Summary
在这里, 我们提出了一个方案的现场成像荧光标记的人子宫内膜片段移植到小鼠。该方法通过实时监测和定量荧光记者发出的荧光, 研究选择的药物对子宫内膜异位细胞病变大小的影响
Abstract
在这里, 我们描述了一个协议, 实现了一个异源小鼠模型, 其中子宫内膜异位症的进展可以通过无创监测所植入的异位人类子宫内膜组织发出的荧光实时评估。为此, 从正在进行的卵母细胞捐献的供体妇女身上获得人体子宫内膜活检。人类子宫内膜片段是在腺病毒存在的情况下培养的, 这些腺病毒的设计是为了表达 cdna, 为报告荧光蛋白 mcherry。在可视化之后, 在接受者小鼠的植入中选择感染后荧光率最佳的标记组织。植入手术前一周, 受者小鼠被进行卵巢切除, 雌二醇颗粒被皮下放置, 以维持病变的存活和生长。手术当天, 小鼠被麻醉, 腹膜腔通过一个小 (1.5 厘米) 的切口通过线-阿尔巴进入.荧光标记的植入物被推状, 短暂浸泡在胶水中, 并附着在腹膜层。对氯感进行缝合, 动物离开后恢复几天。子宫内膜异位植入物发出的荧光通常每3天通过体内成像系统进行为期4周的非侵入性监测。通过对 mcherry 信号进行定量和对显示最大荧光强度的初始时间点的归一化, 可以实时估计子宫内膜植入物大小的变化。
子宫内膜异位症模型的传统临床前啮齿类动物不允许对病变进行实时非侵入性监测, 而是允许评估在终点检测的药物的效果。该方案允许一个人实时跟踪病变, 更有助于探索药物在子宫内膜异位症临床前模型中的治疗潜力。由此产生的模型的主要局限性是, 由于 Ad-virus 的会代表达, 非侵入性监测不可能长期进行。
Introduction
子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病, 由子宫腔外功能性子宫内膜的植入引起。异位病变生长和诱发炎症过程, 导致慢性盆腔疼痛和不孕1。据估计, 多达10-15% 的育龄妇女受到子宫内膜异位症2的影响, 大约40-50% 的不孕妇女存在。目前子宫内膜异位症的药物治疗不能完全根除病变, 不具有副作用4,5。更有效的治疗方法的研究要求完善现有的子宫内膜异位症动物模型, 使人类病变可以被适当地模仿, 化合物对病变大小的影响等可以仔细评估。
灵长类动物模型已被用来模仿子宫内膜异位症植入异位病变组织学上相同, 并在类似的地点, 在人类6,7,8;然而, 与灵长类动物试验有关的伦理问题和高昂的经济成本限制了它们的使用。因此, 使用小动物, 特别是啮齿类动物, 实施子宫内膜异位症的体内模型继续受到青睐, 因为它允许对更多的人进行研究 10,11。子宫内膜异位症可以诱导这些动物通过移植到异位点 (异质模型)12, 13 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 (异质模型) 12, 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 14.与人类不同的是, 啮齿类动物不会脱落其子宫内膜组织, 因此子宫内膜异位症不能在这些物种中自发发展。因此, 同种异体子宫内膜异位症模型因植入异位小鼠子宫肌组织的事实而受到批评, 不能反映人类子宫内膜异位症病变的特点15。
子宫内膜异位症的适当生理可在异种子宫内膜异位症模型中进行模拟, 在这些模型中, 新鲜的人子宫内膜片段被植入免疫缺陷的动物体内。在传统的异源模型中, 通常通过使用卡钳16评估病变大小来评估感兴趣的化合物的治疗效果。一个明显的局限性是, 因此, 端点动物模型不允许研究植入动力学或子宫内膜异位症病变的发展随着时间的推移。另一个限制是, 使用卡钳不允许准确测量病变大小。事实上, 卡钳提供的标准误差与小鼠植入病变的大小在相同的范围 (即毫米), 从而限制了这些工具检测大小实际变化的能力。
为了克服这些限制, 本文描述了子宫内膜异位症的异源小鼠模型的产生, 在该模型中植入人体组织的工程来表达记者 m-cherry 荧光蛋白。通过适当的图像系统检测荧光信号, 可以对病变状态进行非侵入性监测, 同时实时量化其大小。因此, 与传统端点模型相比, 我们的模型提供了明显的优势, 因为它带来了实时非侵入性监测的机会, 并有可能对病变大小的变化进行更客观、更准确的估计。
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Protocol
la fe 大学机构审查委员会和道德委员会批准使用人体组织标本。所有患者均提供书面知情同意。这项涉及动物的研究得到了瓦伦西亚国家调查中心动物机构护理委员会的批准, 所有程序都是按照国家研究所的哺乳动物护理和使用准则进行的的健康。
1. 子宫内膜组织收集和预处理
