onun kafes adımları 1.5.6-1.5.7 içinde açıklandığı gibi dönün. Vajinal smear fareyi onun ilk estrus (2B rakam) olduğunda günde biter.

2. arzu Oda koşulları ıslahı

  1. Üreme Oda sıcaklığı ~ 20-24 olduğundan emin olun ° C, 55 ± % 10 nem ile ve homojen Oda ~ 300-400 bir yoğunluk ışığında lux yaklaşık 1 m21kat yukarıda. Bu ışık şiddeti 25-80 lux arzu orta kafes ışık yoğunluğu sağlar. Işık şiddeti sınamak için ışığı ölçer kullanın.
  2. Otomatik bir sistem aydınlatma deneme boyunca uygun zamanlama sağlamak için üreme oda aydınlatma kontrol etmek için kullanın. Doğurganlık kemirgenler aralıktaki bir 12 h gün (12 h ışık ve 12 h karanlık, LD12:12), ışık ve 10 h karanlık (LD14:10)2114 h ile "yaz benzeri" koşulları için değerlendirmek için en uygun gün uzunluğu koşulları.
  3. Üreme kafesleri hazırlayın.
    1. Temiz fare kafes kapak, su, yiyecek, yatak ve çift damızlık başına iç içe geçirme ile hazırlayın.
    2. Kafes kartları seks, dahil olmak üzere tüm gerekli bilgileri doldurun Doğum tarihinizi, fare zorlanma ve tarihi ne zaman çiftleşme ayarlandı.

3. doğurganlık çalışma

  1. Doğurganlık çalışması için kullanılacak hayvan tanımlayın. Hayvanların cinsel Olgun (adım 1) olduğundan emin olun. Fareler doğurganlık çalışmada ayarlamak için genellikle kullanılan yaş aralığı 10-16 hafta-in yaş, cinsel olgunlaşma en deneysel koşullarda nerede tamamlanmış olan bir yaş olduğunu.
  2. Temiz bir masa üzerinde adım 2.3 hazırlanan yetiştirme kafesi koyabilirsiniz.
  3. Yakalamak ve fareyi tutun.
    1. Yavaş yavaş eldivenli elini fare kafesin içine tanıtmak. Fareler eldiven ve el kokusu uyum sağlayan el içinde belgili tanımlık kafes zaman (~ 5-30 s), kısa bir süre için bırakın. Telaşlı ve sarsıntılı hareketler kaçının.
    2. Kafesin sonuna yakın götürdü el düşük ve yavaş yavaş fareler için yaklaşım. Onlar kaçacak. Onlar el üzerinde çalıştırdığınızda, bir fare kuyruğu başparmak ve işaret parmağı arasında tuzak.
    3. 2-3 s için kuyruk tarafından fareyi kaldırın. Fare daha uzun yapılması gerekiyorsa, kuyruk tutun ve kuyruk beklemeye Bakımı götürdü el fare yer.
  4. Ve bundan sonra 1 kadın 1 erkek üreme kafesin içine (adım 3.3) kuyruğundan tutarak aktarın. Kadın doğurganlık tahlil ayarlarken aynı estrous aşamasında olduğundan emin olun. Kadın estrous sahne adım 1.7 içinde açıklandığı gibi bir vajinal smear gerçekleştirerek belirlemek.
  5. Kafes kapatın ve fareler yiyecek, su ve iç içe geçmiş malzeme olduğundan emin olun. Kafes kart sahibi kafes kafes kartıyla iliştirin.
  6. Üreme kafes konut rafa yerleştirin. Bırakın ıslahı kafes kadar kesintisiz doğurganlık çalışma süresi için. 30 gün için doğurganlık çalışma yapmak. Üreme çifti, ayrıntılı kayıtlarını tutmak ve çiftleşme kurmak 1) tarihi, 2) tarihin çöp doğarlar ve 3) numarası ve tarihi, yavrularını ölü ve canlı yavru da dahil olmak üzere not edin. Günlük çalışma boyunca çöp denetimleri gerçekleştirmek.
  7. Bereket uzatmak çalışma ek bir 30-60 gün yüklenmemişse veya zayıf bir fertilite etkisi için adım 3.6 kurulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İki farklı transgenik fare modelleri nerede transkripsiyon faktörü Ventral ön homeobox 1 (Vax1) burada heterozygote fareler (HET)13veya Vax1 olarak başvurulan bir alleli üzerinde tüm vücuttaki silinmiş üzerinden sunulan sonuçlarıdır burada koşullu KO (cKO) olarak adlandırdığı GnRH nöronlar22içinde koşullu olarak silindi. Doğurganlık çalışma ayarlamadan önce tüm farelerde pubertal başlangıçlı onaylamak önemlidir.

