Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.
Abstract
A análise da célula-célula ou célula-patógeno interação na vivo é uma ferramenta importante para compreender a dinâmica da resposta imune à infecção. Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) permite a observação das interações célula no tecido profundo em animais vivos, minimizando o fotobranqueamento gerado durante a aquisição de imagens. Até à data, têm sido descritos diferentes modelos para 2P-IVM dos órgãos linfoides e não linfoides. No entanto, a imagem de órgãos respiratórios permanece um desafio devido ao movimento associado com o ciclo de respiração do animal.
Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar na vivo celular imune interações na traqueia de camundongos infectados com o vírus da gripe usando 2P-IVM. Para este fim, nós desenvolvemos uma plataforma de imagem personalizada, que incluía a exposição cirúrgica e intubação da traqueia, seguida pela aquisição de imagens dinâmicas de neutrófilos e células dendríticas (DC) no epitélio da mucosa. Além disso, nós detalhados os passos necessários para realizar a gripe intranasal infecção e fluxo cytometric análise de células do sistema imunológico na traqueia. Finalmente, analisamos neutrófilos e motilidade DC, bem como suas interações no decurso de um filme. Este protocolo permite a geração de imagens de 4D estável e brilhante necessário para a avaliação de interações célula-célula na traqueia.
Introduction
Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) é uma técnica eficiente para tempo real de imagens de célula para célula interações que ocorrem em seu ambiente natural1. Uma das principais vantagens deste método é que permite o estudo de processos celulares em uma maior profundidade de amostra (500 µm a 1 mm) comparado com outros tradicionais de técnicas de imagem2. Ao mesmo tempo, o uso de dois fótons de baixa energia gerada pelo laser dois fotões minimiza o foto-dano no tecido normalmente associado com o processo de aquisição de imagem2. Durante a última década, 2P-IVM foi aplicada para estudar diferentes tipos de interações célula-célula em várias disciplinas,3,4,5. Estes estudos foram especialmente relevantes para investigar as células imunes, que caracterizam-se pelo seu elevado dinamismo e a formação de contatos proeminentes seguindo os sinais gerados por outras células e o meio ambiente. 2P-IVM foi também aplicada para estudar as interações entre patógeno e hospedeiro6. Com efeito, anteriormente mostrou que alguns patógenos podem alterar o tipo e a duração dos contatos entre células do sistema imunológico, dificultando, assim, a resposta imune7.
A mucosa das vias aéreas é o primeiro site no qual a resposta imune contra patógenos no ar é gerado por8. Portanto, na vivo análise das interações patógeno-hospedeiro, este tecido é fundamental entender a iniciação dos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a infecção. No entanto, 2P-IVM das vias aéreas é um desafio, principalmente devido os artefatos produzidos pelo ciclo de respiração do animal, que compromete o processo de aquisição de imagem. Recentemente, diferentes modelos cirúrgicos foram descritos para imagiologia murino traqueia9,10,11,12 e pulmões13,14,15, 16. 2P-IVM traqueal modelos representam um excelente set-up para visualizar a fase inicial da reação imune nas vias aéreas superiores, enquanto os alvéolos pulmonares 2P-IVM modelos são mais adequados para estudar a fase final das infecções. Os modelos de pulmão desenvolvidos apresentam uma limitação associada à presença de alvéolos cheios de ar, que restringir a penetração ótica do laser e fazer com que a camada da mucosa das vias aéreas intrapulmonares inacessíveis na vivo de imagem17 . Por outro lado, a estrutura da traqueia, formada por um epitélio contínuo, facilita a aquisição de imagens.
Aqui, apresentamos um protocolo que inclui uma descrição detalhada das etapas necessárias para realizar a infecção da gripe, preparação cirúrgica dos animais e 2P-IVM da traqueia. Além disso, descrevemos uma montagem experimental específica para a visualização de neutrófilos e células dendríticas (DC), dois tipos de células imunes que desempenham um papel importante como mediadores do mecanismo de defesa contra vírus de gripe18,19 . Finalmente, descrevemos um procedimento para analisar interações de neutrófilos-DC. Estes contactos foram mostrados para modular a ativação DC e, posteriormente, para afetar as respostas imunológicas contra patógenos20.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais envolvendo ratos foram realizados em conformidade com as orientações de veterinário Federal suíço e protocolos de animais foram aprovados pelas autoridades locais do veterinário.
1. gripe infecção de ratos CD11c-YFP
- Biossegurança
Nota: A cepa de rato adaptado da gripe H1N1 de Rico/8/34 A/Puerto (PR8) foi cultivada em ovos fertilizados, purificada e titulada como descrito anteriormente,21. Todos os passos que envolvem animais infectados ou amostras biológicas foram realizados sob uma armário de acordo com o nível de biossegurança (BSL) de biossegurança 2 condições.- Limpe o gabinete de segurança biológica com uma solução de etanol 70% antes e após o processo de infecção.
- Elimine todos os resíduos materiais produzidos durante este procedimento na sequência correcta que orientações de biossegurança (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Descarte de resíduos sólidos em tulhas autoclaváveis e líquidos contaminados em sacos de plástico preenchidos com solução de etanol a 70% ou desinfetante médico.
