Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.
Abstract
L'analisi della cellula-cellula o cellula-patogeno interazione in vivo è uno strumento importante per capire la dinamica della risposta immunitaria all'infezione. Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) permette l'osservazione delle interazioni cellula nei tessuti profondi in animali viventi, riducendo al minimo il photobleaching generati durante l'acquisizione di immagini. Ad oggi, sono stati descritti diversi modelli per 2P-IVM degli organi linfoidi e non linfoidi. Tuttavia, la formazione immagine degli organi respiratori rimane una sfida a causa del movimento associata al ciclo di respirazione dell'animale.
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare in vivo delle cellule immuni interazioni nella trachea di topi infettati con il virus dell'influenza utilizzando 2P-IVM. A questo scopo, abbiamo sviluppato una piattaforma di formazione immagine personalizzata, che comprendeva l'esposizione chirurgica e intubazione della trachea, seguita dall'acquisizione di immagini dinamiche dei neutrofili e cellule dendritiche (DC) nell'epitelio mucoso. Inoltre, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per eseguire l'influenza intranasale infezione e flusso cytometric analisi delle cellule immuni nella trachea. Infine, abbiamo analizzato il neutrofilo e motilità DC così come le loro interazioni nel corso di un film. Questo protocollo permette per la generazione di immagini 4D stabile e luminose necessario per la valutazione delle interazioni cellula-cellula nella trachea.
Introduction
Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) è una tecnica efficace per l'imaging di tempo reale delle interazioni cellula-cellula che si verificano nel loro ambiente naturale1. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette lo studio di processi cellulari, a una maggiore profondità di campione (500 µm a 1 mm), rispetto ad altri di tecniche di imaging tradizionale2. Allo stesso tempo, l'uso di due fotoni di bassa energia generata dal laser del due-fotone minimizza il foto-danno di tessuto tipicamente associato con il processo di acquisizione immagine2. Durante l'ultimo decennio, 2P-IVM è stato applicato per lo studio di diversi tipi di interazioni cellula-cellula in diverse discipline3,4,5. Questi studi sono stati particolarmente rilevanti per indagare le cellule immuni, che sono caratterizzate dalla loro alta dinamicità e la formazione di importanti contatti seguendo i segnali generati da altre cellule e l'ambiente. 2P-IVM è stata applicata anche per studiare le interazioni tra patogeno e serie6. Infatti, precedentemente è stato indicato che alcuni agenti patogeni possono alterare il tipo e la durata dei contatti tra le cellule immunitarie, ostacolando, di conseguenza, la risposta immunitaria7.
La mucosa delle vie aeree è il primo sito in cui la risposta immunitaria contro agenti patogeni nell'aria è generato8. Pertanto, in vivo l'analisi delle interazioni agente patogeno-ospite in questo tessuto è fondamentale per comprendere l'iniziazione dei meccanismi di difesa ospite durante l'infezione. Tuttavia, 2P-IVM delle vie aeree è impegnativo pricipalmente dovuto i manufatti prodotti dal ciclo di respirazione dell'animale, che compromette il processo di acquisizione di immagini. Recentemente, sono stati descritti diversi modelli chirurgici per imaging trachea murino9,10,11,12 e polmoni13,14,15, 16. Tracheale 2P-IVM modelli rappresentano un ottimo set-up per visualizzare la fase iniziale della reazione immune nelle vie aeree superiori, mentre sono più adatti a studiare la fase tarda di infezioni del polmone-alveoli 2P-IVM modelli. I modelli sviluppati del polmone presentano una limitazione associata alla presenza degli alveoli riempiti d'aria, che limitano la penetrazione ottica del laser e rendere lo strato della mucosa delle vie aeree intrapolmonari inaccessibile per in vivo imaging17 . Al contrario, la struttura della trachea, formata da un epitelio continuo, facilita l'acquisizione di immagini.
Qui, presentiamo un protocollo che include una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per eseguire l'infezione di riossidazione, preparazione chirurgica degli animali e 2P-IVM della trachea. In più, descriviamo un specifico set-up sperimentale per la visualizzazione dei neutrofili e cellule dendritiche (DC), due tipi di cellule immunitarie che svolgono un ruolo importante come mediatori del meccanismo di difesa contro l'influenza virus18,19 . Infine, descriviamo una procedura per analizzare le interazioni del neutrofilo-DC. Questi contatti sono stati indicati per modulare l'attivazione delle DC e, successivamente, di influenzare le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni20.
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Protocol
Tutte le procedure di animale che coinvolgono topi sono stati eseguiti secondo l'Ufficio federale di veterinaria indirizzi e protocolli animale sono state approvate dalle autorità veterinario locale.
1. influenza infezione dei topi CD11c-YFP
- Biosicurezza
Nota: Il ceppo del mouse adattato di influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) è stato coltivato in uova fecondate, purificato e titolato come descritto in precedenza21. Tutti i passaggi che coinvolgono gli animali infetti o campioni biologici sono stati effettuati sotto una cappa di biosicurezza in base al livello di biosicurezza (BSL) 2 condizioni.- Pulire il gabinetto di sicurezza biologica con una soluzione di etanolo 70% prima e dopo la procedura di infezione.
- Smaltire tutti i rifiuti prodotti durante questa procedura in seguito corretto che le linee guida di biosicurezza (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Scartare autoclavabile bidoni dei rifiuti solidi e liquidi contaminati in sacchetti di plastica riempiti con soluzione di etanolo al 70% o disinfettante.