İlk olarak, ağırlık vajinal açılış ve Prepusyal ayırma ve günü kuruldu. HET fareler aynı yaş ve ağırlığı kontrol fareler gibi vajinal açılış ve Prepusyal ayırma oluştu (Şekil 3A ve F, sırasıyla). Buna ek olarak, vajinal açılış Prepusyal ayrılık önemli ölçüde cKO dişi ve erkek gecikmeli ve artan vücut ağırlığı ile ilişkili (Şekil 3B ve G, sırasıyla). Pubertal başlangıçlı vücut ağırlığı ile ilişkili bir dereceye, ve bu kadın23' te özellikle doğrudur. Vajinal açılış ve Prepusyal ayırma gecikme kilo bir gecikme ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için vücut ağırlığı, vajinal açılış ve Prepusyal ayrılma denetimleri (4,5 hafta-in yaş) için yaş ortalaması cKO erkeklerde vücut ağırlığının karşılaştırıldığında yapıldı. kadın ve erkek, 4,5 hafta-in yaş. CKO erkekti (Şekil 3 H) denetimleri biraz daha ağır 4,5 hafta yaşında kadın denetimleri ve cKO karşılaştırılabilir vücut ağırlığı (Şekil 3 c) bulunuyordu. Bu vajinal açılış gecikme ve cKO Prepusyal ayrılmaya kilo bir gecikme ile ilişkili olduğunu gösterir.

Vajinal açılış cinsel olgunlaşma ve ilk estrus ilk yumurtlama oluştu, bir gösterge bir işaretleyici tamamlanma ergenlik17erken bir işaretleyicidir. HET ve cKO kadın ilk estrus aynı yaş ve ağırlığı denetimleri ulaşılıp Eğer belirlemek için vajinal smear günlük den ilk estrus (Şekil 3E ve 3D) kadar vajinal açılış gününde yapıldı. HET farelerde ilk estrus ve ilk estrus kiloda denetimleri ve birisine (şekil 3D) arasında karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, cKO estrous devir-den geçerek ilerleme değil ve ilk estrus 80 gün (Şekil 3E) yaşında yoktu. Bu gecikme, düşük vücut ağırlığı (Şekil 3E) nedeniyle değildi.

HET fareler teyit pubertal başlangıçlı ile doğurganlık çalışma ayarlamak için kullanılmıştır. Doğurganlık tahlil 12 h ışık ve 12 h karanlık koşullar (LD12:12) C57BL/6J genetik arka plan üzerinde transgenik farelerde tuzağa düşürüldüm. Fareler 10-16 hafta deneme başında yaşlı. Farelerin dört grupları okudu: kontrol matings (WTxWT), kontrol HET dişi (WTxHET), HET erkek WT kadın (HETxWT) ile ve HET kadın (HETxHET) ile HET erkek ile erkek. İlk olarak, 3 ay içinde oluşturulan çöp sayısı belirlendi. Kontrol matings (WTxWT) 2.8 çöp ortalama 3 ay içinde karşılaştırılabilir kontrol kadın (HETxWT çiftleşme, Şekil 4A) ile eşleştirilmiş HET erkekler için üretilen. HET kadın, WT erkek (kontrol) veya erkek, HET ile eşleştirilmiş olup olmadığını önemli ölçüde daha az çöp 3 ay doğurganlık çalışmada, HET kadın subfertile13olduğunu açığa oluşturulan. Pubertal başlangıçlı bir doğurganlık tahlil ayarlama önce teyit önemi göstermek için üreme yetkinlik nerede erkekler Prepusyal ayrılık (Şekil 3 g) gecikmiş ve kadın ilk yoktu cKO farelerde değerlendirildi 80-gün yaş (Şekil 3E) tarafından estrus. Doğurganlık çalışma kuruldu > 1 hafta sonra erkek Prepusyal ayırma, vardı ve dişilerde > Yaş 80 gün. 70 günlük doğurganlık çalışma sırasında ortalama 2.2 çöp denetim matings oluşturulan, hiçbir çöp üzerinden oluşturulan, ancak kadın cKO WT erkek ile eşleştirilmiş veya cKO erkek bu fareler gösterilen denetim (WT) olan bir dişi (Şekil 4B), eşleştirilmiş İnfertil5,22vardır.