- Infecção intranasal de gripe
NOTA: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 sobre um fundo C57BL/6J foram utilizados neste estudo. Os ratos foram mantidos nas instalações específicas isentos de organismos patogénicos no Instituto de pesquisa em biomedicina.- Coloque um máximo de 5 ratos CD11c-YFP idade e sexo-correspondência (seis a oito semanas de idade) por gaiola. Espere pelo menos dois dias para aclimatação de ratos para condições de habitação, antes do processo de infecção.
- Degele o PR8 estoque e preparar a diluição correspondente usando frio 1x solução salina tampão de fosfato de Dulbecco modificada sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (PBS) para obter uma concentração final de 200 unidades formação de placa bacteriana (PFU) na diluição 30 µ l. manter vírus no gelo durante todo o processo.
Nota: titulação de cada lote de vírus de gripe antes de seu uso é recomendada para garantir uma dose precisa de infecção. - Injetar uma dose de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) intraperitonealmente (i.p.) utilizando uma seringa de 1 mL de agulha 26G.
- Espere até que o mouse é totalmente anestesiada (perda completa do braço endireitante e pedal reflexo de retirada). Anestesia profunda é necessária para uma infecção ideal, desde que os ratos não-totalmente anestesiados vão engolir ou expulsar o inóculo de vírus, levando a variações da dose de infecção.
- Coloque o mouse anestesiado em posição supina. Colete 15 µ l de inóculo de vírus. Coloque a ponta da pipeta perto da narina esquerda do mouse e dispense o inóculo viral gota a gota. Como gotas devem ser inaladas, não pipete-las diretamente dentro da cavidade do nariz.
- Espere 2 – 5 min e coloque a ponta da pipeta contendo os restantes 15 µ l de inóculo de vírus na narina direita.
Nota: Para evitar asfixia, dispense gotas de tamanho pequeno em intervalos de aproximadamente 20 s. - Verificar que o rato está respirando corretamente e colocá-lo em uma gaiola na lateral de decúbito. Monitorar a recuperação respiração e anestesia de rato (cerca de 60 min após a indução).
Nota: É possível infectar mais de 1 do mouse ao mesmo tempo. Neste caso, administrar o inóculo viral na narina esquerda de todos os ratos em uma sequência, esperar por 2 – 5 min e depois administrar o vírus na narina direita. Para evitar a variabilidade entre indivíduos, infectar ratos não mais que 3 ao mesmo tempo. - Monitorar a saúde animal estatuto e perda de peso diariamente.
- Eutanásia em ratos de acordo com o ponto de extremidade humano determinado pelas diretrizes da autoridade. O método de eutanásia tem que ser aprovado pelas autoridades de experimentação animal e deve respeitar as regras de éticas locais. Após as experiências de dois fotões, eutanásia em ratos pela administração de uma overdose de cetamina/xilazina seguida por deslocamento cervical. Em todas as outras experiências, use CO2 inalação como método de eutanásia.
Nota: Para medir a concentração viral da traqueia infectada, ensaio de dose infecciosa (TCID50) de cultura de tecido 50% ou reação em cadeia da polimerase em tempo real, ensaio (RT-PCR) pode ser realizado como descrito anteriormente,23.
- Avaliação do recrutamento de neutrófilos na traqueia por citometria de fluxo
Nota: Esta parte do protocolo é opcional. Destina-se a avaliar o recrutamento dos neutrófilos na mucosa traqueal após a infecção da gripe.- Eutanásia por inalação de CO2 em camundongos infectados e não infectados controle a pós-infecção do dia 3 (p.i.).
Nota: Para evitar danos traqueais, evite usar deslocamento cervical para eutanásia de animais. Além disso, perfusão de ratos sacrificados é aconselhável para evitar contaminação de neutrófilos do sangue. - Pulverize o pescoço de rato com solução de etanol a 70% e realizar uma incisão de pele usando uma tesoura cirúrgica do peito até o queixo.
- Separar as glândulas salivares usando fórceps e expor a traqueia.
- Disse os músculos ao redor da traqueia usando fórceps e a tesoura.
Nota: Esta etapa deve ser executada com cuidado desde a traqueia pode ser facilmente danificada durante o procedimento. - Segure a traqueia com a pinça e Retire cuidadosamente o esôfago por dissecação.
- Segurando a parte intratorácica da traqueia com fórceps, fazer uma incisão no início da árvore brônquica. Então retire a traqueia da laringe e remova cuidadosamente qualquer musculatura deixada.
- Coloque o órgão em um tubo de 1,5 mL contendo RPMI 1640 + médio HEPES (RPMI) no gelo.
- Preparar a mistura de enzimas para a digestão de traqueia, contendo 0,26 unidades/mL de colagenase (I e II) e 0,2 mg/mL de DNase I em RPMI.
- Lugar da traqueia dissecada em uma placa de 6 contendo 1 mL de mistura de enzimas.
- Corte o órgão em pequenos pedaços com a ajuda de pinças e tesouras. Manter a placa no gelo durante esta etapa.
- Incube a 37 ° C, durante 45 min. Durante este tempo, agite a placa cada 15 min.