- Infezione di influenza intranasale
NOTA: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 su uno sfondo di C57BL/6J sono stati utilizzati in questo studio. I topi sono stati mantenuti nella struttura da organismi patogeni specifica presso l'Istituto per la ricerca in biomedicina.- Inserire un massimo di 5 topi CD11c-YFP età e sesso-abbinato (sei a otto-settimana-vecchio) per gabbia. Attendere almeno due giorni per acclimatazione di topi a condizioni abitative prima della procedura di infezione.
- PR8 stock di sbrinamento e preparare la diluizione corrispondente utilizzando freddo 1x soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco modificato senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio (PBS) per ottenere una concentrazione finale di 200 unità di formazione di placca (PFU) in diluizioni di virus di 30 µ l. Keep sul ghiaccio durante l'intera procedura.
Nota: per garantire una dose precisa di infezione si raccomanda una titolazione di ogni lotto di virus dell'influenza prima del suo utilizzo. - Iniettare una dose di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per via intraperitoneale (i.p.) utilizzando una siringa da 1 mL ago 26 G.
- Attendere fino a quando il mouse è completamente anestetizzato (perdita completa del riflesso di ritiro sia raddrizzante e pedale). L'anestesia profonda è necessaria per un'infezione ottima, poiché non completamente anestetizzati topi saranno inghiottire o espellere l'inoculo di virus, portando a variazioni della dose di infezione.
- Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina. Raccogliere 15 µ l di inoculo di virus. Inserire la punta della pipetta vicino la narice di sinistra del mouse ed erogare l'inoculo virale goccia a goccia. Come gocce devono essere inalati, non dispensare direttamente all'interno della cavità del naso.
- Attendere 2 – 5 min e posizionare la punta della pipetta contenente i restanti 15 µ l di inoculo di virus nella narice destra.
Nota: Per evitare il soffocamento, dispensare gocce di piccole dimensioni in circa 20 intervalli di s. - Controllare che il mouse è respirare correttamente e inserirlo in una gabbia nella laterale decubitus. Controllare il mouse anestesia e respirazione recupero (circa 60 min dopo induzione).
Nota: È possibile infettare più di 1 mouse allo stesso tempo. In questo caso, amministrare inoculo virale nella narice di sinistra di tutti i topi in una sequenza, attendere per 2 – 5 min e quindi amministrare il virus nella narice destra. Per evitare la variabilità tra individui, infettare non più di 3 topi allo stesso tempo. - Monitorare quotidianamente la perdita di peso e lo stato di salute degli animali.
- Eutanasia topi secondo l'endpoint humane determinata dalle linee guida autorità. Il metodo di eutanasia deve essere approvato dalle autorità di sperimentazione animale e deve rispettare norme etiche locali. Dopo gli esperimenti del due-fotone, eutanasia topi dalla somministrazione di una dose eccessiva di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale. In tutti gli altri esperimenti, utilizzare inalazione di CO2 come un metodo per l'eutanasia.
Nota: Per misurare i titoli virali della trachea infetto, dosaggio dose infettiva (TCID50) di 50% coltura di tessuto o tempo reale reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) dosaggio può essere effettuato come descritto in precedenza23.
- Valutazione del reclutamento dei neutrofili nella trachea tramite flusso cytometry
Nota: Questa parte del protocollo è facoltativa. Essa mira a valutare il reclutamento dei neutrofili nella mucosa trachea dopo l'infezione di riossidazione.- Eutanasia topi infetti e non infetti di controllo alle post-infezione giorno 3 (p.i.) per inalazione di CO2 .
Nota: Al fine di evitare danni tracheali, evitare di utilizzare dislocazione cervicale per eutanasia animali. Inoltre, l'aspersione dei topi eutanasizzati è consigliabile per evitare la contaminazione da neutrofili di anima. - Spruzzare il collo del mouse con soluzione di etanolo al 70% ed eseguire un'incisione della pelle utilizzando forbici chirurgiche dal petto al mento.
- Separare le ghiandole salivari usando il forcipe ed esporre la trachea.
- Sezionare i muscoli intorno alla trachea utilizzando pinze e le forbici.
Nota: Questo passaggio deve essere fatta con attenzione quanto trachea potrebbe essere facilmente danneggiato nel corso del procedimento. - Tenere la trachea con il forcipe e staccare con cautela l'esofago tramite la dissezione.
- Tenendo la parte intratoracica della trachea con il forcipe, fare un'incisione all'inizio dell'albero bronchiale. Quindi scollegare la trachea dalla laringe e rimuovere con cura qualsiasi muscolatura a sinistra.
- Posto l'organo in una provetta da 1,5 mL contenente RPMI 1640 + medium HEPES (RPMI) sul ghiaccio.
- Preparare la miscela di enzimi per la digestione di trachea, contenente 0,26 unità/mL di collagenasi (I e II) e 0,2 mg/mL di dnasi I in RPMI.
- Posto la trachea sezionata in una piastra a 6 pozzetti contenente 1 mL di miscela di enzimi.
- Tagliare l'organo in piccoli pezzi con l'aiuto di pinze e forbici. Tenere la piastra sul ghiaccio durante questo passaggio.
- Incubare a 37 ° C per 45 min. Durante questo tempo, agitare la piastra ogni 15 min.
- Fermare la digestione enzimatica aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio di FACS (2 mM EDTA e 2% inattivati filtro-sterilizzato siero bovino fetale (FBS)) in PBS.
- Risospendere la soluzione con una pipetta da 1 mL per aiutare a separare i pezzi parzialmente digeriti del tessuto.