Daha iyi HET kadın doğurganlık fenotip karakterize etmek için ilk çöp üretmek için sürdüğü gün sayısını kaydetti. WTxWT matings onların ilk çöp ortalama 22 gün (Şekil 4 c), hangi WT kadın ile eşleştirilmiş HET erkek karşılaştırılabilir oluşturulur. WT erkek ile eşleştirilmiş HET dişiler ortalama HETxHET matings (Şekil 4 c) benzer ilk onların çöp üretmek için 58 gün aldı. Ancak, çok hànzú ve daha HETxHET matings telkin fenotip bir yarı alellerle ve bir katkı in HET erkek HETxHET matings13 gözlenen subfertility için gecikmiş HET kadın ilk çöp üretme gecikme .

Çöp boyutu değerlendirilmesi ovulasyon/implantasyon ve sperm üretimi hakkında önemli bilgiler verir. İlk 3 çöp ortalama büyüklüğü tespit edilmiştir. İlginçtir, tüm denetimler (WTxWT, Şekil 4 d) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha küçük çöp kombinasyonları (WTxHET, HETxWT, HETxHET) üretilen çiftleşme, hem erkek hem de dişi HET fare subfertile olduğunu gösterecek.

Figure 1
Şekil 1: hipofiz gonad hipotalamik eksen cinsel olgunlaşma ve üreme denetimleri. Üreme eksen tepe hipotalamik kisspeptin nöronlar (sarı daireler) ve gonadotropin - releasing hormon (GnRH) nöronlar (yeşil daireler) vardır. (Prepubertal) Juvenil dönemde kisspeptin nöronlar küçük kisspeptin GnRH nöronlar üzerine yayın. Pubertal başlangıçlı sonra kisspeptin yayın GnRH nöronlar üzerinde (sonrası pubertal) güçlendirilmiş olduğunu. Geç Juvenil dönemde artan GnRH sürümde önemli ölçüde luteinizan hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) serbest bırakmak--dan önde gelen yetişkinlikte gonad olgunlaşma ve üreme işlevi için hipofiz artırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: pubertal başlangıçlı farelerde belirlenmesi. Farelerde pubertal başlangıçlı harici bir işaretleyici (A) Prepusyal erkek ve dişi içinde açılış vajinal ayrılmasıdır. Ölçek çubuğu 1 cm. (B) örnek görüntüleri vajinal lavaj ilk estrus belirlemek için kullanılan =. Slaytlar için 30 counterstained s ile % 0,1 metilen mavisi, airdried ve 20 X büyütme oranında görülmektedir. Siyah oklar çekirdekli epitel hücreleri gösterir, lökosit siyah anahat sarı oklarla göstermek ve beyaz okları cornified epitel hücreleri gösterir. Gün 10'den sonra vajinal açılış ilk estrus oluştu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir pubertal başlangıçlı kursundan oluşturan temsilcisi veri. (a, B) Vajinal açılış ve transgenik fare modellerinde vajinal açılışında ağırlık. (C) ağırlık kontrolü ve cKO dişilerde 4,5 haftalık. (D, E) Yaş ve ağırlığı ilk estrus. (F, G) Yaş ve ağırlığı Prepusyal ayırma. (H) ağırlık kontrolü ve cKO erkeklerde 4.5 haftalık. Verileri göstermek anlamına gelir ± SEM N = 5-10 gruba, istatistiksel analiz öğrencinin-t test başına. p< 0,01; p< 0,001. Bu rakamlar önceki yayın13,22değiştirdiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: bir doğurganlık çalışması transgenik fareler temsilcisi analiz. Doğurganlık değerlendirme (A) Vax1 HET fareler ve (B) cKO bakire 10 - için 16-hafta-yaşlı farelerde gerçekleştirilmiş ve çöp sayısı belirtilen zaman dilimlerini kaydedildi. Verileri göstermek anlamına gelir ± SEM istatistiksel analiz tek yönlü ANOVA Dunnett'ın çoklu karşılaştırma testi ile takip tarafından gerçekleştirildi. * p< 0,05; p< 0,001. (C) ilk çöp için gün sayısı (n = 5-12) ve (D) ortalama