Summary
I denne studien presenterer vi en protokoll for å utføre to-fotonet intravital imaging og celle samhandling analyse i murine tracheal mucosa etter infeksjon med influensavirus. Denne protokollen vil være relevant for forskere studere immun celle dynamics under luftveisinfeksjoner.
Abstract
Analyse av celle-celle eller cellen-patogen samhandling i vivo er et viktig verktøy for å forstå dynamikken i immun respons på infeksjon. To-fotonet intravital mikroskopi (2P-IVM) gir observasjon av cellen interaksjoner i dype vev i levende dyr, samtidig som photobleaching genereres under bildeopptak. Ulike modeller for 2P-IVM av lymfoide og ikke-lymfoide organer er beskrevet hittil. Bildebehandling åndedretts organer er imidlertid en utfordring på grunn av bevegelsen knyttet pust syklusen av dyret.
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere i vivo immun celle interaksjoner i luftrøret mus infisert med influensavirus benytter 2 P-IVM. Til dette formålet utviklet vi en egendefinert tenkelig plattform, som inkluderte kirurgisk eksponering og intubasjon av trachea, etterfulgt av oppkjøpet av dynamiske bilder av nøytrofile og dendrittiske celler (DC) i slimhinnene epitel. I tillegg detaljerte vi trinnene for å utføre influensa intranasal infeksjon og flyt cytometric analyse av immunceller i luftrøret. Til slutt, vi analyserte nøytrofile og DC motilitet samt deres samspill i løpet av en film. Denne protokollen tillater generering av stabile og lyse 4D-bilder nødvendig for å vurdere celle-celle interaksjoner i luftrøret.
Introduction
To-fotonet intravital mikroskopi (2P-IVM) er en effektiv teknikk for sanntid tenkelig celle til celle samhandlinger som de forekommer i deres naturlige miljø1. En av de viktigste fordelene med denne metoden er at det tillater studiet av cellulære prosesser på en større prøven dybde (500 µm til 1 mm) sammenlignet med andre tradisjonelle imaging teknikker2. Samtidig minimerer bruk av to lav-energi fotoner generert av to-fotonet laser vev Foto-skade vanligvis assosiert med bilde oppkjøpet prosessen2. I løpet av det siste tiåret, er 2P-IVM brukt for å studere ulike typer celle-celle interaksjoner i flere disipliner3,4,5. Disse studiene har blitt spesielt relevant å undersøke immunceller, som er preget av deres høy dynamikk og dannelsen av fremtredende kontakter etter signalene generert av andre celler og miljø. 2P-IVM er også brukt for å studere interaksjonen mellom patogen og vert6. Faktisk har det tidligere vist at noen patogener kan endre type og varighet av kontaktene mellom immunceller, hindrer, resultatet av immunrespons7.
Luftveiene mucosa er det første stedet der immunrespons mot luftbårne patogener er generert8. I vivo analyse av patogen vert interaksjoner i dette vevet er derfor avgjørende å forstå initiering av forsvarsmekanismer vert under infeksjon. Men er 2P-IVM i luftveiene utfordrende skyldes gjenstander produsert av puste syklusen av dyret, som truer prosessen med bildeopptak. Nylig har ulike kirurgisk modeller blitt beskrevet for bildebehandling murine luftrøret9,10,11,12 og lungene13,14,15, 16. Tracheal 2P-IVM modeller representerer en utmerket oppsett å visualisere den innledende fasen av immunreaksjon i øvre luftveiene, mens lunge-alveoler 2P-IVM modeller er mer egnet til å studere den sene fasen av infeksjoner. Utviklet lunge modellene presentere en begrensning assosiert med tilstedeværelse av luftfylte alveoler, som begrenser optisk gjennomtrengning av laser og gjøre den slimhinnene lag i intrapulmonary luftveiene utilgjengelig for i vivo imaging17 . Omvendt, strukturen i luftrøret, dannet av en kontinuerlig epitel, forenkler bildeopptak.
Her presenterer vi en protokoll som inneholder en detaljert beskrivelse av trinn kreves for å utføre influensa infeksjon, kirurgisk utarbeidelse av dyrene, og 2P-IVM av trachea. I tillegg beskriver vi en bestemt eksperimentelle oppsett for visualisering av nøytrofile og dendrittiske celler (DC), to immun celletyper som spiller en viktig rolle som meglere på forsvar mekanisme mot influensa virus18,19 . Til slutt, vi beskriver en prosedyre for å analysere nøytrofile-DC interaksjoner. Kontaktene har vist seg å modulere DC aktivisering og, senere, å påvirke immunreaksjoner mot patogener20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer som involverer mus ble utført i henhold til sveitsiske føderale veterinær kontor retningslinjer og dyr protokollene ble godkjent av lokale veterinær myndighetene.
1. influensa infeksjon av CD11c-YFP mus
- Biosikkerhet
Merk: Mus tilpasset belastningen av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) var vokst befruktede egg, renset og titreres som beskrevet tidligere21. Alle foranstaltningene innvolvere infiserte dyr eller biologiske prøver ble gjennomført under en biosafety regjering etter biosikkerhet nivå (BSL) 2 forhold.- Rengjør biosikkerhet kabinettet med en 70% etanol løsning før og etter infeksjon prosedyren.