- Trasferire la soluzione in un altro pozzo passando il contenuto attraverso un colino µm 40. Poi, delicatamente rompere i pezzi rimanenti dell'organo intrappolato sulla parte superiore del filtro utilizzando un pistone della siringa 2 mL.
Nota: Smashing parzialmente digeriti pezzi della trachea sopra il filtro è un passaggio fondamentale per ottenere un numero ottimale di cellule durante l'analisi cytometric di flusso. - Lavare il pozzo e il filtro con lavaggio FACS buffer e trasferire la sospensione in una provetta da 5 mL tenuta su ghiaccio.
- Centrifugare le provette a 166 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l di tampone di lavaggio di FACS.
- Procedere con la marcatura di superficie dell'anticorpo per citometria a flusso. Brevemente, bloccare i recettori Fc delle cellule isolate usando un anticorpo contro CD16/32, seguita dalla macchiatura superficiale. Per identificare correttamente i neutrofili, il pannello di citometria a flusso deve contenere i seguenti anticorpi: αLy6G, αCD11b, αCD45, come pure una vitalità tingere a escludere le cellule morte.
- Eseguire l'intero contenuto dei campioni su un citometro a flusso e analizzare i dati.
- Per ottenere un numero ottimale di cellule del sistema immunitario, è necessario eseguire la sospensione singola cella ad una velocità non superiore a 3.000 eventi/s. Ciò consentirà di ridurre il numero di eventi esclusi durante l'acquisizione. Usando questo protocollo, dovrebbe essere possibile ottenere 1 a 2 milioni di cellule per la trachea.
- Eutanasia topi infetti e non infetti di controllo alle post-infezione giorno 3 (p.i.) per inalazione di CO2 .
2. isolamento e iniezione dei neutrofili
Nota: In questa procedura, B6.129 (ICR)-topi Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J (CK6-ECFP) sono stati usati24. Questi animali rapidi PCP in tutti i tipi di cellule sotto il promotore umano β-actina. In alternativa, è anche possibile utilizzare topi C57BL/6J per isolare le cellule e li macchia secondo il protocollo descritto al punto 2.6. La purificazione e la manipolazione dei neutrofili possono aumentare il loro stato di attivazione, potenzialmente alterando le loro proprietà funzionali e migratori.
- Eutanasia animale per inalazione di CO2 .
- Rimuovere entrambi i femori e tibie e pulirle delicatamente usando il forcipe.
- Tagliare delle epifisi dell'osso e midollo osseo utilizzando una siringa da 1 mL riempita con PBS freddo sterile, in una provetta da 50 mL tenuta su ghiaccio a filo.
- Risospendere le cellule con un ago da 18 G e filtrare la sospensione cellulare con un colino di 40 μm. Lavare una volta con PBS a 110 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere le cellule in 2 mL di PBS freddo.
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Diluire 100% Percoll 9:1 a 10 di PBS 1X e preparare soluzioni gradienti di percoll 72%, 64% e 52% utilizzando 1X PBS. Layer attentamente 2 mL di ciascuno dei tre gradienti in una provetta da 15 mL, uno a partire dal più concentrato.
- Aggiungere con cautela 2 mL della sospensione delle cellule del midollo osseo in cima alle pendenze e centrifuga a 1.100 x g per 30 min a temperatura ambiente (TA) senza accelerazione e freno.
- Estrarre la band all'interfaccia tra 64% e 72% con cautela e lavarlo una volta a 200 x g per 5 min a 4 ° C con PBS freddo. Risospendere le cellule in un volume di 100 μL di PBS e tenerli sul ghiaccio. La purezza dei neutrofili dovrebbe essere superiore al 90%.
- Facoltativamente, neutrofili di etichetta con un kit di proliferazione cellulare utilizzando il protocollo del produttore. Aggiungere il colorante alla sospensione di cellule ad una concentrazione finale di 10 μM in un volume di 1 mL, incubare a 37 ° C per 30 min e lavare (166 x g, 5 min).
- Stimare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro e iniettare per via endovenosa 5 x 106 cellule in un volume massimo di 100 μL nei topi CD11c-YFP+ precedentemente infetti usando una siringa da 1 mL di ago 26 G, 12h prima di formazione immagine.
3. preparazione del Mouse per Imaging
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Anestesia
- Anestetizzare topi infetti CD11c-YFP+ al 3 ° giorno p.i. secondo punto 1.2.3.
- Una volta sono anestetizzati per topi, preparare un catetere per anestesia ri-dosaggio.
- Rimuovere un ago 30 G da una siringa usando il forcipe.
- Inserire l'ago per un pezzo di 20 cm di tubo in silicone medico PE-10.
- Inserire una siringa con ago 30g riempita con miscela di chetamina/xilazina su altro lato del tubo.
- Eliminare l'aria all'interno del tubo.
- Preparare un catetere 20g collegato ad un tubo da una macchina insufflating ossigeno per mantenere la ventilazione automatica (Figura 1Aio). Impostarlo su un rapporto di respiro di 130 battiti al minuto (b.p.m.) con un volume corrente di 0,2 mL utilizzando una fornitura di gas ossigeno 100%.
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Preparare il mouse per chirurgia
- Tenere il mouse su una scheda chirurgica su misura specifica (Figura 1Aii-iii) sopra una piastra riscaldata o una panca riscaldata chirurgica impostato a 37 ° C per tutto il tempo dell'intervento chirurgico.
- Radersi i capelli dal collo del mouse utilizzando un rasoio elettrico e una crema depilatoria (Figura 1Bio).