çöp boyutu ilk üç çöp (n = 10-13) tespit edilmiştir. Verileri göstermek SEM istatistiksel analiz öğrencinin-t testi ile karşılaştırıldığında WT tarafından yapıldığı anlamına gelir ± WT x *p< 0,05; p< 0,01. Bu rakamlar önceki yayın13,22değiştirdiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: doğurganlık tahlil ayarlama. (A) düzeni ve önerilen numarası doğurganlık tayini için gerekli hayvanların üreme örnek. Hayvanlar gibi bir denetim KO veya denetim diyet nerede doğurganlık değerlendirildi ve erkeklerde içinde yüksek yağlı diyet karşı karşı 2 koşulları ile bir çalışma için gerekli toplam sayısı: çiftleşme (1 erkek 1 kadın x) x grup x 2 koşulları x 2 cinsiyet başına 8 hayvan başına 2 fareler s (hem erkek hem de kadın doğurganlık değerlendirmek için) = toplam çalışma başına 64 hayvanların. Erkek ve kadın doğurganlık çalışma paralel olarak yapılırsa, bir denetim denetim matings x kümesi genellikle erkek ve dişi üreme üzerindeki etkisi her iki karşılaştırmak için hizmet edebilir. (B) bir doğurganlık tahlil ayarladığınızda, cinsel olgunluğa ulaşmış kullanılan fare gerekir. Farelerin farklı suşları farklı üreme özellikleri vardır ve farklı yaş24cinsel olgunluğa ulaşır. Fareler üzerinde daha fazla bilgi için bkz: önceki yayın25. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farelerin genel refah bir başarılı doğurganlık tahlil21için önemlidir. Doğurganlık tahlil yaparken bu stres neden olabilir gibi fiziksel olarak fareler üzerinde her gün kontrol etmek önemlidir. Bu aynı zamanda stresli olarak daha sık kafes değişiklikleri, kaçının. İdeal olarak kafes değişiklikleri haftada en fazla 1 - 2 kez yapılır. Karanlık aşamasında ışığa maruz üreme gece Rodents olumsuz etkiler. Üreme odasında ışıkları karanlık saatlerinde kapatmayın. Odanın girişine karanlık saatlerinde gerekliyse, loş kırmızı ışık aydınlatma kullanın. Başka bir tetikleyici aşırı kokuları, titreşimler veya gürültü ve çalışma için vivaryum varlığıdır. Stres hafifletmek ve fare sağlığı ve üreme artırmak için zenginleştirme malzeme veya başka tür iç içe geçirme fareler ver. Yuva bina farelerde önemli bir davranış ve üreme başarısı artacaktır. Yuvaların da fareler gizlemek ve oynamak bir yer sağlar. Bu nedenle sağlıklı ve iyi beslenen hayvan doğurmak iyi, kaliteli yiyecek ve su ad libitum erişim sağlamak önemlidir. Üreme çiftleri Dermatit (C57BL/6J içinde sık), diş maloklüzyon veya başka hastalığın belirtilerini sergilemek başlatırsanız bu fareler çalışma hariç. Çalışma immünyetmezligi farelerde yapılıyor, buna ek olarak, bu fare oda doğurganlık korumak için temiz tutulur anahtarıdır.

Uygun şekilde ayarlanmış bir doğurganlık çalışması için çalışma bakire farelerde gerçekleştirilecek ya da kanıtlanmış yetiştiricileri de olabildiğince dikkatli kontrol matings için kullanılan fare seçin karar vermek önemlidir. Denetim matings deneysel breeders ile paralel olarak çalıştırılması gerekir. Bu bilinmeyen ve beklenmedik stresler zorunludur ve oranı ıslahı değişiklikleri ortamındaki değişikliklere neden olabilir. Denetim matings tercihen çöp arkadaşları deneysel farelere (Şekil 5A) oluşur. Doğurganlık çalışma içinde doğurmak özellikleri fare suşları (Şekil 5B) arasında büyük farklılıklar nedeniyle Karma Genetik geçmişi olan farelerde bitince bu özellikle önemlidir.