- Pare a digestão enzimática, adicionando 1 mL de tampão de lavagem de FACS (2 mM EDTA e 2% inactivadas pelo calor filtro esterilizado fetal soro bovino (FBS)) em PBS.
- Resuspenda a solução com uma pipeta de 1 mL para ajudar para desassociar os não parcialmente digeridos pedaços de tecido.
- Transferi a solução para outro poço, passando o conteúdo através de um filtro de 40 µm. Em seguida, delicadamente esmagar as peças restantes do órgão prendido sobre o filtro usando um êmbolo de seringa de 2 mL.
Nota: Smashing não parcialmente digeridos pedaços da traqueia sobre o coador é um passo fundamental para obter um número ideal de células durante a análise do fluxo cytometric. - Lave o bem e o filtro com FACS lavagem buffer e transferência a suspensão em um tubo de 5 mL mantida no gelo.
- Centrifugar os tubos a 166 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l de tampão de lavagem FACS.
- Prossiga com o anticorpo da coloração da superfície por citometria de fluxo. Brevemente, bloquear receptores de Fc das células isoladas usando um anticorpo contra CD16/32, seguido de coloração da superfície. Para identificar corretamente os neutrófilos, o painel de citometria de fluxo deve conter os seguintes anticorpos: αLy6G, αCD11b, αCD45, bem como a viabilidade a tintura para excluir as células mortas.
- Executar todo o conteúdo das amostras em um citômetro de fluxo e analisar os dados.
- Para obter um número ideal de células do sistema imunológico, execute a suspensão única célula a uma velocidade não superior a 3.000 eventos/s. Isto irá reduzir o número de eventos excluídos durante a aquisição. Usando este protocolo, é possível obter 1 a 2 milhões de células por traqueia.
- Eutanásia por inalação de CO2 em camundongos infectados e não infectados controle a pós-infecção do dia 3 (p.i.).
2. isolamento e injeção de neutrófilos
Nota: no presente procedimento, B6.129 (ICR)-ratos Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J (CK6-ECFP) foram usados24. Estes animais expressam PCP em todos os tipos de células sob o promotor β-actina humana. Como alternativa, também é possível usar camundongos C57BL/6J para isolar as células e manchá-las de acordo com o protocolo descrito na etapa 2.6. A purificação e manipulação de neutrófilos podem aumentar seu status de ativação, potencialmente alterando suas propriedades migratórias e funcionais.
- Eutanásia do animal por inalação de CO2 .
- Remova ambos os fêmures e tíbias e delicadamente limpá-los usando fórceps.
- Cortar osso epífises e irrigue a medula óssea, utilizando uma seringa de 1 mL cheia de PBS estéril de frio, em um tubo de 50 mL, mantido no gelo.
- Ressuspender as células com uma agulha de 18 G e filtrar a suspensão de células com um filtro de 40 μm. Lave uma vez com PBS a 110 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as células em 2 mL de PBS frio.
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Diluir 100% Percoll 9:1 em 10 x de PBS e preparar soluções gradientes de percoll 72%, 64% e 52% usando 1X PBS. Camada cuidadosamente 2 mL de cada um dos três gradientes em um tubo de 15 mL, a partir de mais um concentrado.
- Adicione cuidadosamente 2 mL da suspensão de células de medula óssea no topo os gradientes e centrifugar a 1.100 x g durante 30 min à temperatura ambiente (RT) sem aceleração e freio.
- Retire a banda na interface entre 64% e 72% cuidadosamente e lavar uma vez a 200 x g por 5 min a 4 ° C com PBS frio. Ressuspender as células em um volume de 100 μL de PBS e mantê-los no gelo. A pureza dos neutrófilos deverá ser superior a 90%.
- Opcionalmente, os neutrófilos rótulo com um kit de proliferação de célula usando o protocolo do fabricante. Adicionar o corante para a suspensão de células para uma concentração final de 10 μM em um volume de 1 mL, incubar a 37 ° C por 30 min e lave (166 x g, 5 min).
- Estimar a concentração de células usando um hemocytometer e injetar por via intravenosa 5 x 106 células em um volume máximo de 100 μL nos ratos CD11c-YFP+ anteriormente infectados utilizando uma seringa de 1 mL agulha 26G, 12h antes de imagem.
3. preparar o Mouse para a imagem latente
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Anestesia
- ANESTHETIZE infectados ratos CD11c-YFP+ no dia 3 p.i. conforme item 1.2.3.
- Uma vez que os ratos são anestesiados profundamente, prepare um cateter para anestesia re-dosagem.
- Remova uma agulha 30 G de uma seringa, usando fórceps.
- Insira a agulha de um pedaço de 20 cm de tubo de silicone médico PE-10.
- Introduza uma seringa de agulha 30G preenchida com mistura de xilazina/cetamina, do outro lado do tubo.
- Retire o ar dentro do tubo.
- Prepare um cateter 20G ligado a um tubo de uma máquina de oxigênio insufflating manter ventilação automática (figura 1Aeu). Defini-la em uma relação de respiração de 130 batimentos por minuto (b.p.m.), com um volume tidal de 0,2 mL, usando uma fonte de gás de oxigênio de 100%.