- Forkaste alle avfall produsert under denne prosedyren følgende riktig som biosikkerhet retningslinjer (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Kast avfall i autoclavable hyller og forurenset væsker i plastposer fylt med 70% etanol løsning eller medisinsk desinfeksjonsmiddel.
- Influensa intranasal infeksjon
MERK: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 på C57BL/6J bakgrunn ble brukt i denne studien. Mus ble opprettholdt i det bestemte patogen-fri anlegget ved Institutt for forskning i biomedisin.- Plass maksimalt 5 alder og kjønn-samsvar (seks å åtte uke gamle) CD11c-YFP mus per bur. Vent minst to dager for mus acclimation å boforhold før infeksjon prosedyren.
- Defrost PR8 lager og forberede den tilsvarende fortynning med kaldt 1 x Dulbeccos fosfat buffer saline endret uten veisalt og magnesiumklorid (PBS) for å få en endelig konsentrasjon av 200 plakk danner enheter (PFU) i 30 er holde virus fortynning µL. på is under hele prosedyren.
Merk: Serine hver gruppe med influensavirus før bruk anbefales å sikre en presis infeksjon dose. - Sprøyte inn en dose av ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) intraperitoneally (IP) bruker en 26 G pinne 1 mL sprøyte.
- Vent til musen er fullt bedøvet (fullstendig tap av både rettende og pedal uttak refleks). Dyp anestesi er nødvendig for en optimal infeksjon, siden ikke-fullt bedøvet mus vil svelge eller utvise virus inoculum, fører til variasjoner i infeksjon dosen.
- Plass bedøvet musen i supine posisjon. Samle 15 µL av virus inoculum. Plassere pipette nær musen venstre nesebor og kvitte seg av viral inoculum dråpe for dråpe. Som drops må inhaleres, ikke Pipetter dem direkte inne i nesen hulrommet.
- Vente 2-5 min og plassere pipette med de resterende 15 µL av virus inoculum i det høyre neseboret.
Merk: For å unngå kvelning, dispensere små dråper i ca 20 s intervaller. - Kontroller at musen er riktig åndedrag og plassere den i et bur i laterale liggesår. Dataskjerm musen pust og anestesi utvinning (ca 60 minutter etter innledningen).
Merk: Det er mulig å infisere mer enn 1 musen samtidig. I dette tilfellet administrere viral inoculum i det venstre neseboret alle mus i en sekvens, vente på 2-5 minutter og deretter administrere viruset i det høyre neseboret. For å unngå variasjon mellom individer, infisere mer enn 3 mus samtidig. - Overvåke status og vekt tap av dyrehelse daglig.
- Euthanize mus etter Human sluttpunktet bestemmes av myndighet retningslinjene. Metoden euthanasia må godkjennes av dyr eksperimentering myndigheter og må respektere lokale etiske regler. Etter to-fotonet eksperimenter, euthanize mus av administrasjonen av en overdose av ketamin/xylazine etterfulgt av cervical forvridning. I alle andre eksperimenter, bruke CO2 innånding som en metode for euthanasia.
Merk: For å måle de viral titers infiserte luftrøret, 50% vev kultur infeksiøs dose (TCID50) analysen eller sanntid polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) analysen kan utføres som beskrevet tidligere23.
- Evaluering av nøytrofile rekruttering i luftrøret av flowcytometri
Merk: Denne delen av protokollen er valgfritt. Formålet er å evaluere nøytrofile rekruttering i tracheal mucosa etter influensa infeksjon.- Euthanize infisert og smittet mus på dag 3 etter infeksjon (pi) av CO2 innånding.
Merk: For å forhindre tracheal skade, unngå å bruke cervical forvridning for å avlive dyrene. I tillegg anbefales perfusjon euthanized mus å unngå forurensning fra blodet nøytrofile. - Spray musen halsen med 70% etanol løsning og utføre en huden snitt med kirurgisk saks fra brystet til haken.
- Separate spyttkjertler ved hjelp av pinsett og utsette luftrøret.
- Dissekere musklene rundt luftrøret ved hjelp av tang og saks.
Merk: Dette trinnet må utføres nøye siden luftrøret kan lett skades under prosedyren. - Hold luftrøret med tang og nøye koble spiserøret av disseksjon.
- Holder den intrathoracic delen av trachea med tang, gjør et snitt i begynnelsen av bronkial treet. Deretter ta luftrøret fra strupehode og fjern forsiktig noen muskulaturen igjen.
- Plass orgelet i en 1,5 mL tube som inneholder RPMI 1640 + HEPES medium (RPMI) på isen.
- Forberede enzym blandingen luftrøret fordøyelsen, som inneholder 0,26 enheter/mL collagenase (I og II) og 0,2 mg/mL av DNase I RPMI.
- Plass dissekert luftrøret i en 6-vel plate som inneholder 1 mL av enzymet blanding.
- Skjær orgelet i små biter med hjelp av tang og saks. Holde platen på isen i dette trinnet.
- Ruge på 37 ° C i 45 minutter. Samtidig riste platen hvert 15 min.