- Posizionare il mouse sopra il mouse plastica posizionale (Figura 1Aii-a), mantenendo la testa dell'animale fuori il posizionale (Figura 1Bii) per creare un angolo che facilita l'intubazione della trachea.
- Difficoltà gli arti anteriori, le zampe e la coda con nastro chirurgico, inumidire gli occhi del mouse con un gel arricchito di vitamina A e disinfettare il collo del mouse (Figura 1Bii).
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Chirurgia
- Preparare gli elementi correttamente sterilizzati nell'autoclave, vale a dire, forbici, forbici microsurgical e forcipe.
- Eseguire una piccola incisione sull'asse lungo mediale del collo, circa 1 cm di lunghezza, nella zona centrale tra la parte superiore del torace e la linea passante per il punto inferiore della mandibola (Figura 1Biii).
- Spostare lateralmente il patch di pelle e le ghiandole salivari e visualizzare la trachea, coperta dai muscoli. Quindi, sezionare i muscoli tracheali con attenzione usando il forcipe (Figura 1Biii).
- Intubare il mouse con un catetere e iniziare la ventilazione artificiale (Figura 1Biv).
Nota: Il catetere è composto da una parte esterna di plastica, che protegge la mucosa trachea e un ago di ferro interno. La presenza dell'ago rappresenta la soluzione ideale per estendere e stabilizzare la trachea e per regolare l'esposizione. Ventilazione artificiale attraverso il catetere garantirà una corretta respirazione del mouse. - Avviare immediatamente la ventilazione artificiale al monitor mouse respirazione.
- Fissare il catetere altezza e orientamento utilizzando un gancio chirurgico (Figura 1Bv) collegato all'asta specifica sulla scheda chirurgica (Figura 1Aii-b). Esporre la trachea alla stessa altezza del mento.
- Circondare la trachea con vaselina e coprirlo con poche gocce di PBS preriscaldata per garantire una corretta idratazione all'organo (Figura 1Bvi).
- Montare il vetrino coprioggetto sopra la preparazione. Per questo passaggio, colla un vetrino coprioggetto su un supporto metallico (Figura 1Bvii), che sarà avvitato al traduttore XYZ (Figura 1Aii-c). Regolare il traduttore XYZ per posizionare il vetrino coprioggetto sopra la preparazione chirurgica.
- Posizionare il catetere per la somministrazione dell'anestesia per via intraperitoneale (Figura 1Bviii).
- Iniettare il 50% della dose iniziale di chetamina/xilazina miscela ogni 30 min.
Nota: Ri-dosaggio da 50% a 25% della miscela iniziale chetamina/xilazina è una sicura e valida alternativa25. Tuttavia, poiché questo protocollo è terminale e una rigorosa immobilizzazione dell'animale è richiesta durante l'intera procedura, è possibile utilizzare dosaggi più elevati per mantenere un piano profondo chirurgico di anestesia.
4. in Vivo Imaging time-lapse
Nota: Acquisizione di immagini è stato effettuato con un microscopio a due fotoni in posizione verticale, dotato di due Ti:Sa laser, camera di incubazione a temperatura controllata e una 25 X / 1.1 NA acqua obiettivo a immersione. I fotomoltiplicatori (PMT) utilizzati per l'acquisizione immagine erano rivelatori di ibrido o alta sensibilità GaAsP.
- Posizionare la scheda chirurgica con il mouse anestetizzato all'interno della camera di incubazione del microscopio (pre-riscaldata a 37 – 38 ° C) e aggiungere una goccia d'acqua sul vetrino coprioggetti.
- Centro e trova lo stato attivo sul tessuto trachea.
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Impostare la frequenza di scansione a 800 Hz, con un campo visivo di 440 x 440 μm2 520 x 520 pixel e la linea media 1.
- Tune Ti:Sa laser a 830 nm per eccitare la generazione di seconda armonica (SHG) da collagene, con una potenza indicativa alla fonte di 150 mW. Sintonizzare il secondo laser Ti:Sa 920 nm con 94 mW alla fonte, per eccitare la PCP sia YFP.
- Set-up il 3D e modalità di acquisizione di timelapse con eccitazione simultanea
Nota: Tenere le potenze laser più basso possibile per ridurre al minimo photobleaching e fototossicità.
- Record fluorescenza utilizzando due canali in modalità non-descanned, con un master specchio dicroico a 560 nm. D'impostazione utilizzata nel presente protocollo, un secondo specchio dicroico divise il segnale a 495 nm per separare canale 1 (filtro di emissione 475/50) dal canale 2 (filtro di emissione 525/50) (Figura 2A). Questa configurazione raccoglie SHG luce da collagene nel primo canale, mentre emissioni di PCP sono raccolti in entrambi i canali 1 e 2 e YFP raccolti solo nel canale 2.
- Definire un intervallo 50 μm lungo l'asse Z, con un passo di 3 μm (voxel dimensione 0.86 μm x 3 μm). Record di immagini ogni 30 s per una durata complessiva di 30 min.
- Se lo si desidera, è possibile acquisire più regioni. Prima di eseguire ulteriori acquisizioni, controllare i segni vitali ed effettua l'anestesia attraverso il catetere se necessario (vedere passaggio 3.3.10).
- Alla fine del processo di imaging, eutanasia il mouse attraverso la dose eccessiva di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale.
5. immagine elaborazione analisi quantitativa neutrofilo-DC motilità e interazione
Nota: In questo protocollo, un software di imaging specializzato è stato utilizzato per analizzare i dati di microscopia.