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Preparar o mouse para a cirurgia
- Mantenha o mouse sobre um quadro de cirurgias personalizado específico (figura 1Aii-iii) sobre uma placa aquecida ou uma bancada cirúrgica aquecida definir a 37 ° C por todo o tempo da cirurgia.
- Raspar os pelos do pescoço do mouse usando um barbeador elétrico e um creme depilatório (figura 1Beu).
- Coloque o mouse por cima do plástico mouse posicional (figura 1Aii-a), mantendo a cabeça do animal fora o posicional (figura 1Bii) para criar um ângulo que facilita a intubação da traqueia.
- Corrigir as patas dianteiras, patas e cauda com fita cirúrgica, umedecer os olhos de rato com um gel de vitamina A enriquecido e desinfectar o pescoço de rato (figura 1Bii).
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Cirurgia
- Prepare corretamente autoclavados itens, ou seja, tesoura, tesoura microcirúrgica e fórceps.
- Realize uma pequena incisão no eixo longo medial do pescoço, aproximadamente 1 cm de comprimento, na área média entre a parte superior do tórax e a linha que passa pelo ponto mais baixo da mandíbula (figura 1Biii).
- Deslocar-se lateralmente as manchas na pele e as glândulas salivares e visualizar a traqueia, coberta pelos músculos. Em seguida, disse os músculos traqueais com cuidado, usando a pinça (figura 1Biii).
- Entubar o mouse com um cateter e iniciar ventilação artificial (figura 1Biv).
Nota: O cateter é composto por uma parte externa de plástico, que protege a mucosa traqueal e uma agulha de ferro interna. A presença da agulha representa a solução ideal para aumentar e estabilizar a traqueia e a regular a sua exposição. Ventilação artificial através do cateter garantirá a respiração adequada do mouse. - Inicie imediatamente a ventilação artificial para monitor mouse respirando.
- Fixe o cateter altura e orientação usando um gancho cirúrgico (figura 1Bv) conectado à haste do específica no quadro cirúrgico (figura 1Aii-b). Expor a traqueia à mesma altura do queixo.
- Circundam a traqueia com vaselina e cubra-o com algumas gotas de PBS pré-aquecido para garantir a hidratação adequada ao órgão (figura 1Bvi).
- Monte a lamela em cima da preparação. Para esta etapa, cola-se uma lamela sobre um suporte de metal (figura 1Bvii), que irá ser aparafusado ao Tradutor XYZ (figura 1A-c ii). Ajuste o tradutor XYZ para colocar a lamela em cima da preparação cirúrgica.
- Coloque o cateter para a administração da anestesia intraperitonealmente (figura 1Bviii).
- Injete 50% da dose inicial de cetamina/xilazina mistura cada 30 min.
Nota: Re-dosagem de 50% a 25% da mistura de xilazina/cetamina inicial é uma alternativa segura e válida25. No entanto, desde que este protocolo é terminal e uma estrita imobilização do animal é obrigatório durante todo o procedimento, use doses mais elevadas para manter um avião profundo cirúrgico da anestesia.
4. in Vivo Imaging lapso de tempo
Nota: A aquisição de imagens foi realizada com um microscópio de dois fotões ereto, equipado com dois lasers de Ti:Sa, incubadora com temperatura controlada e um 25 X / at 1.1 objectivo de imersão de água. As photomultipliers (PMT) usados para aquisição de imagens eram detectores de híbrido ou alta sensibilidade GaAsP.
- Coloque o quadro de cirurgias com o mouse anestesiado no interior da câmara de incubação do microscópio (pre-aquecida a 37 – 38 ° C) e adicionar uma gota de água no sentido do lamela.
- Centro e encontrar o foco sobre o tecido traqueal.
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Definir a frequência de varredura para 800 Hz, com 520 x 520 pixels, um campo de visão de 440 x 440 μm2 e linha média 1.
- Sintonia Ti:Sa laser 830 nm para excitar a geração segundo harmônica (SHG) do colágeno, com um poder indicativo na fonte de 150 mW. Sintonizar o segundo laser Ti:Sa em 920 nm com 94 mW na fonte, para excitar tanto PCP e YFP.
- Set-up o 3D e o modo de aquisição timelapse com excitação simultânea
Nota: Manter os poderes do laser mais baixo possível minimizar o fotobranqueamento e fototoxicidade.
- Registro fluorescência usando dois canais em modo não-descanned, com um espelho dicroico mestre em 560 nm. Na confi guração do usado neste protocolo, um segundo espelho dicroico dividir o sinal em 495 nm para separar o canal 1 (filtro de emissão 475/50), do canal 2 (filtro de emissão 525/50) (Figura 2A). Esta configuração recolhe SHG luz de colágeno no primeiro canal, enquanto a emissão de PCP é coletado em ambos os canais 1 e 2 e YFP é coletada somente no canal 2.
- Defina um intervalo 50 μm ao longo do eixo Z, com um tamanho de etapa 3 μm (voxel tamanho 0,86 μm x 3 μm). Registro de imagens a cada 30 s para uma duração total de 30 min.
- Se desejar, adquira várias regiões. Antes de executar mais aquisições, verificar sinais vitais e reinjeção anestesia através do cateter, se necessário (ver passo 3.3.10).
- No final do processo de geração de imagens, eutanásia o mouse através de sobredosagem de xilazina/cetamina seguido por deslocamento cervical.
5. análise quantitativa e processamento de neutrófilos-DC motilidade e interação da imagem
Nota: No presente protocolo, um software de imagem especializado foi usado para analisar os dados de microscopia.
- Depois de concluída a aquisição de imagens 4D, transferir os arquivos (dados e metadados) em uma estação de trabalho com suficientes recursos computacionais (sugeriu requisitos mínimos do sistema: 32 GB de RAM, CPU rápido solid-estado-drives, recente, dedicada GPU com base em um massivamente arquitetura paralela).
- Abra os arquivos no software de imagem.
- Reproduzir o vídeo e certifique-se que as células de interesse são claramente visíveis e que os artefatos de imagem estão ausentes.
Nota: para este fim, verifique se que tanto o movimento da amostra e a variação de brilho são suficientemente confinado. De facto, estes representam desafios para a análise automática de26. Se o movimento da amostra entre quadros adjacentes é excessivo, aplica um método de correção de deriva, usando por exemplo o canal SHG como uma referência fixa. Isso permite que a melhor medida, o movimento das células, em vez do movimento da amostra. Além disso, na presença de fundo brilhante ou detritos, pode as superfícies reconstruídas usando o volume como um parâmetro de seleção. - Gere um localização Co canal específicos para as células do PCP+ , a fim de separar o sinal entre o PCP e o colágeno (SHG). Para este fim, denotam um polígono associado (Figura 2Beu) que seleciona apenas os voxels tendo uma intensidade positiva tanto no canal verde e canal azul.
Nota: Este procedimento pode variar de acordo com o conjunto de filtro do microscópio e a coloração das células. Isso pode ser conseguido, selecionando apenas voxels com intensidade suficiente em canais de azul e o verde. Entre as ferramentas disponíveis, a funcionalidade de "coloc" pode ser usada para calcular automaticamente o canal colocalization com base no limiar de intensidade. Além disso, os métodos baseados em aprendizado de máquina podem ser usados para esta etapa com a supervisão de um especialista em27. - Detectar e localizar células PCP+ , usando a reconstrução automática de superfície e rastreamento (ferramenta de superfície) no canal de localização co apropriado.
Nota: Curadoria Manual de controle de eventuais erros e exclusão de faixas com uma duração inferior a um limite definido (isto é, 150 s) podem ser necessárias. - Gere um localização Co canal específicos para as células CD11c-YFP+ , a fim de separar os sinais da PCP e YFP. Para este fim, denotam um polígono associado (Figura 2Bii) que seleciona apenas os voxels tendo uma intensidade positiva no canal verde, mas fraca intensidade no canal azul.
Nota: representante micrografias mostrando os sinais do canal 1, canal 2, o canal de localização co para PCP, o canal de localização co para YFP e a combinação de todos os canais podem ser encontradas na Figura 2Biii. - Reconstruir a superfície das células CD11c-YFP+ e rastrear sua posição ao longo do tempo (ferramenta de superfície).
Nota: Correção Manual de rastreamento eventuais erros não é necessária para esta etapa. Com efeito, devido a complexa dinâmica espaço-temporal de DC, reconstruir sua superfície precisa de dados 2P-IVM é uma tarefa desafiadora que não pode ser alcançada com software de segmentação disponíveis. Entre as razões que tornam esta tarefa desafiadora, saliências finas e variações de brilho não permite o uso de certas técnicas de processamento de imagem, tais como filtros ou estática limiarização de suavização. Além disso, em uma rede de DC, é difícil separar células únicas com base apenas em sua aparência em dados 2P-IVM. Por estas razões, em vez de tentar uma segmentação precisa ajustando parâmetros do software, propomos reconstruir superfícies desajustado da DC. Então, lidar com os possíveis erros através de métricas robustas conforme descrito em 5,8. -
Medir a migração celular.
- Exporte as medidas clássicas de migração para PCP+ e células CD11c-YFP+ . Entre estes, a média de velocidade"faixa" indica a média velocidade migratória das células, enquanto a trilha"linearidade" indica a direção das células. Estas medidas podem ser exportadas como um arquivo de planilha do software da imagem latente.
- Os arquivos exportados planilha, calcular a retidão"faixa corrigido" (também referida como relação de confinamento corrigida) para PCP+ e células CD11c-YFP+ , que é definido como "faixa de linearidade" multiplicada pela raiz quadrada de "controlar a duração" dividido pela raiz quadrada da duração do vídeo. Esta medida é mais robusta do que a "faixa de linearidade" na presença de curto faixas28, provenientes por exemplo erros de rastreamento.
Nota: só vídeos do mesmo comprimento podem ser comparados com esta medida.
-
Interação célula de medida.
- Defina um contato entre uma célula de PCP+ e uma célula de CD11c-YFP+ se sua distância (mais próximo voxels) for menor ou igual do que um limite (ou seja, 2 μm).
Nota: Este limite deve ser suficientemente rigoroso para detectar um contato somente quando as células estão em estreita proximidade. No entanto, nós encorajamos para manter esse limite superior a 0, idealmente N vezes maior que o raio de voxel (N > 2), porque a suavização de borda pode fazer a reconstrução das células menores que o tamanho real da célula. - Conte o número e a duração dos contatos entre PCP+ e células CD11c-YFP+ . No software da imagem latente isso pode ser feito por exemplo, executando um "beijo e executar" plug in. Estas medidas podem ser exportadas como um arquivo de planilha na guia estatísticas.
- Defina um contato entre uma célula de PCP+ e uma célula de CD11c-YFP+ se sua distância (mais próximo voxels) for menor ou igual do que um limite (ou seja, 2 μm).
- Importar as medidas anteriormente computadas em um software estatístico, gerar as parcelas e executar testes estatísticos.
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Representative Results
Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para estudar na vivo a motilidade e as interações entre os neutrófilos e DC durante a infecção da gripe na traqueia murino (Figura 3A). Para esta finalidade, isolamos neutrófilos PCP+ (92% de pureza; Figura 3B) de CK6-ECFP ratos e nos enviaram transferindo-os para um rato de CD11c-YFP infectado com gripe. Depois disso, foram realizadas 2P-IVM da traqueia no dia 3 p.i. Neste ponto do tempo, observamos um claro recrutamento de neutrófilos na zona infectada, como demonstrado pela análise de fluxo cytometric (Figura 3). O protocolo de 2P-IVM requer o uso de um quadro de cirurgias específico e um fornecedor de oxigênio para roedores (figura 1A). Fornecimento de oxigênio através de uma cânula inserida na traqueia ajudou o animal a respirar, facilitou a exposição da traqueia e controla o movimento de órgão associado com a respiração (figura 1B). Após esta montagem experimental, adquirimos estável 4D imagens na vivo na traqueia infectada durante um período de 30 min (Figura 3D1 filme).
A análise das imagens adquiridas através de software especializado de imagem 4D permitiu medir a migração das células e para quantificar a dinâmica espaço-temporal de neutrófilos e DC. Em relação a motilidade celular, observamos diferenças significativas entre o movimento de DC e os neutrófilos recrutados, que mostrou uma velocidade significativamente mais rápida do que o último (Figura 4A). Este resultado confirma a natureza dinâmica dos neutrófilos, anteriormente descrita como altamente motile células capazes de migrar para uma fonte de quimiotático29. Em relação a direcionalidade, concluímos que morfologia complexa da DC gerou erros frequentes na célula de rastreamento, que por sua vez produziu faixas com diminuição da duração e maior variação do comportamento direcional medido (Figura 4B). Por esta razão, nós computado uma robusta métrica que é capaz de medir a direcionalidade Considerando a duração da faixa. Usando essa métrica, observamos uma diferença significativa na direcionalidade de neutrófilos vs DC (Figura 4).
Além disso, o cálculo da distância entre os neutrófilos e DC permitiu detectar e analisar seus contatos ao longo do tempo. Neste modelo experimental, observamos alguns neutrófilos que formaram o múltiplo-breves contatos com DC e outros que não formou qualquer contato durante o período de imagem (Figura 4). Além disso, o estudo da tendência média da distância entre os neutrófilos e DC ao longo do tempo permitiu-nos estudar o posicionamento global das células estudadas (Figura 4E), enquanto a investigação da tendência em células específicas permitidas caracterizar a comportamento de cada célula única (Figura 4Ffilme 2).
Figura 1: equipamentos e etapas para 2P-IVM da traqueia murino. (Ai) O sistema portátil anestesia animal responsável pela ventilação automatizado é ligado a uma bomba que fornece oxigênio para o rato. Vista frontal (todos) e vista lateral (Aiii) do Conselho cirúrgico sob medido, usado para o modelo traqueal. O Conselho é composto por uma fase de metal com um rato de plástico posicional (só um), uma haste para segurar uma pinça móvel (Aii-b) e uma multa sintonizável Tradutor XYZ (Aii-c). (B) etapas sequenciais do modelo cirúrgico traqueal: remoção de pelos (Bi) da área cirúrgica, (Bii) posicionamento do mouse anestesiado no quadro de cirurgias, (Biii) exposição cirúrgica da traqueia, (Biv ) intubação com um cateter com ventilação artificial, (Bv) fixação do cateter, (Bvi) adição de PBS para a traqueia exposta, (Bvii) montagem da lamela e (Bviii) colocação de um cateter com a anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: detecção do sinal fluorescente durante IVM-2P. (A) representação esquemática da detecção de microscópio filtro set-up e canais correspondentes. Espelho dicroico em 560 nm separa azul/verde de vermelhas vermelho/longe das emissões. Espelho dicroico adicional em 495 nm é usada para reconhecer mais as diferentes sub-regiões do espectro de emissão. Canal 1 emprega um detector híbrido (filtro de emissão 475/50), enquanto o canal 2 usos alta sensibilidade GaAsP PMT (filtro de emissão 525/50). (B) ponto de dispersão representativas parcelas de 2P sinais mostrando a estratégia associada para a geração dos canais colocalization para a identificação do sinal proveniente da PCP (Bi) e o fluorophores YFP (Bii). (Bill) Representante micrografias mostrando os sinais específicos do canal 1 (Ch 1, azul escuro), canal 2 (Ch 2, verde), o canal de localização co para PCP (azul claro), o canal de localização co para YFP (amarelo) e a combinação de todos os canais (Ch 1 + Ch 2 + PCP + YFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem latente Intravital 4D de neutrófilos e DC em uma traqueia de gripe infectada. (A) esboço esquemático do protocolo. (B) representativo fluxo cytometric gráfico de dispersão mostrando a porcentagem de neutrófilos em relação as células CD45 + totais em uma suspensão de células isoladas de murino medula óssea usando o método do gradiente de Percoll. (C) representativo fluxo cytometric scatterplots mostrando um aumento da frequência dos neutrófilos em tracheas de ratos não infectados, em comparação com camundongos infectados com o vírus da gripe a dia 3 p.i. (D) (painel esquerdo) anatômica a imagem de um murino traqueia mostrando a área selecionada para aquisição de imagens. (Painel direito) Representante de projeção 3D de uma micrografia 2P-IVM mostrando a reconstrução de superfície de neutrófilos (luz azul) e DC (amarelo) juntamente com suas faixas no dia 3 sinal SHG p.i. é mostrado no escuro azul. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: caracterização de neutrófilos e DC migração e interação dinâmica na traqueia gripe infectada. Parcelas representativas, mostrando a faixa de velocidade significa (A), faixa de linearidade (B) e corrigiu a faixa de linearidade (C), conforme definido pelo Beltman e colegas (2009)28, de neutrófilos e DC na traqueia na p.i. dia 3 com vírus da gripe. Medição de linearidade a faixa corrigida apresenta robustez para erros de rastreamento. (D) 2D histograma mostrando a frequência de neutrófilos de acordo com seu número de contatos com a DC e a duração média do contato. (E) a distância média dos neutrófilos para o controlador de domínio mais próximo durante a duração do filme. (F) (à esquerda) análise da distância de um representante dos neutrófilos para o DC mais próximo no tempo. A linha vermelha pontilhada indica o limite de distância para considerar que um neutrófilo estabelecido um contato com um controlador de domínio. (Direito de i-iii) Micrografias adquiridas nos pontos de tempo diferentes, representando a migração de um neutrófilo (luz azul) para um DC (amarelo). Faixas de célula são mostradas como uma linha multicolorida que muda de cor de azul para vermelho para representar o tempo. Sinal SHG de colágeno fibrilar é mostrado em azul escuro. Barra de escala = 50 µm. Em todas as figuras, os dados apresentados são representativos pelo menos três experimentos independentes. Resultados são apresentados como média ± SD. estatística pelo teste de Welch. NS p > 0.05; p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: neutrófilos e DC dinâmica na traqueia durante a infecção da gripe. imagem 3D lapso de tempo de 30 min que mostrando a dinâmica de interação entre os neutrófilos (luz azul) e DC (amarelo), bem como suas respectivas faixas com relação a rede de colágeno (azul escuro) da traqueia. Interações de neutrófilos-DC representante são indicadas pelas setas brancas. Faixas de célula são mostradas como uma linha multicolorida que muda de cor de azul para vermelho para representar o tempo. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Movie 2: representante interação de neutrófilos-DC a curto prazo na traqueia durante a infecção da gripe. 30 min de lapso de tempo imagem 3D mostrando uma representante interação entre um neutrófilo (luz azul) e um DC (amarelo) e suas respectivas faixas. Faixas de célula são mostradas como uma linha multicolorida que muda de cor de azul para vermelho para representar o tempo. Sinal SHG de colágeno é mostrado em azul escuro. Barra de escala = 10 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a geração de imagens de 4D, mostrando a migração de neutrófilos enviaram transferidos e suas interações com DC durante uma infecção de gripe na traqueia do mouse. O modelo descrito 2P-IVM será relevante para estudar a dinâmica de células imunes durante uma infecção nas vias aéreas.
Recentemente, vários modelos com base na visualização da dinâmica celular das vias aéreas têm sido desenvolvidos9,10,11,12,13,14,15 ,16. No entanto, na vivo por imagens do pulmão é ainda um desafio, considerando a posição anatômica deste órgão e as dificuldades técnicas para minimizar o movimento durante o ciclo de respiração30. Para superar estes problemas, alguns autores têm proposto o uso de uma câmara de sucção circular custom-built, que precisa ser inserido cirurgicamente no tórax13,14. No entanto, este procedimento requer uma intervenção invasiva que pode comprometer os resultados, especialmente naqueles estudos que focaram a investigação da resposta inflamatória. Além disso, modelos cirúrgicos pulmonares apresentam uma limitação para a imagem latente de tecido profundo devido à refração de luz foi originada pelo ar nos alvéolos17. Por outro lado, diferentes modelos traqueais têm sido recentemente empregados para estudar a dinâmica de células no epitélio das vias respiratórias. Imagens deste órgão apresenta vantagens claras em relação ao pulmão, tais como a cirurgia relativamente simples, necessária para expor e imobilizar o órgão, bem como a maior acessibilidade para o epitélio traqueal. O modelo proposto traqueal também é relevante para investigar a iniciação da resposta contra patógenos das vias respiratórias, tais como o vírus da gripe, já que a traqueia é um dos primeiros sites de replicação viral no decurso de uma infecção de gripe8.