- Stoppe enzym fordøyelsen ved legge 1 mL av FACS vaske bufferen (2 mM EDTA og 2% inaktivert filter-steriliseres fosterets bovin serum (FBS)) i PBS.
- Resuspend løsningen med en 1 mL pipette for å fjerne delvis ufordøyd biter av vev.
- Overføre løsningen i en annen brønn ved å sende innholdet gjennom en 40 µm sil. Deretter forsiktig knuse gjenværende bitene av orgelet fanget på silen med en 2 mL sprøyte stempelholderen.
Merk: Smashing delvis ufordøyd stykker av trachea over silen er et kritisk steg til få et optimalt antall celler under flyt cytometric analysen. - Vask brønnen og silen med FACS vaske bufferen og overføre suspensjonen i en 5 mL tube holdt på is.
- Sentrifuge rør 166 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend cellene i 100 µL FACS vaske bufferen.
- Fortsett med antistoff overflate flekk for flowcytometri. Kort, blokkere Fc reseptorer isolert cellene med et antistoff mot CD16/32, etterfulgt av overflaten flekker. Hvis du vil identifisere nøytrofile, flyt cytometri panelet skal inneholde følgende antistoffer: αLy6G, αCD11b, αCD45, samt en levedyktighet fargestoff utelate døde celler.
- Kjøre hele innholdet på eksemplene på en flyt cytometer og analysere dataene.
- For å få et optimalt antall immunceller, kjøre enkeltcelle suspensjon på en hastighet ikke høyere enn 3000 hendelser/s. Dette reduserer antall hendelser utelukket under oppkjøpet. Bruker denne protokollen, bør det være mulig å få 1 til 2 millioner av celler per spor.
- Euthanize infisert og smittet mus på dag 3 etter infeksjon (pi) av CO2 innånding.
2. isolering og injeksjon av nøytrofile
Merk: I denne prosedyren B6.129 (ICR)-vs (CAG-ECFP) CK6Nagy/J mus (CK6-ECFP) var brukt24. Disse dyrene uttrykke CFP i alle celletyper under menneskelige β-utgangen arrangøren. Alternativt er det også mulig å bruke C57BL/6J mus å isolere celler og stain dem i henhold til protokollen som beskrevet i trinn 2.6. Den rensing og manipulasjon av nøytrofile kan øke deres aktiveringsstatus potensielt endre migratory og funksjonelle egenskaper.
- Euthanize dyret av CO2 innånding.
- Fjern både femurs og tibias og mildt feilfri dem ved hjelp av pinsett.
- Skjær bein epiphyses og flush benmargen bruker en 1 mL sprøyte fylt med sterilt kaldt PBS, i en 50 mL tube holdt på is.
- Resuspend cellene med en 18 G nål og filtrere celle suspensjon med en 40 μm sil. Vask en gang med PBS 110 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend celler i 2 mL kaldt PBS.
-
Fortynne 100% Percoll 9:1 i 10 x PBS og forberede gradient løsninger av percoll 72% og 64% 52% med 1 x PBS. Laget nøye 2 mL av hver av de tre graderingene i en 15 mL tube, starter fra de konsentrert en.
- Legg nøye 2 mL benmarg celle suspensjon på toppen av graderinger og sentrifuger 1100 x g i 30 min ved romtemperatur (RT) uten akselerasjon og brems.
- Forsiktig fjerne bandet på grensesnittet mellom 64% og 72% og vask en gang på 200 x g i 5 min på 4 ° C med kaldt PBS. Resuspend celler i et volum på 100 μL PBS og holde dem på isen. Renheten av nøytrofile forventes å være høyere enn 90%.
- Eventuelt etiketten nøytrofile med en celle spredning kit bruker produsentens protokollen. Legge til fargebad celle suspensjon til en siste konsentrasjon av 10 μM i et volum på 1 mL, ruge på 37 ° C i 30 min og vask (166 x g, 5 min).
- Anslå celle konsentrasjon ved hjelp av en hemocytometer og injisere intravenøst 5 x 106 celler i største volum 100 μL i tidligere infiserte CD11c-YFP+ mus med 26 G pinne 1 mL sprøyte, 12 h før bildebehandling.
3. forberedelser musen for Imaging
-
Anestesi
- Bedøve infiserte CD11c-YFP+ mus på dag 3 p.i. etter trinn 1.2.3.
- Når mus er dypt anesthetized, forberede et kateter anestesi re dosering.
- Fjerne en 30 G nål fra en sprøyte ved hjelp av pinsett.
- Sett inn nålen til et 20 cm stykke PE-10 medisinsk silisium rør.
- Sett inn en 30 G nål sprøyte fylt med ketamin/xylazine blandingen på den andre siden av røret.
- Fjerne luften inne i røret.
- Forberede en 20 G kateter koblet til et rør fra en oksygen insufflating maskin å vedlikeholde automatiserte ventilasjon (figur 1Ajeg). Sett den på pusten forholdet 130 slag per minutt (b.p.m.) med en Tidalvolum 0,2 ml bruker en 100% oksygen gassforsyning.