- Al termine dell'acquisizione immagine 4D, trasferire i file (dati e metadati) su una workstation con sufficienti risorse computazionali (requisiti minimi di sistema consigliati: 32 GB di RAM, CPU veloce solido unità SSD, recente, dedicato basato su GPU un massicciamente architettura parallela).
- Aprire i file nel software di imaging.
- Riprodurre il video e assicurarsi che le celle di interesse sono chiaramente visibili e che imaging artefatti sono assenti.
Nota: a tal fine, verificare che sia il movimento del campione e la variazione di luminosità sono sufficientemente limitato. Infatti, queste rappresentano delle sfide per l' analisi automatica26. Se il movimento del campione tra fotogrammi adiacenti è eccessivo, è possibile applicare un metodo di correzione di deriva, utilizzando ad esempio il canale SHG come riferimento fisso. Questo permette di misura migliore il movimento delle cellule, piuttosto che il movimento del campione. Inoltre, in presenza di fondo luminoso o detriti, potare le superfici ricostruite utilizzando il volume come un parametro di selezione. - Generare un canale di co-localizzazione specifici per le cellule di PCP+ , al fine di separare il segnale tra PCP e il collagene (SHG). A tal fine, denotano un poligono gating (Figura 2Bho) che seleziona solo i voxel avendo un'intensità positivi sia nel verde del canale e nel canale blu.
Nota: Questa procedura può variare secondo il set di filtri del microscopio e la colorazione delle cellule. Può essere raggiunto selezionando solo voxel con intensità sufficiente i canali blu e verde. Tra gli strumenti disponibili, la funzionalità di "coloc" può essere utilizzata per calcolare automaticamente il canale di colocalizzazione basato sulla soglia di intensità. Inoltre, i metodi basati sull'apprendimento automatico possono essere utilizzati per questo passaggio con la supervisione di un esperto27. - Rilevare e tenere traccia di cellule PCP+ , utilizzando la ricostruzione della superficie automatica e rilevamento (strumento superfice) sopra il canale appropriato co-localizzazione.
Nota: Curatela manuale di rilevamento di eventuali errori e l'esclusione di canzoni con una durata inferiore a una soglia definita (cioè, 150 s) può essere richiesti. - Generare un canale di co-localizzazione specifici per le cellule CD11c-YFP+ , al fine di separare i segnali di PCP e YFP. A tal fine, denotano un poligono gating (Figura 2Bii) che seleziona solo i voxel avendo un'intensità positiva nel verde del canale, ma una bassa intensità nel canale blu.
Nota: rappresentante micrografie mostrando i segnali provenienti dal canale 1, canale 2, il canale di co-localizzazione per PCP, il canale di co-localizzazione per YFP e la combinazione di tutti i canali si trovano nella Figura 2Biii. - Ricostruire la superficie delle cellule CD11c-YFP+ e monitorare la loro posizione nel tempo (strumento di superficie).
Nota: Correzione manuale della eventuale rilevamento errori non è necessaria per questo passaggio. Infatti, a causa di complesse dinamiche spazio-temporali di DC, ricostruire la loro superficie precisa da dati 2P-IVM è un compito impegnativo che non può essere raggiunto con il software di segmentazione disponibili. Tra le ragioni che rendono questo compito impegnativo, protrusioni sottili e variazioni di luminosità non consentono l'utilizzo di alcune tecniche di elaborazione dell'immagine, quali lisciatura filtri o soglia statica. Inoltre, in una rete di DC, è difficile separare singole cellule basate solo sul loro aspetto nei dati 2P-IVM. Per questi motivi, piuttosto che tentare una segmentazione accurata di tuning dei parametri software, ci proponiamo di ricostruire superfici non accurata della DC. Quindi, gestire i possibili errori per mezzo di robusti metriche come descritto in 5.8. -
Misurare la migrazione cellulare.
- Esportare le misure di migrazione classica per PCP+ e cellule CD11c-YFP+ . Tra questi, la "media velocità pista" indica la velocità media migratoria delle cellule, mentre la "traccia di rettilineità" indica la direzionalità delle cellule. Queste misure possono essere esportate come file di foglio di calcolo dal software di imaging.
- Nei file di foglio di calcolo esportato, calcolare la "pista corretta linearità" (noto anche come rapporto corretto confinamento) per PCP+ sia delle cellule CD11c-YFP+ , che è definito come "pista rettilineità" moltiplicato per la radice quadrata di "durata della pista" diviso per la radice quadrata della durata del video. Questa misura è più robusta rispetto "traccia di rettilineità" in presenza di brevi canzoni28, provenienti ad esempio da errori di rilevamento.
Nota: solo i video della stessa lunghezza possono essere confrontati con questa misura.
-
Misurare l'interazione delle cellule.
- Definire un contatto tra una cella di PCP+ e una cella CD11c-YFP+ se la loro distanza (più voxel) è minore o uguale a una soglia (cioè, 2 μm).
Nota: Questa soglia deve essere sufficientemente rigorosa per rilevare un contatto solo quando le cellule sono nelle immediate vicinanze. Tuttavia, vi invitiamo a mantenere questa soglia maggiore di 0, idealmente N volte più grande rispetto al raggio di voxel (N > 2), perché bordo smussatura può fare la ricostruzione delle cellule inferiore alla dimensione effettiva della cella. - Contare il numero e la durata dei contatti tra PCP+ e cellule CD11c-YFP+ . Nel software di imaging, questo può essere fatto per esempio eseguendo un "kiss and run" plug-in. Queste misure possono essere esportate come file di foglio di calcolo dalla scheda statistiche.