Subfertility fenotip tanımlayan çalışma ve ek parametreler analiz etmek gerek uzun süreli uzunluğu nedeniyle nedenini ortaya çıkarmak için zor olabilir. HET fare temsilcisi veri bir mütevazı subfertility fenotip (Şekil 4) iyi bir örnektir ve erkek subfertility tanımlamak için genişletilmiş analiz gerekir. Temsilcisi sonuçları (Şekil 3 ve 4) görüldüğü gibi normal ergenlik (Şekil 3A, Dve F) başlangıcı her ikisi erkek ve dişi subfertility ile (Şekil 4A, C, D ilişkili olabilir ). Bu durumda, fareler sadece alt verimli ve böylece çalışma uzunluğu 120 gün uzatıldı. Bu daha kısa bir doğurganlık çalışması olarak önemlidir (Örn., 60 gün) fenotip ortaya çıkarmak mümkün olmazdı. Erkek subfertility mütevazı ve ilk ne zaman ortaya HET erkek da subfertile (Şekil 4A) idi HET kadın ile eşleştirilmiş. Nitekim, HET erkek subfertility çocuğu çöp (Şekil 4 d) ortalama büyüklüğü değerlendirirken doğrulandı. Çalışmalar takip erkek subfertility doğruladı ve HET erkeklerde düşük sperm kalitesi hareketli sperm13~ %80 azalma ile ortaya koymuştur.

Ne zaman bir doğurganlık ve pubertal başlangıçlı gerçekleştirme çalışma fareler pubertal başlangıçlı büyük bir gecikme ile (> 5 gün), hangi pubertal başlangıçlı26düzenleyen farklı faktörler dikkate almak önemlidir. Vajinal açılış ve ilk estrus fareler içinde en sık kullanılazlar olmasına rağmen farelerde ilk estrus ~ 10 gün sonra vajinal açılış25,27genellikle oluşur. Bu nedenle, vajinal açılış ve ilk estrus sıçanlar ve fareler18,28içinde çalışırken kurulan sağlamak için önerilir. Pubertal başlangıçlı metabolik durum ve vücut ağırlığı içinde dişi ve erkek1,7,9,29küçük bir ölçüde bağlı olduğu ve bu nedenle, bir tedavi veya genetik mutasyon hayvan büyümenin yavaşlaması olacak Gecikmeli pubertal başlangıçlı bazı durumlarda sonuç. Pubertal başlangıçlı gecikme/gelişme hızlı/yavaş büyüme ile ilişkili olabilir olup olmadığını belirlemek için günlük pubertal başlangıçlı değerlendirme sırasında fareler tartmak önemlidir. Şekil 3B ve C, yanı sıra G ve Hda görüldüğü gibi pubertal başlangıçlı gecikme düşük vücut ağırlığı ile ilişkili değildi ama pubertal başlangıçlı, gonad Histoloji ve hormon dolaşan tarafından onaylanmış olarak gerçek bir gecikme oldu düzeyleri22. Pubertal başlangıçlı işaretleri olarak her iki kez sonunda mekanizmaları nedeniyle zamanla dışında olacağını Prepusyal ayrılık ve vajinal açılış kullanarak büyük sınırlamalar biri etkinlik üreme ekseni18, artmış 30 , 31 (Şekil 1). Bunun bir örneği cKO dişilerde (Şekil 3B) gecikmiş vajinal açıyor. CKO kadın asla yumurtlama22 (Şekil 3E) devamsızlık nedeniyle verimli hale gelir. Gerçekten de, daha fazla hormon düzeyleri ve gonad Histoloji cKO farelerin değerlendirme çalışmalar bu fareler asla ergenlik tamamlandı ve infertil22 (4B rakam) olduğunu gösterdi. Bu pubertal başlangıçlı belirlemek için dış işaretçileri kullanarak limitini gösterir. Ergenlik ve cinsel olgunluğa ulaşma artan GnRH yayın ve üreme eksen (Şekil 1) aktivasyonu gerektirir ve tam olarak cinsel olgunluğa onaylamanız gonad Morfoloji ve hormon düzeyleri dolaşan değerlendirilecek gerekir 22 , 31. erkeklerde, testosteron ölçme ve seminal vezikül ve testis Morfoloji ve boyut ek olarak sperm kalitesinin değerlendirilmesi ergenlik elde16,22,32olduğunu doğrular. Kadın, progesteron ve östrojen düzeyleri, rahim ve yumurtalık ağırlık ve morfoloji birlikte ölçme ergenlik17,19,22,33tamamlanması onaylayacaktır.