-
Forberede musen kirurgi
- Hold musen på bestemte tilpassede kirurgisk bord (figur 1Aii-iii) over en oppvarmet plate eller oppvarmet kirurgisk benken satt til 37 ° C for hele tiden i operasjonen.
- Barbere håret fra halsen av musen bruker en elektrisk barberhøvel og en depilatory fløte (figur 1Bjeg).
- Plasser musen over plast musen posisjonelle (figur 1Aii-en), holde dyr hodet utenfor den posisjonelle (figur 1Bii) å lage en vinkel som forenkler intubasjon av trachea.
- Fikse forelimbs og paws halen med kirurgisk tape, fukt musen øynene med en vitamin A beriket gel og desinfisere musen halsen (figur 1Bii).
-
Kirurgi
- Forberede riktig autoklaveres elementer, nemlig saks, Mikrokirurgiske saks og tang.
- Utføre et lite innsnitt på lenge mediale aksen i nakken, ca 1 cm lang, det midterste området mellom øvre del av brystet og linjen passerer gjennom lavere mandible (figur 1Biii).
- Flytte laterally huden patcher og spyttkjertler og visualisere luftrøret, dekket av musklene. Deretter dissekere tracheal musklene forsiktig med tang (figur 1Biii).
- Intubate musen med et kateter og starte kunstig ventilasjon (figur 1Biv).
Merk: Kateter består av en ekstern plastdelen som beskytter tracheal mucosa, og en indre jern nål. Tilstedeværelsen av nålen er den ideelle løsningen å utvide og stabilisere luftrøret og å regulere dens redegjørelse. Kunstig ventilasjon gjennom kateter garanterer riktig pust av musen. - Straks kunstig ventilasjon å dataskjerm musen puste.
- Fastsette kateter høyde og retning med en kirurgisk krok (figur 1Bv) koblet til bestemte stangen i kirurgiske styret (figur 1Aii-b). Utsett luftrøret på samme høyde over haken.
- Omslutter luftrøret med vaselin og dekke det med noen dråper forvarmet PBS garantere riktig fuktighet til orgelet (figur 1Bvi).
- Montere dekkglassvæske over utarbeidelse. Fest en dekkglassvæske på en metall (figur 1Bvii), som vil bli skrudd til XYZ oversetteren (figur 1Aii-c) for dette trinnet. Justere XYZ oversetteren å plassere dekkglassvæske på kirurgisk utarbeidelse.
- Plasser kateter for administrasjonen av av bedøvelsen intraperitoneally (figur 1Bviii).
- Sette inn 50% av den første dosen av ketamin/xylazine blanding enhver 30 min.
Merk: Nytt dosering fra 50% til 25% av opprinnelige ketamin/xylazine blandingen er en trygg og gyldig alternativ25. Men siden denne protokollen er terminal og en streng immobilisering av dyret er nødvendig under hele prosedyren, bruke høyere doser for å opprettholde et dype kirurgiske fly av anestesi.
4. i Vivo tidsinnstilt bildebehandling
Merk: Bildeopptak ble utført med en oppreist to-fotonet mikroskop, utstyrt med to Ti:Sa lasere, temperaturkontrollert inkubasjon kammer og en 25 X / NA 1.1 vann nedsenking mål. Photomultipliers (avdrag) brukes for bildeopptak var hybrid detektorer eller høy følsomhet GaAsP.
- Plasser kirurgisk styret med bedøvet musen inne i mikroskopet inkubasjon kammeret (forvarmet til 37-38 ° C) og legge en dråpe vann på dekkglassvæske.
- Center og Finn fokus på tracheal vev.
-
Angi skanning frekvensen til 800 Hz, med 520 x 520 piksler, en synsfelt 440 x 440 μm2 og linje gjennomsnittlig 1.
- Tune Ti:Sa laseren 830 nm å opphisse andre harmonisk generasjon (SHG) fra kollagen, med en veiledende kraft ved kilden på 150 mW. Tune andre Ti:Sa laser på 920 nm med 94 mW ved kilden, å opphisse både CFP og YFP.
- Oppsett 3D og timelapse vinningen måte med samtidige eksitasjon
Merk: Holde laser krefter så lavt som mulig for å minimalisere photobleaching og Phototoksisitet.
- Registrere fluorescens bruker to kanaler i ikke-descanned modus, med master dichroic speil på 560 nm. I oppsettet brukes i denne protokollen, et andre dichroic speil splitte signalet på 495 nm å skille kanal 1 (utslipp filter 475/50) fra kanal 2 (utslipp filter 525/50) (figur 2A). Denne konfigurasjonen samler SHG lys fra kollagen i første kanalen, mens CFP utslipp samles i begge kanaler 1 og 2 og YFP samles i kanal 2.
- Definere en rekke 50 μm langs Z-aksen, steg størrelse på 3 μm (voxel størrelse 0,86 μm x 3 μm). Post bilder hver 30 s for en total varighet på 30 min.
- Om ønskelig kan hente flere områder. Før du kjører flere oppkjøp, sjekk vitale og reinject anestesi gjennom kateter hvis nødvendig (se trinn 3.3.10).
- På slutten av avbildingsprosessen, euthanize musen gjennom ketamin/xylazine overdose etterfulgt av cervical forvridning.
5. bilde prosessering og kvantitativ analyse av nøytrofile-DC motilitet og samhandling
Merk: I denne protokollen, en spesialisert bildebehandlingsprogramvare ble brukt for å analysere mikroskopi dataene.
- Etter 4D image vinningen er fullført, overføre filer (data og metadata) på en arbeidsstasjon med tilstrekkelig beregningsressurser (foreslo systemkrav: 32 GB RAM, rask solid-land-stasjoner, siste CPU, dedikert GPU basert på et massivt parallellarkitekturen).
- Åpne i tenkelig programvare.
- Spille av video og sikre at cellene rundt tydelig og at tenkelig gjenstander er fraværende.
Merk: dette Kontroller at både bevegelse av prøven og lysstyrke variasjonen er tilstrekkelig begrenset. Faktisk representerer disse utfordringer for automatisk analyse26. Hvis bevegelse av prøven mellom tilstøtende rammer er overdreven, bruke en drift korreksjon metoden, bruker for eksempel SHG kanalen som en fast referanse. Dette kan bedre mål bevegelsen av cellene ikke bevegelse av prøven. I tillegg, i nærvær av lys bakgrunn eller rusk, sviske rekonstruert overflater med volum som utvalg parameter. - Generere en co lokalisering kanal bestemt for CFP+ celler, for å skille signalet mellom CFP og kollagen (SHG). Dette betegne gating polygon (figur 2Bjeg) som velger bare voxels å ha en positiv intensitet i den grønne kanalen og i den blå kanalen.
Merk: Denne fremgangsmåten varierer avhengig det filteret mikroskopet og flekker av cellene. Det kan oppnås ved å velge bare voxels med nok intensitet i både grønne og blå kanalene. Blant de tilgjengelige redskapene er kan funksjonen "coloc" brukes til å automatisk beregne colocalization kanalen basert på intensitet terskelverdi. I tillegg kan metoder basert på maskinlæring brukes for dette trinnet med veiledning av en sakkyndig27. - Registrere og spore CFP+ celler, bruker automatisk surface rekonstruksjon og sporing (overflate verktøyet) over aktuelle co lokalisering kanalen.
Merk: Manuell konservering av eventuell sporingsfeil og begrensning av spor med varighet kortere enn en angitt terskel (dvs. 150 s) kan være nødvendig. - Generere en co lokalisering kanal bestemt for CD11c-YFP+ celler, for å skille CFP og YFP signaler. Dette betegne gating polygon (figur 2Bii) som velger bare voxels å ha en positiv intensitet i den grønne kanalen, men en lav intensitet i den blå kanalen.
Merk: Representative micrographs viser signalene fra kanal 1, kanal 2, co lokalisering kanal for CFP, co lokalisering kanal for YFP og kombinasjonen av alle kanaler finnes i figur 2Biii. - Rekonstruere overflaten av CD11c-YFP+ cellene og spore deres posisjon over tid (overflate verktøyet).
Merk: Manuell feilretting eventuell sporing er ikke nødvendig for dette trinnet. Faktisk på grunn av komplekse spatio-temporale dynamikken i DC er rekonstruere sine presise overflaten fra 2 P-IVM data en utfordrende oppgave som kan oppnås med segmentering tilgjengelig programvare. Blant årsakene som gjør denne oppgaven utfordrende, tillater ikke tynne utstikkende deler og lysstyrke varianter for bruk av visse bildebehandling teknikker, for eksempel utjevning filtre eller statisk terskelverdi. Videre, i et nettverk av DC er det vanskelig å skille enkeltceller basert på utseendet i 2P-IVM data. For disse grunner, heller enn å forsøke en nøyaktig segmentering av innstiller programvare parametere, foreslår vi å rekonstruere ikke-nøyaktig overflater av DC. Deretter håndtere mulig feilene ved hjelp av robuste beregninger som beskrevet i 5,8. -
Måle celle migrasjon.
- Eksportere klassisk migrasjon tiltak for både CFP+ og CD11c-YFP+ celler. Blant disse angir "spor hastighet betyr" gjennomsnittlig vandrende hastigheten av cellene mens "spor rett linje" indikerer retningen av cellene. Disse tiltakene kan eksporteres som en regnearkfil fra tenkelig programvare.
- I de eksporterte regnearkfiler, beregne "korrigert spor retthet" (også referert til som korrigerte confinement forhold) for både CFP+ og CD11c-YFP+ celler, som er definert som "spor rett linje" multiplisert av "spor varighet" delt av videoen varighet. Dette tiltaket er mer robust enn "spor rett linje" i nærvær av kort spor28, stammer eksempelvis fra sporingsfeil.
Merk: bare videoer med samme lengde, kan sammenlignes med dette tiltaket.
-
Måle celle interaksjon.
- Definere en kontakt mellom en CFP+ -cellen og en CD11c-YFP+ celle hvis deres avstand (nærmeste voxels) er lik eller mindre enn en terskel (dvs. 2 μm).
Merk: Denne terskelen bør være tilstrekkelig strenge å oppdage en kontakt når celler er i nærheten. Men vi anbefaler for å holde denne terskelen større enn 0, ideelt N ganger større enn voxel radius (N > 2), fordi grensen utjevning kan gjøre gjenoppbyggingen av celler mindre enn selve cellen. - Tell antallet og varigheten av kontakter mellom CFP+ og CD11c-YFP+ celler. I tenkelig programvare gjøres dette for eksempel ved å kjøre en "kysse og kjøre" plugg i. Disse tiltakene kan eksporteres som en regnearkfil fra kategorien statistikk.
- Definere en kontakt mellom en CFP+ -cellen og en CD11c-YFP+ celle hvis deres avstand (nærmeste voxels) er lik eller mindre enn en terskel (dvs. 2 μm).
- Importer tidligere beregnede målene i en statistisk programvare, generere tomter og utføre statistiske tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet beskrev vi en detaljert protokoll for å studere i vivo motilitet og samspillet mellom nøytrofile og DC under influensa infeksjon i murine luftrøret (figur 3A). Til dette formålet isolerte vi CFP+ nøytrofile (92% renhet; Figur 3B) fra CK6-ECFP overført mus og vi adoptively dem til en CD11c-YFP mus infisert med influensa. Etter at spilte vi 2P-IVM av trachea på dag 3 p.i. På dette tidspunkt observerte vi et klart rekruttering av nøytrofile i infiserte området, som vist av flyt cytometric analyse (Figur 3 c). 2P-IVM protokollen krever bruk av en bestemt kirurgisk bord og en oksygen leverandør for gnagere (figur 1A). Leverer oksygen gjennom en kanyle inn i luftrøret hjalp dyr puster lettere utredning av trachea og kontrollert orgel bevegelsen tilknyttet puste (figur 1B). Etter denne eksperimentelle set-up kjøpte vi stabil 4D bilder i vivo i infiserte luftrøret i en periode på 30 min (figur 3Dfilm 1).
Analyse av ervervet 4D bilder gjennom spesialiserte bildebehandlingsprogramvare tillatt å måle migrering av celler og kvantifisere spatio-temporale dynamikken av nøytrofile og DC. Om cellen motilitet observerte vi betydelige forskjeller mellom bevegelse av DC og rekruttert nøytrofile, som viste en betydelig raskere hastighet enn den sistnevnte (figur 4A). Dette resultatet bekrefter dynamikken i nøytrofile, tidligere beskrevet som svært motile celler i stand til å migrere mot en chemoattractant kilde29. Om retningen, vi konkluderte med at kompleks morfologi av FM gitt hyppige feil i celle sporing, som igjen produsert spor med redusert varighet og økt variansen av målt retningsbestemt atferd (figur 4B). Av denne grunn beregnet vi en robust beregning som kan måle retningen ved å vurdere spor varighet. Bruker denne beregningen, observerte vi en betydelig forskjell i retningen av nøytrofile vs DC (figur 4C).
I tillegg beregning av avstanden mellom nøytrofile og DC lov til å gjenkjenne og analysere sine kontakter over tid. I denne eksperimentelle modellen observerte vi noen nøytrofile som dannet flere-kort kontakter med DC og andre som ikke utgjør noen kontakt i fotografert perioden (Figur 4 d). Videre studier av gjennomsnittlig utviklingen av avstanden mellom nøytrofile og DC over tid tillot oss å studere generelle plasseringen av studerte celler (figur 4E), mens etterforskningen av utviklingen i bestemte celler tillatt å karakterisere den virkemåte for hver encellede (figur 4FMovie 2).
Figur 1: utstyr og fremgangsmåten for 2P-IVM av murine luftrøret. (Ai) Bærbar dyr anestesi systemet for automatisert ventilasjonen er koblet til en pumpe som leverer oksygen til musen. Foran visning (alle) og siden (Aiii) av skreddersydde kirurgisk styret brukt for tracheal modellen. Styret består av en metal scene med plast mus posisjonelle (Aii-en), en stang for å holde en bevegelig klemme (Aii-b), og en fin tunable XYZ oversetter (Aii-c). (B) sekvensielle trinn av tracheal kirurgisk modellen: (Bi) hårfjerning av kirurgiske området, (Bii) plassering av bedøvet musen i kirurgiske styret, (Biii) kirurgisk utredning av trachea, (Biv ) intubasjon med et kateter kunstig ventilasjon (Bv) fiksering av kateter, (Bvi) tillegg av PBS til utsatte luftrøret, (Bvii) montering av dekkglassvæske og (Bviii) plassering av et kateter med anestesi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fluorescerende signalsøk under 2P-IVM. (A) skjematisk fremstilling av mikroskopet deteksjon filtrere oppsett og korresponderende kanaler. Dichroic speil på 560 nm skiller blå/grønn fra red/langt røde utslipp. Ekstra dichroic speil på 495 nm brukes til å gjenkjenne flere forskjellige underregionene av utslipp spektrum. Kanal 1 benytter en hybrid detektor (utslipp filter 475/50), mens kanal 2 bruker høy følsomhet GaAsP PMT (utslipp filter 525/50). (B) representant scatter dot tomter 2 P signaler viser gating strategien for generering av colocalization kanaler for identifikasjon av signalet fra CFP (Bi) og YFP (Bii) fluorophores. (Biii) Representant micrographs viser spesifikke signalene fra kanal 1 (lm 1, mørk blå), kanal 2 (Ch 2, grønn), co lokalisering kanal for CFP (lys blå), co lokalisering kanal for YFP (gul) og kombinasjonen av alle kanaler (lm 1 + lm 2 + CFP + YFP). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Intravital 4D imaging av nøytrofile og DC i en influensa infiserte luftrøret. (A) skjematisk oversikt over protokollen. (B) representant flyt cytometric scatterplot viser prosentandelen av nøytrofile med hensyn til totale CD45 + cellene i en celle suspensjon isolert fra murine benmarg med metoden Percoll gradient. (C) representant flyt cytometric scatterplots viser en økning i hyppigheten av nøytrofile i tracheas fra infisert mus sammenlignet med mus infisert med influensavirus på dag 3 PI (D) (venstre panel) anatomiske bilde av en Trouble luftrøret viser området valgt for bildeopptak. (Høyre panel) Representant 3D projeksjon av en 2P-IVM mikroskop-bilde viser overflaten gjenoppbygging av nøytrofile (lys blå) og DC (gul) sammen med sine spor på dag 3 p.i. SHG signal vises i mørk blå. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: karakterisering av nøytrofile og DC migrasjon og samhandling dynamikk i influensa infiserte luftrøret. Representant tomter viser spor hastigheten at (A), spore rett linje (B) og korrigert banen rett linje (C), som definert av Beltman og kolleger (2009)28, nøytrofile og FM i luftrøret på dag 3 p.i. med influensavirus. Korrigert banen rett linje målingen viser robusthet å spore feil. (D) 2D histogrammet viser frekvensen av nøytrofile deres antall kontakter med DC og mener kontakt varighet. (E) gjennomsnittsavstand på nøytrofile til den nærmeste DC i løpet av varigheten av filmen. (F) (til venstre) analyse av avstanden fra en representant nøytrofile til den nærmeste DC i tid. Stiplede røde linjen angir avstanden terskelen for å vurdere at en nøytrofile etablert en kontakt med en DC. (Høyre i-iii) Micrographs kjøpt på ulike tidspunkt representerer migrering av en nøytrofile (lys blå) mot en DC (gul). Cellen spor vises som en flerfarget linje som endrer farge fra blått til rødt representerer tid. SHG signalet fra fibrillary kollagen vises i mørk blå. Skala bar = 50 µm. I alle tallene er presenteres dataene representant for minst tre uavhengige eksperimenter. Resultatene er gitt som betyr ± SD. statistikk av Welch's test. NS p > 0,05; p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: nøytrofile og DC dynamikk i luftrøret under influensa infeksjon. 30 min time-lapse 3D bilde viser samhandling dynamikken mellom nøytrofile (lys blå) og DC (gul), i tillegg til sine respektive baner med hensyn til kollagen nettverket (mørkeblå) i luftrøret. Representant nøytrofile-DC interaksjoner er angitt med hvite piler. Cellen spor vises som en flerfarget linje som endrer farge fra blått til rødt representerer tid. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Movie 2: representant kortsiktige nøytrofile-DC samhandling i luftrøret under influensa infeksjon. 30 min time-lapse 3D-bildet viser en representant interaksjon mellom en nøytrofile (lys blå) og en DC (gul) og deres respektive baner. Cellen spor vises som en flerfarget linje som endrer farge fra blått til rødt representerer tid. SHG signalet fra kollagen vises i mørk blå. Skala bar = 10 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet gir en detaljert protokoll for generering av 4D-bilder viser overføringen av adoptively overførte nøytrofile og deres samspill med fm under en influensa infeksjon i musen luftrøret. Beskrevet 2P-IVM modell vil være relevant å studere immun celle dynamics under en infeksjon i luftveiene.
Nylig har flere modeller basert på visualisering av cellen dynamikk i luftveiene vært utviklet9,10,11,12,13,14,15 ,16. I vivo bildebehandling av lunge er imidlertid fortsatt utfordrende, vurderer anatomiske plasseringen av denne organ og tekniske problemer å minimere bevegelse under puste syklus30. For å overvinne disse problemene, har noen forfattere foreslått bruk av en spesialbygd sirkulær sugekraft kammer, som må settes kirurgisk i thorax13,14. Denne fremgangsmåten krever imidlertid en invasiv intervensjon som kunne kompromittere resultatene, spesielt i de studiene som har fokusert på etterforskningen av inflammatorisk respons. Videre presentere lunge kirurgisk modeller en begrensning for dype vev bildebehandling på grunn av den lette brytning stammer fra luften i alveoler17. Omvendt, ulike tracheal modeller har vært nylig ansatt å studere celle dynamikk i airway epitel. Bildebehandling i denne organ presenterer klare fordeler sammenlignet med lunge, som relativt enkel operasjonen må utsettes og nakkens orgel, i tillegg til den høyere tilgjengeligheten til tracheal epitel. Den foreslåtte tracheal modellen er også relevant å undersøke initiering av svaret mot airway patogener, som influensavirus, siden luftrøret er en av de første stedene i viral replikasjon i løpet av en influensa infeksjon8.
Interessant, utgitt en studie som viser et alternativ intubasjon-fri metode for imaging luftrøret har vært nylig12. Denne metoden er preget av en redusert betennelse og viser klare fordeler i studier der funksjonen mucociliarity i epitelceller må bevares. Men denne metoden garanterer ikke tilstrekkelig stabilitet og oppkjøpet av lysere signaler nødvendig å studere celle-celle kontakter i en rekke noen µm. derimot metoden i gjeldende protokollen gir bedre immobilisering av orgelet Takket være intubasjon, og tillater påvisning av sterkere fluorescens signaler som følge av den kortere avstanden mellom orgel og de dekkglassvæske12.
Oppnå vev immobilisering under i vivo 2 P-IVM bildeopptak er det viktigste trinnet å skape optimale data. Noen avgjørende tiltak som bidrar til stabiliteten i presentert metoden inkluderer: en passende musen anesthesia; en riktig musen intubasjon; og en kirurgisk redegjørelse av trachea som gir en enkel tilgang til orgelet av dekkglassvæske. I tillegg vil imaging riktig antall celler (ideelt 30 celler per synsfelt) styrke fått resultatene. Rekruttering av det optimale antallet celler avhenger i stor grad på virusinfeksjon dose, som er veldig mye påvirket av riktig administrasjon av viral inoculum.
Et kritisk steg av protokollen er den kirurgiske utstillingen av trachea. Ulike tiltak kan bli vedtatt for å minimere skadene til orgelet under operasjonen. For eksempel bør luftrøret ikke bli direkte berørt med kirurgiske verktøy. I stedet bør det bli utsatt ved å manipulere bare omkringliggende vev (hud, spyttkjertler og muskler). Om strengt nødvendig bør luftrøret håndteres med unsharpened elementer. I tillegg gjøres anstrengelser for å unngå blodkaret skade. Til slutt, for å hindre orgel dehydrering, det er også viktig å dekke det med PBS umiddelbart etter operasjonen.
Til tross for de unike fordelene ved denne metoden over metodene beskrevet tidligere for visualisering av immun celle interaksjoner i tracheal mucosa presenterer bruk av denne modellen noen begrensninger. Som beskrevet ovenfor, representere tilstedeværelse av betennelse forbundet med tracheal kirurgi en ulempe når studere immunreaksjoner. For å overkomme denne begrensningen, er det mulig å administrere inflammatoriske før oppstart av prosedyren. En annen begrensning av denne modellen er knyttet til tilstedeværelsen av en sterk autofluorescence signal i luftveiene, som er hovedsakelig bosatt cellene og Slim laget. Denne ikke-spesifikk fluorescens oppretter gjenstander som kan hindre analysen. Videre kan misvisende beregning av parameteren spor rett linje genereres når sammenligne celle spor med ulike varigheter og når sporingsfeil introdusere spor av kort varighet26. Du løser dette problemet, brukt vi en straff koeffisient for å korrigere banen rett linje. Slike korreksjon er ment å minimere virkningen av miss-sporing i resultater-28.
Et viktig aspekt ved 2P-IVM eksperimenter er muligheten til å bruke mus som har gjennomgått kirurgi og bildebehandling. Den i vivo imaging protokoll beskrevet her er ikke forlange dyr euthanasia eller organ samling, dermed forlate muligheten til å gjenopprette og bruke mus etter kirurgi for andre prosedyrer. Bruke et enkelt museklikk, for eksempel å utføre luftrøret bildebehandling på ulike tidspunkt poeng kan dramatisk redusere antall totale dyr nødvendig i et eksperiment, støtter dyr reduksjon prinsippet. Dessuten kan det også redusere Inter-individuelle variasjon. Imidlertid må dyr utvinning og gjenbruk følge dyrevelferd standarder som inkluderer administrasjonen av riktig smertestillende medisiner og antibiotika til dyrene under utvinning tid. Alle disse prosedyrene må dyr eksperimentering protokollen og godkjent av lokale veterinær myndighetene.
Beskrevet protokollen kan enkelt tilpasses til studiet av andre immun celletyper. Isolasjon og injeksjon (fluorescerende eller beiset) patogen-spesifikke T celler kan for eksempel brukes til å studere T celle aktivering dynamics31 samt deres samspill med andre celler som tracheal DC. På en lignende måte, kan visualisering av blodet eller lymfesystemet fartøy representere en interessant tilnærming til å studere rekruttering av inflammatoriske celler inn i tracheal vevet i løpet av infeksjon. Videre kan 2P-IVM av trachea også brukes for å studere dynamikken i immunforsvaret til andre luftbårne patogener. Bruk av transgene fluorescerende luftbårne patogener, som Streptococcus pneumoniae32, vil derfor skape nye muligheter til å studere deres interaksjon med immunsystemet. Selv om denne prosedyren fokuserer på å måle dynamikken i immunceller under infeksjon, kan den brukes også på ulike felt, inkludert kreft, astma, eller sår-tilheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Foundation (SNF) gir (176124, 145038 og 148183), den europeiske kommisjonen Marie Curie reintegrasjon Grant (612742) og SystemsX.ch for et stipend til D.U.P. (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