- Definire un contatto tra una cella di PCP+ e una cella CD11c-YFP+ se la loro distanza (più voxel) è minore o uguale a una soglia (cioè, 2 μm).
- Importare le misure precedentemente calcolate in un software statistico, le trame di generare ed eseguire test statistici.
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Representative Results
In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per studiare in vivo la motilità e le interazioni tra neutrofili e DC durante l'infezione di influenza nella trachea murina (Figura 3A). A questo scopo, abbiamo isolato i neutrofili PCP+ (92% di purezza; Figura 3B) da CK6-ECFP topi e abbiamo passivamente trasferiti li in un mouse CD11c-YFP infettato con la riossidazione. Dopo di che, abbiamo effettuato 2P-IVM della trachea al 3 ° giorno p.i. A questo punto di tempo abbiamo osservato un chiaro reclutamento dei neutrofili nella zona infetta, come dimostrato da analisi cytometric di flusso (Figura 3). Il protocollo di 2P-IVM richiede l'utilizzo di una specifica scheda chirurgica e un fornitore di ossigeno per i roditori (Figura 1A). Fornitura di ossigeno attraverso una cannula inserita nella trachea, ha aiutato l'animale respirazione, ha facilitato l'esposizione della trachea e controllato il movimento dell'organo connesso con respirazione (Figura 1B). A seguito di questo set-up sperimentale, abbiamo acquisito stabile 4D immagini in vivo nella trachea infettata durante un periodo di 30 min (Figura 3Dfilm 1).
L'analisi delle immagini 4D acquisite attraverso software di imaging specializzato ha permesso per la migrazione delle cellule di misurare e quantificare la dinamica spazio-temporale dei neutrofili e DC. Per quanto riguarda la motilità cellulare, abbiamo osservato differenze significative tra il movimento di DC e i neutrofili reclutati, che ha mostrato una velocità significativamente più veloce rispetto a quest'ultimo (Figura 4A). Questo risultato conferma la natura dinamica dei neutrofili, precedentemente descritta come cellule altamente mobili in grado di migrare verso un chemoattractant fonte29. Per quanto riguarda la direzionalità, abbiamo concluso che la morfologia complessa della DC ha reso frequenti errori nella cella di rilevamento, che a sua volta prodotto tracce con durata in diminuzione e una maggiore varianza del comportamento direzionale misurato (Figura 4B). Per questo motivo, abbiamo calcolato una metrica robusta che è in grado di misurare la direzionalità considerando la durata della traccia. Usando questa metrica, abbiamo osservato una differenza significativa nella direzionalità dei neutrofili vs DC (Figura 4).
Inoltre, il calcolo della distanza tra neutrofili e DC ha permesso di rilevare e analizzare i loro contatti nel tempo. In questo modello sperimentale, abbiamo osservato alcuni neutrofili che formato multiplo-breve contatti con DC e altri che non faceva alcun contatto durante il periodo imaged (Figura 4). Inoltre, lo studio dell'andamento medio della distanza tra neutrofili e DC nel corso del tempo ci ha permesso di studiare il posizionamento complessivo delle cellule studiate (Figura 4E), mentre l'inchiesta della tendenza in celle specifiche ha permesso di caratterizzare il comportamento di ogni singolo-cella (Figura 4FMovie 2).
Figura 1: attrezzature e passaggi per 2P-IVM della trachea murina. (Ai) Il sistema portatile anestesia animale responsabile la ventilazione automatica è collegato ad una pompa che fornisce ossigeno al mouse. Vista frontale (Aii) e vista laterale (Aiii) del Comitato chirurgico su misura per il modello trachea. Il Consiglio è composto da una fase di metallo con un mouse plastica posizionale (Aii-a), un asta per lo svolgimento di un morsetto mobili (Aii-b) e un ottimo traduttore XYZ tunable (Aii-c). (B) passaggi sequenziali del modello chirurgico trachea: (Bi) depilazione della zona chirurgica, (Bii) posizionamento del mouse anestetizzato nel Consiglio chirurgico, (Biii) esposizione chirurgica della trachea, (Biv ) l'intubazione con un catetere con ventilazione artificiale, (Bv) fissazione del catetere, (Bvi) aggiunta di PBS alla trachea esposta, (Bvii) montaggio del vetrino coprioggetto e (Bviii) posizionamento di un catetere con l'anestesia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rilevazione di segnale fluorescente durante 2P-IVM. (A) rappresentazione schematica del rilevamento del microscopio filtro set-up e canali corrispondenti. Specchio dicroico a 560 nm separa blu/verde da emissioni rosso/lontano rosse. Ulteriore specchio dicroico a 495 nm viene utilizzato per riconoscere ulteriormente i subregions differenti dello spettro di emissione. Canale 1 impiega un rivelatore ibrido (filtro di emissione 475/50), mentre il canale 2 usi ad alta sensibilità GaAsP PMT (filtro di emissione 525/50). Punto rappresentativo scatter (B) trame dei segnali 2P mostrando la strategia di gating per la generazione dei canali colocalizzazione per l'identificazione del segnale proveniente dal PCP (Bi) e fluorophores YFP (Bii). (Biii) Rappresentante micrografie mostrando i segnali specifici da canale 1 (Ch 1, blu scuro), canale 2 (Ch 2, verde), il canale di co-localizzazione per PCP (blu chiaro), il canale di co-localizzazione per YFP (giallo) e la combinazione di tutti i canali (Ch 1 + Ch 2 + PCP + YFP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: imaging 4D videomicroscopia dei neutrofili e DC nella trachea influenza infettato. (A) struttura schematica del protocollo. (B) rappresentante flusso cytometric scatterplot mostrando la percentuale di neutrofili per quanto riguarda le cellule CD45 + totale in una sospensione di cellule isolate da midollo osseo murino utilizzando il metodo del gradiente di Percoll. (C) rappresentante flusso cytometric scatterplot mostrando un aumento nella frequenza dei neutrofili in trachee da topi non infetti rispetto ai topi infettati con il virus dell'influenza a giorno 3 p.i. (D) (pannello sinistro) unica immagine anatomica di un murino trachea che mostra l'area selezionata per acquisizione di immagini. (Pannello di destra) Proiezione 3D rappresentativo di una microfotografia di 2P-IVM mostrando la ricostruzione della superficie dei neutrofili (luce blu) e DC (giallo) insieme con le loro tracce al giorno 3 p.i. SHG segnale è mostrato buio blu. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: caratterizzazione del neutrofilo e dinamiche di migrazione e interazione DC nella trachea dell'influenza infettato. Rappresentante trame che mostra la velocità pista significano (A) e rettificato pista rettilineità (C), come definito da Beltman e colleghi (2009)28, dei neutrofili e DC nella trachea al 3 ° giorno p.i. con traccia rettilineità (B) virus dell'influenza. La misurazione della linearità traccia corretta esibisce robustezza di rilevamento errori. (D) istogramma 2D che mostra la frequenza del neutrofilo secondo il loro numero di contatti con la DC e la durata media di contatto. (E) distanza media dei neutrofili al controller di dominio più vicino durante la durata del film. (F) (a sinistra) analisi della distanza di un rappresentante dei neutrofili al controller di dominio più vicino nel tempo. La linea rossa tratteggiata indica la soglia di distanza per considerare che un neutrofilo stabilito un contatto con un controller di dominio. (Giusto i-iii) Micrografie acquisite in diversi momenti che rappresenta la migrazione di una conta dei neutrofili (luce blu) verso un DC (giallo). Tracce di cella vengono visualizzate come una linea multicolore che cambia colore dal blu al rosso a rappresentare il tempo. SHG segnale da collagene fibrillare è mostrato in blu scuro. Barra della scala = 50 µm. In tutte le figure, i dati presentati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Risultati sono riportati come media ± SD. statistiche da test di Welch. NS p > 0,05; p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: neutrofili e DC dinamiche nella trachea durante l'infezione di riossidazione. 30 min time-lapse immagine 3D che mostra dinamiche di interazione tra i neutrofili (luce blu) e DC (giallo), nonché le loro rispettive tracce per quanto riguarda la rete di collagene (blu scuro) della trachea. Rappresentante del neutrofilo-DC interazioni sono indicati da frecce bianche. Tracce di cella vengono visualizzate come una linea multicolore che cambia colore dal blu al rosso a rappresentare il tempo. Barra della scala = 50 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 2: rappresentante a breve termine del neutrofilo-DC interazione nella trachea durante l'infezione di riossidazione. 30 min time-lapse 3D immagine mostrando una rappresentanza interazione tra una conta dei neutrofili (luce blu) e un controller di dominio (giallo) e le loro rispettive tracce. Tracce di cella vengono visualizzate come una linea multicolore che cambia colore dal blu al rosso a rappresentare il tempo. SHG segnale da collagene è mostrato in blu scuro. Barra della scala = 10 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per la generazione di immagini 4D che mostrano la migrazione dei neutrofili passivamente trasferiti e loro interazioni con DC durante un'infezione influenzale nella trachea del mouse. Il modello descritto 2P-IVM saranno rilevante per studiare la dinamica delle cellule immuni durante un'infezione delle vie aeree.
Recentemente, diversi modelli basati sulla visualizzazione delle dinamiche delle cellule delle vie aeree sono stati sviluppati9,10,11,12,13,14,15 ,16. Tuttavia, in vivo imaging del polmone è comunque impegnativo, considerando la posizione anatomica di questo organo e le difficoltà tecniche per minimizzare il movimento durante il ciclo di respirazione30. Per superare questi problemi, alcuni autori hanno proposto l'uso di una camera di aspirazione circolare costruito su misura, che deve essere inserito chirurgicamente nel torace13,14. Tuttavia, questa procedura richiede un intervento invasivo che poteva compromettere i risultati, soprattutto in quegli studi che si sono concentrati sullo studio della risposta infiammatoria. Inoltre, modelli chirurgici polmone presentano una limitazione per l'imaging profondo del tessuto a causa della rifrazione della luce ha provenuta dall'aria in alveoli17. Al contrario, diversi modelli tracheale sono stati recentemente impiegati per studiare la dinamica delle cellule nell'epitelio delle vie aeree. Formazione immagine di quest'organo presenta chiari vantaggi rispetto al polmone, come ad esempio l'intervento chirurgico relativamente semplice per esporre e immobilizzare l'organo, così come la maggiore accessibilità all'epitelio trachea necessaria. Il modello proposto trachea è anche rilevante per indagare l'inizio della risposta contro gli agenti patogeni delle vie aeree, come il virus dell'influenza, dal momento che la trachea è uno dei primi siti della replicazione virale nel corso di un' infezione di riossidazione8.
Interessante, uno studio che indichi un'alternativa senza intubazione metodo per l'imaging della trachea è stato recentemente pubblicato12. Questo metodo è caratterizzato da un'infiammazione in diminuzione e mostra chiari vantaggi negli studi dove deve essere conservata la funzione di mucociliarity delle cellule epiteliali. Tuttavia, questo metodo non garantisce una stabilità sufficiente e l'acquisizione di segnali più luminosi necessari studiare contatti cellula-cellula in una gamma di pochi µm. al contrario, il metodo presentato nel protocollo corrente fornisce migliore immobilizzazione dell'organo Grazie per l'intubazione e permette la rilevazione di segnali di fluorescenza più forti come risultato la distanza più breve tra l'organo e il vetrino coprioggetti12.
Realizzazione di immobilizzazione del tessuto durante l'acquisizione di immagini in vivo 2P-IVM è la fase più critica per generare dati ottimali. Alcune misure fondamentali che contribuiscono alla stabilità del metodo presentato includono: un'anestesia del mouse appropriato; un'intubazione di mouse corretto; e un'esposizione chirurgica della trachea che consente un facile accesso all'organo per il vetrino coprioggetti. Inoltre, il giusto numero di cellule (idealmente 30 cellule per campo visivo) di imaging rafforzerà i risultati ottenuti. L'assunzione del numero ottimo di cellule dipenderà in larga misura dalla dose di infezione virale, che è molto influenzata dalla corretta amministrazione dell'inoculo virale.
Un altro passaggio fondamentale del protocollo è l'esposizione chirurgica della trachea. Diverse misure possono essere adottate per ridurre al minimo i danni causati all'organo durante la chirurgia. Ad esempio, la trachea non dovrebbe essere toccata direttamente con strumenti chirurgici. Al contrario, deve essere esposto modificando solo i tessuti circostanti (pelle, ghiandole salivari e muscoli). Se strettamente necessario, trachea dovrebbe essere gestita utilizzando elementi non affilati. Inoltre, gli sforzi dovrebbero essere fatto per evitare il danno del vaso sanguigno. Infine, per prevenire la disidratazione dell'organo, è anche importante per coprirlo con PBS immediatamente dopo la chirurgia.
Nonostante i vantaggi unici di questo metodo rispetto ai metodi descritti in precedenza per la visualizzazione delle interazioni delle cellule immuni della mucosa tracheale, l'uso di questo modello presenta alcune limitazioni. Come descritto in precedenza, la presenza di infiammazione connessa con la chirurgia trachea potrebbe rappresentare uno svantaggio quando si studia le risposte immunitarie. Per ovviare a questa limitazione, è possibile somministrare farmaci antinfiammatori prima dell'inizio della procedura. Un'altra limitazione di questo modello è legata alla presenza di un segnale di forte autofluorescence esistenti nelle vie aeree, che è generata principalmente da cellule residenti e lo strato di muco. Questa fluorescenza aspecifica Crea artefatti che potrebbero ostacolare l'analisi. Inoltre, calcolo fuorviante del parametro di rettilineità traccia potrebbe essere generato quando confronto cella tracce di diversa durata e quando introducono errori di rilevamento tracce di breve durata26. Per ovviare a questo problema, abbiamo applicato un coefficiente di penalizzazione per correggere pista rettilineità. Tale correzione è destinato per minimizzare l'effetto di miss-tracking in risultati28.
Un aspetto cruciale di esperimenti 2P-IVM è la possibilità di riutilizzo di topi che sono stati sottoposti a chirurgia e imaging. L' in vivo imaging protocollo descritto qui non richiede accumulazione eutanasia o organo animale, lasciando così la possibilità di recuperare e riutilizzare topi dopo chirurgia per altre procedure. Utilizzando un unico mouse, ad esempio, per eseguire imaging trachea in tempi diversi punti potrebbero ridurre notevolmente il numero di animali totali necessaria in un esperimento, sostengono il principio di riduzione degli animali . Inoltre, si potrebbe anche ridurre la variabilità inter-individuale. Tuttavia, riutilizzo e recupero degli animali deve rispettare standard di benessere degli animali che comprende la somministrazione di corretto farmaci analgesici e antibiotici agli animali durante il tempo di recupero. Tutte queste procedure devono essere inclusi nel protocollo di sperimentazione animale e approvate dalle autorità veterinario locale.
Il protocollo descritto può essere facilmente adattato allo studio di altri tipi delle cellule immuni. Per esempio, isolamento e l'iniezione delle cellule di T di patogeno-specifiche (fluorescenti o tinto) potrebbe essere utilizzati per studiare la cellula T attivazione dinamica31 così come la loro interazione con altre cellule quali DC tracheale. In modo simile, la visualizzazione di sangue o di vasi linfatici potrebbe rappresentare un approccio interessante per studiare il reclutamento di cellule infiammatorie nel tessuto trachea durante il corso dell'infezione. Inoltre, 2P-IVM della trachea potrebbe essere applicato anche per studiare la dinamica della risposta immunitaria agli altri agenti patogeni nell'aria. Pertanto, l'uso di transgenici fluorescenti patogeni nell'aria, come Streptococcus pneumoniae32, creerà nuove opportunità per studiare le loro interazioni con il sistema immunitario. Sebbene questa procedura illustra le dinamiche delle cellule immuni di misura durante l'infezione, potrebbe essere applicato anche a diversi settori tra cui il cancro, l'asma, o guarigione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzero (SNF) (176124, 145038 e 148183), l'europeo Commissione Marie Curie per il reinserimento (612742) e il SystemsX.ch una sovvenzione di D.U.P (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
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