Çöp boyutu gebelik uzunluğu ve pubertal başlangıçlı yaşta etkileyebilir. Çoğu fare suşları bir gebelik dönemi 18-22 gün var. Annesi büyük bir çöp bekliyor Eğer, ancak, gebelik dönemi azaltılmış34,35olma eğilimindedir. Annesi bir önceki çöp hemşirelik, öte yandan, bu uzantı gebelik dönemi5neden olabilir. Pups içinde büyük çöp de pubertal başlangıçlı gecikme eğilimindedir. Bunun nedeni onların büyüme tarafından biraz gecikmeli1,9,34,35. Bir doğurganlık çalışma gerçekleştirilirse ve fare gruplarından birini (denetim veya deneysel) çok büyük çöp, üreten bu karşılaştırılabilir boyutları okudu çöp izin itlaf, ayrıca olarak adlandırdığı çöp boyutları, homojenize için tavsiye edilir.

Üreme sadece biçilen vivo içinde birden fazla organ üreme (Şekil 1) dahil ve üreme eksen3düzenleyen kapsamlı geri bildirim mekanizmaları nedeniyle olabilir. Üreme yetkinlik bazı yönlerini hızla nerede erkek dişi dağ ve fiziksel bir fiş vajina içinde bırakmak kapasitesi13,36görülmektedir bir vajinal takmayı tahlil ile değerlendirilebilir. Her ne kadar bu erkek cinsel davranış değerlendirmek için yararlı bir yaklaşımdır, çalışma bu tür küçük sorunların tespiti üreme izin vermiyor, ne de bu değerlendirmeye mu doğurganlık zaman ya da elde edilen çöp boyutu ve ebeveyn davranışı uzun bir süre için muhafaza. Burada açıklanan protokol bağlanan bir tahlil, Binbaşı sayısız avantajlar sunar ve erkeklerde (Şekil 4) üreme yeterlilik üzerindeki küçük ve büyük etkileri tanımlamak için kapasite olmak.

Yaş ile doğurganlık azalır ve ayrıca kadın estrous döngüsü sırasında yaşlanma5,28daha uzun ve düzensiz hale gelir. Bu nedenle genç bir doğurganlık çalışma başlatmak ve cinsel olgun hayvanlar için önerilir. Bir doğurganlık çalışma ayarlamak için genellikle kullanılan yaş aralığı 10-16 hafta-in yaş var. Ancak, farklı fare ya da sıçan suşları (5B rakam) arasında üreme ve cinsel olgunluğa temel farklılıkları var çalışmada kullanılan fare zorlanma belirli üreme özellikleri konusunda bilgi sahibi olmanız önemlidir. JAX fare Phenome veritabanı https://phenome.jax.org/ üreme özellikleri hakkında ek bilgi bulunabilir. Daha uzun bir performans (> 4 ay) doğurganlık eğitim var nerede fareler doğurmak normalde ilk 1-2 ay için doğurganlık testin, ama sonra daha önce başlayan üreme erken bir düşüş var erken üreme düşüş tespit etmek mümkün olmanın avantajı 6 ay-in yaş.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgments

Bu yayın temeli olan ilk iş için Katılımcı Yazarlar teşekkür ederiz. Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan ve Erica L. Schoeller el yazması hazırlama yardım için teşekkürler. Jessica Sora Lee ve Austin Chin el yazması ile teknik destek için teşekkürler. H.M.H. Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme Ödülü numarası R00HD084759 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
  3. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
  4. Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
  5. Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
  6. Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
  7. Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
  8. Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
  9. Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  10. Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
  11. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
  12. Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
  13. Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
  14. Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
  15. Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
  16. Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
  17. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
  18. Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
  19. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
  20. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
  21. Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
  22. Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
  23. Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
  24. Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
  25. Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
  26. Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
  27. Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
  28. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
  29. Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
  30. Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
  31. Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
  32. Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
  33. Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
  34. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
  35. Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
  36. Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).

Tags

Biyoloji sayı: 140 Pubertal başlangıçlı doğurganlık tahlil üreme yetkinlik prepusyal ayırma vajinal açılış ilk estrus fare kemirgen sıçan Erkek kadın vücut ağırlığı
Pubertal başlangıçlı teyit ve doğurganlık tahlil fare ve sıçanlar üreme yetkinlik belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffmann, H. M. Determination of… More

Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter