Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للعيش-التصوير المسمى فلوريسسينتلي شظايا بطانة الرحم البشرية المطعمة في الفئران. يسمح الأسلوب دراسة آثار المخدرات الاختيار على حجم الآفة اندوميتريوتيك من خلال الرصد والقياس الكمي للأسفار التي تنبعث من المراسل الفلورسنت في الوقت الحقيقي
Abstract
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نموذج مغايرة الماوس التي يمكن تقييم تطور بطانة الرحم في الوقت الحقيقي من خلال رصد موسع للأسفار التي تنبعث من مزروع الأنسجة بطانة الرحم البشرية خارج الرحم. ولهذا الغرض، يتم الحصول على خزعات من بطانة الرحم البشرية من المانحين التبرع البويضيه الجارية المرأة. شظايا بطانة الرحم البشرية تستزرع حضور غدية هندسيا لكدنا صريحة مشري بروتين فلوري مراسل. على التصور، ويسمى الأنسجة بمعدل أمثل للأسفار بعد الإصابة في وقت لاحق المختارة لغرس في الفئران المستفيدة. أسبوع واحد قبل جراحة زرع، هي أووفوريكتوميزيد الفئران المستفيدة، والكريات استراديول توضع تحت الجلد للحفاظ على بقاء ونمو الآفات. اليوم لعملية جراحية الفئران تجويف تخديره، والبريتوني الوصول إليها من خلال شق صغيرة (1.5 سم) لينيا-ألبا. يزرع المسمى فلوريسسينتلي تويزيد، بإيجاز غارقة في الغراء وتعلق على طبقة البريتوني. يتم خياطة الشقوق، وترك الحيوانات لاسترداد لبضعة أيام. ويرصد fluorescence المنبعثة من يزرع اندوميتريوتيك عادة غير-إينفاسيفيلي كل 3 أيام لمدة 4 أسابيع مع نظام تصوير في الحية. ويمكن تقدير الاختلافات في الحجم من يزرع اندوميتريوتيك في الوقت الحقيقي بالتحديد الكمي للإشارات مشري والتطبيع ضد الزمن-النقطة الأولى تبين كثافة fluorescence القصوى.
القوارض السريرية التقليدية لنماذج من بطانة الرحم عدم السماح برصد غير الغازية للآفة في الوقت الحقيقي ولكن بدلاً من ذلك السماح بتقييم لآثار المخدرات جزيئي عند نقطة النهاية. هذا البروتوكول يسمح أحد لتتبع الآفات في الوقت الحقيقي، وهو أكثر فائدة لاستكشاف إمكانات العلاج من المخدرات في نماذج السريري لالتهاب بطانة الرحم. القيد الرئيسي للنموذج وهكذا ولدت أن الرصد غير الغازية من غير الممكن على مدى فترات طويلة من الوقت بسبب التعبير ابيسومال من الفيروسات الإعلانية.
Introduction
بطانة الرحم اضطراب الجهاز التناسلي للمرأة مزمنة بدأت بغرس الوظيفية بطانة الرحم خارج تجويف الرحم. تنمو الآفات حمل خارج الرحم والحث على التهابات العمليات المؤدية إلى المزمنة الألم والعقم الحوض1. ومن المقدر أن يصل إلى 10-15% نساء في سن الإنجاب تتأثر endometriosis2، وأنها موجودة في حوالي 40-50% من النساء المصابات بالعقم3. العلاجات الدوائية الحالية لبطانة الرحم غير قادر على القضاء التام على آفات ولا يخلو من الآثار الجانبية4،5. يتطلب البحث عن علاجات أكثر فعالية لتحسين النماذج الحيوانية الموجودة في بطانة الرحم بطريقة يمكن أن تحاكي آفات البشرية على نحو ملائم، ويمكن تقييم آثار المركبات على حجم الآفة بين أمور أخرى عن كثب.
وقد استخدمت نماذج الرئيسيات لتقليد بطانة الرحم بترسيخ آفات حمل خارج الرحم الأشيع متطابقة وفي مواقع مماثلة كما هو الحال في البشر6،،من78؛ ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية وارتفاع التكاليف الاقتصادية المتصلة بالتجريب مع حد الرئيسات استخدام9. ونتيجة لذلك، لا يزال استخدام الحيوانات الصغيرة، ولا سيما من القوارض، لتنفيذ نماذج فيفو من بطانة الرحم تكون يفضل أنها تتيح دراسات مع عدد أكبر من الأفراد10،11. بطانة الرحم يمكن أن يتسبب في هذه الحيوانات بزرع قطعة من القوارض ابواق الرحم ("نماذج مثلى")،من1213 أو أنسجة بطانة الرحم/اندوميتريوتيك البشرية إلى مواقع خارج الرحم (نماذج مغايرة)14 . وعلى النقيض من البشر، القوارض لا تسلط على أنسجة بطانة الرحم ومما بطانة الرحم يمكن عدم وضع تلقائياً في هذه الأنواع. ولذلك، الماوس مثلى نماذج من بطانة الرحم قد تعرض للانتقاد يرجع ذلك إلى حقيقة أن زرع أنسجة الرحم الماوس حمل خارج الرحم لا تعكس خصائص الآفات اندوميتريوتيك البشرية15.
يمكن أن تحاكي المناسبة فسيولوجيا بطانة الرحم في نماذج مغايرة لبطانة الرحم حيث يتم زرع شظايا بطانة الرحم البشرية الطازجة في الحيوانات العوز. في نماذج مغايرة التقليدية، يتم عادة تقييم الآثار العلاجية من المركبات ذات الأهمية عند نقطة النهاية بتقييم حجم الآفة باستخدام الفرجار16. حد واضح، على هذا النحو، نماذج حيوانية نقطة النهاية لا تسمح دراسة ديناميات غرس أو تطور الآفة اندوميتريوتيك على مر الزمن. قيداً إضافيا أن لا تسمح باستخدام الفرجار القياسات الدقيقة لحجم الآفة. وفي الواقع، الخطأ القياسي تقدمها الفرجار في نفس النطاق (أي، ملليمتر) كحجم الآفات مزروع في الفئران، مما يحد من قدرة هذه الأدوات للكشف عن التغيرات الفعلية في الحجم.
وللتغلب على هذه القيود، هنا، يصف لنا توليد نموذج الماوس مغايرة لبطانة الرحم التي تم تصميم مزروع الأنسجة البشرية للتعبير عن كرز م مراسل بروتين فلوري. يمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت مع نظام صورة مناسبة غير الغازية رصد حالة الآفة مع الكمي المتزامن لحجمه في الوقت الحقيقي. وهكذا، لدينا نموذج يوفر مزايا واضحة عند مقارنة النماذج التقليدية نقطة النهاية كما أنه يجلب الفرصة للرصد في الوقت الحقيقي غير الغازية وإمكانية أداء أكثر موضوعية وتقدير دقيق للتغيرات في حجم الآفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر استخدام عينات الأنسجة البشرية المؤسسية استعراض المجلس ولجنة الأخلاقيات للمستشفى الجامعي La Fe. وقدمت جميع المرضى الموافقة الخطية. تمت الموافقة على الدراسة التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية" في مركز بحوث وبرينسيبي فيليبي دي فالنسيا، وأجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية والاستخدام للثدييات من "المعاهد الوطنية" الصحة.
1-جمع الأنسجة بطانة الرحم ومعالجة مسبقة
- الحصول على خزعة ذات نوعية جيدة للبشرية أسبيراتي بطانة الرحم باستخدام قنية المرفقة بجهاز شفط. صب الخزعة قارورة تحتوي على 10 مل من عقيمة المالحة ويغسل مع الانفعالات دليل لطيف.
ملاحظة: الإجراءات المتعلقة بكيفية الحصول على نوعية جيدة خزعات تم وصفه سابقا17. - أغسل الخزعة من أي دم أو مخاط المتبقية. كرر العملية بصب الأنسجة بقوارير تحتوي على المحلول الملحي الطازجة قواديس العديد من كما هو مطلوب حتى الأنسجة ويلاحظ نظيفة.
- إتمام نقل خزعة شظايا مع مظهر صحي في محلول يحتوي على 10 مل من المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% محلول مضاد حيوي فطري.
- من أجل المحتوى في 10 سم طبق بيتري والشروع في ختم الأنسجة إلى 5 – 10 مم3 قطع مع زوج من المشارط.
2-أدينوفيرال تعداء من شظايا بطانة الرحم
ملاحظة: وينبغي إدخال جميع المواد التي تنوي استخدامها في العملية في غطاء محرك السيارة مقدما. أن كل ما يجري لا لاستخدامها في العملية ومكان قارورة مع التبييض. يجب تطهير جميع المواد التي تأتي في اتصال مع ناقل أدينوفيرال مع المبيض قبل تجاهل ذلك في حاويات واقية.
- بمجرد قد تم مقطعة الخزعة، تأخذ طبق بيتري جديد. "الماصة؛" متعددة 30-50 ميليلتر دميم قطرات من الانتشار في جميع أنحاء الطبق كله. ترك مساحة كافية بين قطرات حتى لا يأتون إلى جهة الاتصال.
- ساعد بإبرة تعلق بحقنه، ضع قطعة واحدة من جزء داخل كل من قطرات المتوسطة.
ملاحظة: يجب أن تحتوي كل قطره على قطعة واحدة من بطانة الرحم. - إعداد الحل العامل مشري الإعلانية بتمييع 01:20 الحل الأسهم أدينوفيرال مشري [1 × 1010 بفو/مل]) إلى دميم المتوسط دون المضادات الحيوية (دميم + 10% تصفية FBS).
- الاستغناء عن 100-200 ميكروليتر من الحل مشري الإعلانية الواحدة جيدا على لوحة 96، حسنا، شغل العديد من الآبار كالشظايا التي تتوفر في قطرات طبق بتري (الخطوة 2، 2). وباﻹضافة إلى ذلك، ملء الآبار على الأقل 3 مع إتش الحرة دميم المتوسطة كعنصر سلبي.
- وساعد بإبرة تعلق المحاقن، ونقل كل من الشظايا في طبق بتري (الخطوة 2، 2) إلى كل من الآبار التي تحتوي على حل مشري الإعلانية في لوحة 96-جيدا.
- مكان البئر 96-لوحة تحتوي على شظايا بطانة الرحم مع حل مشري الإعلانية في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ح 16.
- أغسل بها غدية المتبقية في الأجل المتوسط بنقل الأنسجة في لوحة 96-بئر جديدة مليئة بالكامل دميم المتوسطة (مع المضادات الحيوية-أنتيميكوتيكس، خالية من إتش) واحتضانها ل 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 24-48.
ملاحظة: تذكر لتغطية مع التبييض جميع لوحات جيدا والنصائح التي جاءت على اتصال بالفيروس الإعلانية قبل تجاهل في الحاوية واقية. - إخراج اللوحة من الحاضنة ووضعه تحت مجهر الأسفار في 568 نانومتر (القناة الحمراء) لاختبار لوسم الأمثل.
- اختر الشظايا أبرع ووضعها في لوحة 96-بئر جديدة مع الطازجة المتوسطة دميم كاملة (مع المضادات الحيوية-أنتيميكوتيكس، خالية من إتش).
- ختم اللوحة جيدا مع فيلم بارافين بلاستيك ونقله إلى إلى منطقة خالية من مسببات الأمراض خاصة بالحيوان لغرس شظايا بطانة الرحم في الحيوانات المتلقية.
3-توليد نموذج الماوس بطانة الرحم
ملاحظة: استخدم الأسبوع 6-8-القديمة athymic عارية (أو سلالات المناعة مماثلة) الفئران الإناث يسكنون في ظروف محددة الممرض – مجاناً، كالحيوانات المتلقية. لتجنب الهرمونية دورة تعتمد على الاختلافات، وفي نفس الوقت الوقود الآفة النمو مع استراديول، الحيوانات إطلاق سراح 60 يوما ovariectomized ويوضع مع كبسولات تحتوي على 18 ملغ من 17 βeta-استراديول (17β-E2). الموضع أووفوريكتومي وبيليه قد يتعين القيام بها على الأقل أسبوع واحد قبل تطعيم شظايا بطانة الرحم في الحيوانات المتلقية.
-
أووفوريكتومي
ملاحظة: إعداد مواد التعقيم الجراحي في غطاء محرك السيارة. إعداد معدات التخدير ومنطقة إنعاش بعد جراحة جاهزة في نفس الغرفة.- القيام حقن تحت الجلد من مشتقات المورفين بجرعة 5 ملغ/كغ كل الماوس. واسمحوا الفئران بقية مدة 30 دقيقة بعد الحقن حيث كالمسكنات يمكن أن تتجلى آثار المخدرات.
- قم بتوصيل استنشاق التخدير المعدات والسماح للأكسجين و isoflurane (2% مغ/كغ) تدفق لمدة دقائق قليلة في دائرة تخدير مختومة.
- إدخال الحيوان في غرفة التخدير إيسوفلوراني. الانتظار لمدة 3-5 دقيقة والتحقق من أن الحيوانات هي تخديره تماما عن طريق الضغط على واحد من الكفوف. نقل الحيوانات إلى منطقة الجراحة والمحافظة على التخدير عن طريق وضع قناع مع استمرار تدفق الغاز isoflurane تغطي الخطوط الجوية الجهاز التنفسي.
- بعد تطهير المنطقة مع تشلوروهيكسيديني، تنفيذ شق الساحلي عرضية 0.5 سم تقريبا في ذروة الفخذ مع مقص حاد.
- فصل الجلد عن العضلات للحصول على الوصول إلى تجويف البطن وتحديد لوحة الدهون البيضاء التي تحيط بالمبيض وسحب المبيض مع ملقط تشريح.
- قرانهما حول قناة مع خياطة قابلة للامتصاص وتشديد عليه لضمان الأرقاء المناسبة قبل استئصال المبيض.
- طبقة العضلات مع خياطة الامتصاص 6-0، ثم أغلق والجلد بخياطة غير الامتصاص 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
- كرر الإجراء إزالة المبيض الجانبي كونترا.
-
استراديول بيليه الزرع
ملاحظة: العناية بأن الحيوان يتم تخديره أثناء الجراحة oophorectomy مكان الكريات عند تلك النقطة.- فورا بعد انتهاء الإجراء أووفوريكتومي، تنظيف الجلد بمحلول مطهر المحيطة بالرقبة وجعل شق عرضية صغيرة تحت الجلد (0.5 سم) مع مقص حاد في مؤخر العنق.
- استخدام المقص لتشريح الجلد من العضلات، مما يجعل جيب كبيرة بما يكفي للسماح بوضع الكريات.
- إدراج بيليه الذي يحتوي على 18 ملغ 17β ه2 وخياطة الجلد بخياطة غير امتصاص 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
- وضع الحيوان في منطقة الإنعاش وإدارتها جرعة المثالية للتسكين طويلة الأمد لتخفيف فترة الاسترداد.
-
جراحة زرع بطانة الرحم
ملاحظة: السماح على الأقل فترة الحجر الصحي سبعة أيام للسماح باسترداد كامل للحيوانات بعد أووفوريكتومي قبل البدء في جراحة زرع جزء بطانة الرحم. للتزامن الأمثل مع وضع العلامات للأنسجة، جمع الخزعة قبل جراحة زرع تفاديا لثقافة طويلة الأجل من اكسبلانتس 2 – 3 أيام.- الاستعداد في غرفة العمليات الجراحية في المنطقة الحرة الممرض محددة مسبقاً. إعداد هود مع جميع المواد الجراحية المطلوبة، معدات التخدير ومنطقة الإنعاش بعد الجراحة أيضا.
- جلب الحيوانات إلى الغرفة، والقيام حقن تحت الجلد مشتقات المورفين بجرعة 5 (مغ/كغ) في كل الماوس. واسمحوا الفئران بقية مدة 30 دقيقة بعد الحقن حيث يمكن أن تتجلى آثار المسكنات من المخدرات.
- قم بتوصيل استنشاق التخدير المعدات والسماح للأكسجين و isoflurane (2% مغ/كغ) تدفق لمدة دقائق قليلة في دائرة تخدير مختومة.
- قبل البدء بعملية جراحية، نقل اللوحة التي تحتوي على فلوريسسينتلي المسمى شظايا (من الخطوة 2، 10) في هود، فتح عليه وصب الشظايا في طبق بتري لتسهيل التعامل.
- إدخال الحيوان في غرفة التخدير إيسوفلوراني. الانتظار لمدة 3-5 دقيقة والتحقق من أن الحيوانات هي تخديره تماما عن طريق الضغط على واحد من الكفوف. نقل الحيوانات إلى منطقة الجراحة والمحافظة على التخدير عن طريق وضع قناع مع استمرار تدفق الغاز isoflurane تغطي الخطوط الجوية الجهاز التنفسي.
- مواجهة مكان الحيوان أنيسثيتيزيد. تطهير منطقة البطني. إجراء شق طولي 1.5 سم في البطن مع مقص حاد وفصل الجلد عن العضلات. ثم، تنفيذ شق طولي 1.5 سم في العضلات الوصول إلى التجويف الصفاقى.
- اضغط الحافة اليسرى من جدار البطن العضلات مع ملقط صغير وإضعاف فإنه محاولة لكشف الوجه الداخلي للصفاق في الخارج.
- تأخذ زرع بطانة الرحم مع ملاقط مصغرة ونقع عليه بإيجاز في مادة لاصقة cyanoacrylate ن-بوتيل-إستر ووضعه للصفاق حيث أنها سوف أتعلق. اتركها تجف لبضع ثوان. كرر الخطوتين 3.3.6 و 3.3.7 مكان زرع على الجانب كونترالاتيرال من الصفاق.
- طبقة العضلات مع خياطة الامتصاص 6-0، ثم أغلق والجلد مع عدم الامتصاص خياطة 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
- ضع الحيوان في منطقة الإنعاش وإدارتها جرعة مثلى من التسكين طويلة الأمد.
4-في مجال التصوير الفلورسنت فيفو مع فيفو في نظام التصوير
- قم بتشغيل الجهاز نظام التصوير المجراة في تهيئة البرنامج وتسمح الكاميرا CCD لتبرد لبضع دقائق.
- إعداد معدات التخدير استنشاق. فتح تدفق isoflurane % 2 لزوجين من دقيقة لملء قاعة مخدر. تعد منطقة الانتعاش بعد التخدير.
- متى بدأ البرنامج ويكون تبريده الكاميرا CCD، انقر فوق الأداة معالج التصوير : يبدأ البرنامج تعليمي مع سلسلة من windows على التوالي عرض، كل واحدة تناظر معلمة للفائدة مع عدة خيارات متاحة لاختيار بواسطة النقر فوق في المربع المقابل. المضي قدما من خلال البرنامج التعليمي عن طريق تحديد المربعات المناسبة في كل نافذة وانقر فوق الزر موافق للانتقال إلى المجموعة التالية من المعلمات بالتسلسل التالي.
- حدد خانة ابيلومينيسسينسي للمعلمة الأسفار، حدد مربع مشري المعلمة أزواج عامل التصفية. تصوير الوضع و التركيز تأكيد خانات الاختيار وحدد المربع التلقائي للمعلمة التعرض.
- بمجرد إعداد الصك، نقل الحيوان واحدة داخل غرفة التخدير. عند تخديره تماما، نقل الحيوانات داخل في فيفو التصوير قفص النظام ووضعه الجانب حتى مع رئيسها داخل أنبوب متصل بجهاز التخدير. إغلاق الغطاء وانقر فوق الحصول على الرصد.
- الحصول على الصور التي تظهر (ما مجموعة خمس صور، صورة واحدة لكل زوج من عوامل التصفية المحددة) وحفظ البيانات بالنقر فوق الزر حفظ باسم . حرك الماوس إلى المنطقة للانتعاش بعد التخدير. كرر هذه العملية مع الحيوانات المتبقية.
- كرر رصد اثنين أو ثلاث مرات في أسبوع لمتابعة الإشارات على نحو مناسب أثناء الوقت.
- المضي قدما للتضحية بالحيوان في نهاية الدورة الزمنية CO2 خنقاً ب.
5-التقدير الكمي للصور Fluorescence في فيفو
-
الفصل بين الأسفار الفعلية عن طريق اتقانا الصورة:
- فتح في فيفو التصوير التحليل إلى جانب البرنامج.
- اختر الملف "سيكوينسينفو" لبدء التحليل. ستظهر windows اثنين: "عرض التسلسل" و "لوح ألوان أداة". اختر لوح ألوان أداة ومتى تم عرض القائمة، حدد الخيارات التالية.
- حدد تصحيحات وانقر على مربع الطرح الخلفية فلوريدا التكيفية لإزالة الإشارات الفلورية غير مرغوب فيه من بيانات الصورة الإنارة. اختر عتبة أكبر قدر من الاهتمام، وانقر فوق تعيين.
- انقر فوق الطيفية أونميكسينجوحدد الأطوال موجية الفائدة، الأسلوب الذي تم اختياره اتقانا (مكتبة، المصحوبة بمرشدين، التلقائي أو اليدوي) ثم انقر فوق بدء تشغيل أونميكس.
- حدد الصورة أونميكسيد المقابلة لإشارة مشري، وانقر نقراً مزدوجاً فوق. سوف تظهر نافذة جديدة مع الصورة النهائية للإشارة الواردة من المصلحة.
- كرر الخطوة 5.1.3.
- اختياري: إذا كانت هناك حاجة إلى صورة تمثيلية (JPEG) بنتيجة أونميكس، اختر الإعدادات المطلوبة في "لوح ألوان أداة" | صورة ضبط (لون الجدول، binning، على النقيض، إلخ.)، ثم انقر فوق تصدير رسومات في إطار أونميكس تصدير طريقة عرض الصورة الحالية كصورة.
- احفظ الملف غير مخلوط: الملف | حفظ باسم | اختر مجلد و موافق.
- كرر هذه العملية مع بقية أيام الرصد ومع جميع الحيوانات.
-
إعداد رويس وإشارة التحديد الكمي
- انقر فوق استعراض ، وحدد الملف غير مختلط (راجع الخطوة 5.1.8) من الفائدة يتم تحليلها. سوف تظهر نافذة جديدة.
- انقر فوق إضافة إلى قائمة تشمل جميع الملفات غير مختلط من كل الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة وثم انقر فوق تحميل كمجموعة. يجب أن تظهر كافة الصور كسلسلة واحدة.
- اذهب إلى نافذة لوح ألوان أداة : انقر خارج المربع مقياسنديفيدوال للحصول على جميع الصور على نفس المقياس.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق في صورة واحدة في التسلسل وإنشاء عائد على منطقة الاهتمام باستخدام التسلسل التالي. انتقل إلى أدوات العائد على الاستثمار وحدد الخيار 1 السيارات و كونتر وانقر على شكل دائرة الظهور، ووضعه في المركز إشارة الفلورسنت وثم انقر فوق إنشاء في الإطار المعروض.
ملاحظة: هذا تلقائياً يبرز بكسل مع كثافة الأسفار أعلاه القيم الأساسية (أي، الآفة) ويقوم بإنشاء شكل المنطقة التي تحتضن بكسل المبين. - نسخ الشكل عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه ولصق في منطقة خلفية حيث يوجد أي إشارة.
- انقر فوق مقياس رويس | تحديد الكل لعرض قيم شدة الأسفار. الشروع في تحديد قيم البيانات باستخدام الماوس، انقر فوق الزر الأيمن، اضغط نسخ ولصق في جدول بيانات.
6-بيانات (إشارة الفلورسنت) تطبيع
- حدد وقت الأولى النقطة التي إشارة الكثافة القصوى. للانتقال إلى تطبيع إشارة عند كل نقطة الوقت باستخدام الصيغة:
إشارة كثافة في كل نقطة في الوقت الذي لوحظ شدة الإشارة القصوى أثناء الوقت) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، يمكننا وصف عملية لإنشاء نموذج مغايرة لبطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ ببنية الآفات بغرس قطع بطانة الرحم البشري المسمى فلوريسسينتلي في الفئران المناعة، مما يسمح لغير الغازية رصد تطور الآفة. وسم من شظايا بطانة الرحم يتحقق عن طريق العدوى مع إتش هندسيا للتعبير عن مشري، بروتين التي تنبعث منها الأسفار في منطقة الأشعة تحت الحمراء القريب. في الشكل 1، نعرض الممثل لاحظ صور شظايا بطانة الرحم البشر المصابين بالإعلان-مشري تحت المجهر الأسفار. لأغراض التوضيح، ترد الشظايا المسماة وغير المسماة حيث يمكن ملاحظة الاختلافات في الأسفار بين الأنسجة المصابة وغير المصابة (أوتوفلوريسسينسي). أثناء الرصد، بالإضافة إلى الطول الموجي مرجع مشري، يتم أخذ صور الفلورسنت مع أزواج مختلفة من الإثارة/الانبعاثات أطوال موجية المرشحات (الشكل 2) لتعريف الشخصية المميزة الانبعاثات الفلورسنت من الأنسجة. والغرض من هذا الإجراء "أونميكس" fluorescence الفعلية المنبعثة من الآفات من الخلفية وأوتوفلوريسسينسي المنبعثة من أنسجة المضيف والندبة التي نشأت خلال عملية جراحية على التوالي. ويرد مثال توضيحي لعملية أونميكس في الشكل 3. تقديرات تباين في حجم الآفة يقوم بالقياس الكمي وتطبيع الفلورسنت الإشارات المنبعثة من الآفات وأثناء الوقت. لهذا الغرض، صوراً للرصد الذي يحتوي على الأسفار الخام المنبعثة من الحيوانات خلال كل نقطة الوقت هي أولاً ضم أونورماليزيد (الشكل 4) في ملف واحد. في وقت لاحق من الأسفار غير مختلط وتطبيع وممثله كصورة زائفة ألوان (الشكل 5). وأخيراً، رويس المقابلة للآفة محددة وخلفية الإشارات هي المعترف بها البرنامج تلقائياً وكمياً (الشكل 6). خلفية دوروا إشارات يخصم من الآفة مما يشير إلى العائد على الاستثمار والنتائج من كثافة في كل مرة يتم تطبيع نقطة ضد النقطة الزمنية القصوى التي كثافة (الشكل 7). في نهاية عملية الرصد، تولي عدة أسابيع بعد هي التضحية بالفئران الجراحة وزرع قابلة للتطبيق يمكن استردادها للصفاق الماوس (الشكل 8).
رقم 1: تصور شظايا بطانة الرحم مع مجهر الأسفار بعد الإصابة بالإعلان-مشري. (أ) بطانة الرحم يفتت البشرية المحتضنة مع Ad-متشيري في 37 درجة مئوية و 5% CO2 خلال 24 ساعة كعينة إيجابية. الجزء (ب) بطانة الرحم البشرية المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 دون إعلان-مشري كعينة مراقبة سلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المسمى fluorescence التصوير الخام المنبعثة من شظايا مزروع في الفئران. وتظهر الصورة تصوير الممثل الفلورية الخام الإشارات المنبعثة من الحيوان نفسه في نقطة زمنية محددة. وتناظر الصور من الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات بالإضافة إلى جهاز نظام تصوير المجراة في أثناء انعقاد دورة رصد. كل لوحة تحتوي على الفئران (مرقمة 1 – 5 في الزاوية اليسرى) يناظر الأسفار ولاحظت باستخدام عامل تصفية زوج انبعاثات إثارة محددة مختلفة للحصول على الصور. إظهار لوحة على اليمين (لوح ألوان أداة) الفلورية المعلمات المحددة لاقتناء الصور الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اتقانا للأسفار محددة مقابل خلفية المنبعثة من الآفات. تظهر الصورة الصور التمثيلية للعملية اتقانا إجراء تشريح fluorescence الفعلية من الآفات باستخدام نظام التصوير المجراة في بالإضافة إلى البرامج. الرسم البياني على اليسار لوحة الدلالة تطبيع ملامح محددة للانبعاثات fluorescence ندبة (الخط الأخضر، UMX1)، آفات (الخط الأحمر، UMX2) وأنسجة المضيف (الخط الأزرق، لوحة UMX3). يمثل كثافة الأسفار عند أطوال موجية مختلفة للانبعاثات (س) في الوحدات متألق الكفاءة المحور (ص). مجرد ملاحظة كيف كل بنية محددة (أي ندبة المسمى الآفات وأنسجة المضيف) تنبعث لمحة الأسفار مختلفة التي تتيح تحديد وفصل لهم على وجه التحديد نموذج كل منهما الآخر. في اللوحة اليمنى، الأسفار الناشئة عن إطلاق انبعاثات محددة الملامح لندبة (UMX1)، يتم إظهار الآفات (UMX2) وأنسجة المضيف (UMX3) متراكبة على صور فوتوغرافية للفئران. مركب الصورة (مركب) ويرد أيضا لأغراض توضيحية للدلالة على تجزئة fluorescence المنبعثة من الآفات عن تلك المنبعثة من أنسجة ندبة أو المضيف. تظهر لوحة الأوسط المعلمات المحددة اتقانا مع البرنامج الصورة بالإضافة إلى جهاز التقاط الصور الحية في الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مراقبة بالطبع من الأسفار الخام المنبعثة من آفات الوقت. تظهر لوحة الصور الممثل من الخام fluorescence المنبعثة من ماوس واحدة مزروع مع آفات البشرية المسمى (بقع صفراء رائعة) أثناء الوقت. تتم الإشارة إلى النقاط الزمنية بعد الرصد الذي تم إجراء عملية جراحية "يوم (عدد)". وترد في كل لوحة/صورة زوج الإثارة الإعلانية انبعاث عوامل التصفية المستخدمة لرصد. يتم تعريف كل فريق برمز معين (بكج) في الجزء العلوي الذي يحتوي على معلومات تتعلق بالتاريخ الذي تم اقتناؤها الأسفار.
الرقم 5: وقت رصد مسار تطبيع fluorescence المنبعثة من الآفات. صور الممثل تناظر غير مخلوط، إشارات الفلورسنت تطبيع المنبعثة من آفات البشرية (بقع بألوان قوس قزح) مطابق في ماوس واحدة خلال فترة دورة (أيام بعد الجراحة). تتم الإشارة إلى النقاط الزمنية بعد الرصد الذي تم إجراء عملية جراحية "يوم (عدد)". يتم تعريف كل فريق برمز معين (بكج) في الجزء السفلي التي تحتوي على معلومات تتعلق بالتاريخ الذي تم اقتناؤها الأسفار. ويحدد لون لوح ألوان قوس قزح على الجانب الأيمن fluorescence كثافة (كفاءة مشع) المنبعثة من الآفات في كل نقطة في الوقت. ملاحظة مدى قوة الأسفار كثافة خلال الانخفاض النقاط (أي اللون الأحمر في وسط الآفات في الأيام 1، 5 و 8) المرة الأولى أثناء وقت (أي، الأزرق اللون في الآفات في أيام 20 و 25). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: استخدام رويس للتحديد الكمي لكثافة fluorescence في الآفات أثناء وقت. يظهر الشكل لوحة الصور لتطبيع fluorescence المنبعثة من الآفات في ماوس واحدة أثناء الوقت (أي، الشكل 5) بالإضافة إلى رويس (تحديد الآفات والخلفية) للتحديد الكمي لشدة الأسفار. 1 العائد على الاستثمار والعائد على الاستثمار 2 تحديد مقدار fluorescence المنبعثة من كل الآفات اثنين خلال الوقت. بكج تحديد مقدار fluorescence المنبعثة من أنسجة المضيف (الخلفية الفلورية) أثناء الوقت. يتم طرح fluorescence الخلفية من رويس لأغراض القياس الكمي. تتم الإشارة إلى النقاط الزمنية بعد الرصد الذي تم إجراء عملية جراحية "يوم (عدد)". الصور المكتسبة عند كل نقطة الوقت المسماة برمز معين (بكج) في الجزء السفلي من كل المعلومات التي تحتوي على واحدة تتصل بالتاريخ في الأسفار التي كان المكتسبة (أول ثمانية أرقام عقب بيانات التفصيل بكج للسنة (2014)-شهر (10)-واليوم (10 إلى 31)) ، رمز هوية فردية (آخر 6 أرقام) وملامح محددة من الأسفار الانبعاثات المستخدمة للون لوح ألوان قوس قزح (UMX2) اتقانا على الجانب الأيمن يوفر مقياس مرئي من شدة الأسفار (كفاءة مشع) المنبعثة من الآفات في كل نقطة من الزمن. ملاحظة كيف ترتفع قيم كثافة fluorescence في الآفات اثنين (ROI1 و ROI2) يشير المرة الأولى (أيام 1 و 5) ويتعفن خلال الوقت للوصول إلى قيم أدنى في النهاية النقاط الزمنية (أيام 20 و 25). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تطبيع كثافة الأسفار وأثناء الوقت. ويبين الجدول في الجزء العلوي مثال توضيحي لقيم كثافة الفلورية (كفاءة مشع) المنبعثة من اثنين مشري المسمى الآفات (ROI1 و ROI2) مزروع في ماوس (R25). وأجرى رصد الأسفار في أيام مختلفة بعد الجراحة (D5-D25) وأثناء الوقت. D5-"الرسم البياني" في الأسفل يوضح نمط نموذجي لتطبيع fluorescence المنبعثة من آفات المصابين مشري المتحللة وأثناء الوقت. المحور الصادي تظهر قيم الأسفار تطبيع للتعبير عن النسبة المئوية للانحلال باستخدام الصيغة (إشارة كثافة في كل نقطة وقت شدة الإشارة القصوى الذي لوحظ خلال الوقت) x 100. يشير الوقت (أيام (Dx) بعد جراحة زرع) في رصد الأسفار التي ترد في المحور س. ملاحظة الزيادة الأولية للإشارات خلال 24 ساعة الأولى بعد العملية الجراحية، المقابلة لتحقيق الاستقرار للآفة، الذروة في كثافة الأسفار حول D1-D5 وتسوس اللاحقة سبب التعبير ابيسومال من مشري أثناء وقت يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: مظهر العيانية مزروع الآفات اندوميتريوتيك- صور الممثل عرض مظهر العيانية للآفات اندوميتريوتيك مزروع في الفئران في نهاية عملية الرصد على التضحية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف البروتوكول هنا بالتفصيل تنفيذ نموذج الحيوان من بطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ بنية غرس العمارة الآفات بينما يسمح في نفس الوقت تقييم الوقت الحقيقي للأسفار تنبعث حسب مشري المسمى أنسجة بطانة الرحم. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام محددة المجراة في نظام التصوير والبرامج ذات الصلة لتقييم غير إينفاسيفيلي fluorescence المنبعثة من الآفة المسماة. وينبغي تكييف كل مستخدم البروتوكول تبعاً لجهاز التصوير المحددة والبرامج ذات الصلة المتاحة في مؤسساتهم. الرصد يتم في تخديره من الحيوانات من خلال جهاز تخدير غاز إيسوفلوراني بالإضافة إلى نظام تصوير المجراة. لتجنب التداخل مع السيارات-الأسفار المنبعثة من الجروح، من المستحسن لبدء الرصد فلورية آفات ثلاثة أيام على الأقل بعد جراحة زرع.
وقد وصف نماذج الماوس مغايرة لبطانة الرحم مشابهة لواحدة، وهنا يظهر سابقا تتكون في شظايا غرس بطانة الرحم المسمى بالبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)18،19. ويوفر استخدام مشري كمراسل لوضع علامات على الأنسجة البشرية ولكن ميزة على التجارة والنقل بسبب اختراق الأنسجة المعزز السابقة. سبب طيف انبعاث أكبر وأعلى فوتوستابيليتي متشيري تنبعث إشارة أكثر إشراقا أكثر ملاءمة لتصور شظايا داخل.
نظراً لصغر حجمها، غدية ناقلات المفضل للعدوى (أي، وضع العلامات) لقطع الأنسجة كاملة كتلك التي توفر نشر مقبولة من خلال هياكل ثلاثية الأبعاد. وحتى مع أن النسبة المئوية لخلايا الأنسجة المصابة ليس أعلى من 30 – 35%. وبالتالي، والحد من هذا الطراز يعتمد على العلامات عدم كفاءة الأنسجة والتعبير عابر حققها غدية بالإضافة إلى ذلك. وفي الواقع، لا يمكن مراقبة الأسفار بعد 4 – 6 أسابيع كما أنه يتلاشى تدريجيا بسبب التعبير عابر ابيسومال الإعلانية-فيروس. يمكن زيادة الكفاءة لوضع العلامات، وفترة الرصد بتعطيل الأنسجة المانحين وإصابة الخلايا الظهارية/stromal واحدة معزولة مع فيروس الإعلانات السابقة ويجري حقن الفئران المستفيدة19،20. هذا نهج، ومع ذلك، يقلل من القدر الذي يحاكي نموذج الحيوان فسيولوجيا بطانة الرحم شريطة أن لا تتكون آفات البشرية خارج الرحم في إلى تراكم غير منظم للخلايا الظهارية/stromal واحد بل في حسن التنظيم الأنسجة اندوميتريوتيك.
في هذا البروتوكول، هو الخطوة الأكثر أهمية العلامات من الأنسجة ومعظم على وجه الخصوص تحديد تركيز مناسب من الفيروسات-الإعلانات المطلوبة للعدوى الأمثل. في الواقع، تركيز بفو/مل10 1 × 10 أشار في البروتوكول معظمها رقم أورينتاتيفي/توافق استناداً إلى تجربتنا. قد تختلف تركيز الأمثل في كل تجربة تبعاً لنوع ونوعية الخزعة و/أو مدى سرعة معالجة هذا. وهكذا فإننا نقترح التجارب على الأقل ثلاثة مختلفة التتر (مزدوج) في كل تجربة واختيار واحد بتقديم العلامات الأمثل استناداً إلى التصور تحت المجهر الأسفار.
لدينا البروتوكول/النموذج مفيد لدراسة الآليات المتورطة في إنشاء وتطوير المبكر للآفات اندوميتريوتيك. وعلى الرغم من الفترة الزمنية لرصد مقيد، النموذج لا يزال مفيداً لدراسة واكتشاف آثار المركبات الدوائية قادرة على ممارسة آثار مأساوية على حجم الآفة في فترة قصيرة من الزمن مثل الأوعية أو المخدرات أنتيستروجينيك. تطوير أساليب أكثر كفاءة وأكثر دواما من تصنيف الأنسجة البشرية يتوقع أن تنتشر الرصد غير الغازية كأسلوب موحد لاستكشاف إمكانيات علاجية لمجموعة أوسع نطاقا من المخدرات في النموذج السريري بطانة الرحم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية من خلال برنامج سيرفيت ميغيل [CP13/00077] تأسيسه قبل FEDER (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية) الإسبانية ومنحت للدكتور ر. غوميز إلى جانب المنح "معهد كارلوس الثالث للصحة" الدكتور R غوميز [PI14/00547 و PI17/02329] وزين ألف كانو [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