Curiosamente, um estudo mostrando uma alternativa livre de intubação método de imagem a traqueia foi recentemente publicado12. Este método é caracterizado por uma diminuição da inflamação e mostra vantagens claras em estudos onde a função de mucociliarity das pilhas epithelial precisa ser preservados. No entanto, esse método não garante estabilidade suficiente e a aquisição de mais brilhantes sinais necessários para estudar os contatos do celular em um intervalo de alguns µm. por outro lado, o método apresentado no protocolo atual fornece melhor imobilização do órgão Obrigado para a intubação e permite a detecção de sinais de fluorescência mais fortes devido a distância mais curta entre o órgão e a lamela de12.
Realizar imobilização de tecido durante a aquisição de imagens em vivo 2P-IVM é o passo mais crítico para gerar dados ideais. Algumas medidas cruciais que contribuem para a estabilidade do método apresentado incluem: uma anestesia adequada do mouse; uma intubação correta do mouse; e uma exposição cirúrgica da traqueia que permite um acesso fácil ao órgão por lamela. Além disso, o número certo de células (idealmente 30 células por campo de visão) de imagem irá fortalecer os resultados obtidos. O recrutamento do número ideal de células dependerá em grande medida da dose de infecção viral, que é muito influenciada pela administração adequada do inóculo viral.
Outro passo crítico do protocolo é a exposição cirúrgica da traqueia. Podem ser adoptadas medidas diferentes para minimizar os danos causados ao órgão durante a cirurgia. Por exemplo, a traqueia não deve ser diretamente tocada com instrumentos cirúrgicos. Em vez disso, ele deve ser exposto pela manipular somente os tecidos circundantes (músculos, glândulas salivares e pele). Se estritamente necessário, a traqueia deve ser manipulada usando unsharpened itens. Além disso, os esforços devem ser feitos para evitar danos dos vasos sanguíneos. Finalmente, para evitar a desidratação do órgão, também é importante para cobri-lo com PBS imediatamente após a cirurgia.
Apesar das vantagens únicas deste método sobre os métodos anteriormente descritos para a visualização das interações célula imune na mucosa traqueal, o uso deste modelo apresenta algumas limitações. Conforme descrito acima, a presença de inflamação associada a cirurgia traqueal pode representar uma desvantagem quando estudar respostas imunes. Para contornar essa limitação, é possível administrar drogas anti-inflammatory, antes do início do procedimento. Outra limitação deste modelo está relacionada com a presença de um sinal forte de autofluorescência existentes nas vias aéreas, principalmente gerado pelas células residentes e a camada de muco. Esta fluorescência específico cria artefatos que podem dificultar a análise. Além disso, enganoso cálculo do parâmetro faixa de linearidade pode ser gerado quando comparando célula faixas de diferentes durações e quando erros de rastreamento introduzir faixas de curta duração26. Para superar este problema, foi aplicado um coeficiente de penalidade para corrigir a faixa de linearidade. Essa correção destina-se a minimizar o efeito de menina-rastreamento em resultados28.
Um aspecto crucial dos experimentos 2P-IVM é a possibilidade de re-uso de ratos que foram submetidos a cirurgia e a imagem latente. O na vivo de imagem protocolo descrito aqui não requer animal coleção eutanásia ou órgão, deixando assim a possibilidade de recuperar e re-uso de ratos após a cirurgia para outros procedimentos. Usando um único rato, por exemplo, para executar a imagem latente de traqueia em horários diferentes pontos dramaticamente poderiam diminuir o número de animais totais necessária em um experimento, apoiando o princípio de redução de animais . Além disso, ele também poderia reduzir variabilidade inter-individual. No entanto, reutilização e recuperação animal devem seguir as normas de bem-estar animal que inclui a administração de drogas analgésicas adequadas e antibióticos para os animais durante o tempo de recuperação. Todos esses procedimentos devem ser incluídos no protocolo de experimentação animal e aprovados pelas autoridades locais do veterinário.
O protocolo descrito pode ser facilmente adaptado para o estudo de outros tipos de células imunes. Por exemplo, isolamento e injeção de pilhas de T de patógeno específico (fluorescentes ou manchadas) podem ser usados para o estudo de dinâmica de ativação de célula T31 , bem como sua interação com outras células tais como DC traqueal. De forma semelhante, a visualização de sangue ou vasos linfáticos poderia representar uma abordagem interessante para estudar o recrutamento de células inflamatórias no tecido traqueal durante o curso da infecção. Além disso, 2P-IVM da traqueia também poderia ser aplicado para estudar a dinâmica da resposta imune a outros patógenos no ar. Portanto, o uso de transgênicos fluorescentes no ar agentes patogénicos, tais como Streptococcus pneumoniae32, criará novas oportunidades para estudar suas interações com o sistema imunológico. Embora este procedimento centra-se na medição da dinâmica de células do sistema imune durante a infecção, ele poderia ser também aplicado para campos diferentes, incluindo câncer, asma, ou cicatrização de feridas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional Suíço (SNF) (176124, 145038 e 148183), o Europeu Comissão Marie Curie reintegração Grant (612742) e o SystemsX.ch de uma subvenção para D.U.P (2013/124).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20 °C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20 °C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20 °C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
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