- 通过使用连接在吸力装置上的插管, 获得高质量的人子宫内膜吸气活检。将活检物倒进含有10毫升无菌盐水的烧瓶中, 用温和的手动搅拌清洗。
请注意:关于如何获得高质量活检的程序先前已描述过 17。 - 清洗任何剩余血液或粘液的活检。重复这个过程, 将组织倒入含有新鲜盐水的烧瓶, 根据需要尽可能多地刺, 直到观察到组织被清洁。
- 将具有健康外观的活检片段转移到含有10毫升的溶液中, 该溶液含有10毫升的完整的 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 培养基, 含有10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的抗生素抗真菌溶液。
- 将含量倒入10厘米的培养皿中, 然后用一对头皮将组织切割成5-10 毫米3块。
2. 子宫内膜碎片腺病毒转染
请注意:在这个过程中将要使用的所有材料都应提前在引擎盖中引入。取出所有在这个过程中不会使用的东西, 并放置一个带漂白剂的烧瓶。所有与腺病毒载体接触的材料在将漂白剂丢弃在生物危害容器中之前, 必须用漂白剂进行消毒。
- 一旦活检被切碎, 就吃一个新的培养皿。移液器多个 30–50μl dmem 滴在整个盘中扩散。在掉落之间留出足够的空间, 这样它们就不会接触到。
- 用针头连接到注射器上, 在每个介质滴内放置一块片段。
请注意:每滴应包含一块子宫内膜。 - 准备 ad-mcherry 工作溶液, 稀释1:20 的 mcherry 腺病毒库存溶液 [1 x10 10 pfu/ml]) 到 dmem 介质, 没有抗生素 (dmem + 10% 过滤 fbs)。
- 在96孔板上每口井分配100–200μl 的 ad-200 微米的 ad-mcherry 溶液, 在 petri 盘液中填充尽可能多的井, 如碎片 (步骤 2.2)。此外, 用腺病毒游离 dmem 培养基填充至少3口井作为阴性对照。
- 用针头连接到注射器上, 将 petri 盘中的每个碎片 (步骤 2.2) 转移到96孔板中含有 ad-mchery 溶液的每口井。
- 将96片含有子宫内膜碎片的子宫内膜碎片与 ad-mcherry 溶液放入37°c 的孵化器中, 5% co 2 为 16小时。
- 将培养基中剩余的腺病毒放入一个新的96孔板, 其中充满了完整的 dmem 培养基 (抗生素抗药, 不含腺病毒), 并以5% 的 co2 孵育 37°c, 以 24–48 h 的速度孵育。
请注意:记得在丢弃到生物危害容器中之前, 要用漂白剂覆盖所有接触阿氏病毒的井板和小贴。 - 从孵化器中取出板, 并将其置于568纳米 (红色通道) 的荧光显微镜下, 以测试最佳标记。
- 选择最辉煌的碎片, 并把它们放入一个新的96孔板与新鲜完整的 dmem 介质 (与抗生素-抗药, 没有腺病毒)。
- 用塑料石蜡膜很好地密封盘子, 并将其输送到无特定病原体的动物区域, 以便将子宫内膜碎片植入接受者的动物体内。
3. 子宫内膜异位症小鼠模型的生成
请注意:使用6-8周的裸鼠 (或类似的免疫功能菌株) 雌性小鼠居住在特定的病原体-无病原体的情况下, 作为接受动物。为了避免激素与环合相关的变化, 同时燃料病变生长与雌二醇, 动物被卵巢切除, 并放置60天释放胶囊含有18毫克的17β-雌二醇 (17β-e2)。卵主动切除术和颗粒置入必须在将子宫内膜碎片移植到受者动物之前至少一周进行。
-
卵巢切除术
请注意:准备在引擎盖中使用手术消毒材料。准备麻醉设备和手术后恢复区准备在同一个房间。- 以每只小鼠 5 mg kg 的剂量进行皮下注射吗啡衍生物。注射后让小鼠休息 30分钟, 使药物的镇痛作用得以体现。
- 连接吸入麻醉设备, 让氧气和异氟醚 (2% mg/kg) 流动几分分钟进入密封麻醉室。
- 将动物引入异氟烷麻醉室。等待 3-5分钟, 并检查动物是完全麻醉通过按它的爪子之一。将动物转移到手术区域, 并通过放置一个面膜, 使呼吸道上的异氟醚气体持续流动, 从而维持麻醉。
- 用氯己定消毒区域后, 用锋利的剪刀大约在臀部的高度进行一个约0.5 厘米的横向海岸切口。
- 将皮肤与肌肉分开, 进入腹腔, 识别卵巢周围的白色脂肪垫, 并用解剖钳收回卵巢。
- 用可吸收的缝线在输卵管周围系上一个结, 并将其拧紧, 以确保在切除卵巢之前保持适当的止血。
- 用6-0 可吸收缝合线关闭肌层, 然后用6-0 不可吸收的缝合线关闭皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
- 重复该过程, 以删除对侧卵巢。
-
雌二醇颗粒植入物
请注意:注意动物在卵巢切除术中被麻醉, 以便在这一点上放置颗粒。- 卵巢切除术完成后, 立即用颈部周围的防腐溶液清洁皮肤, 并在颈部用锋利的剪刀做一个横向皮下小 (0.5 厘米) 切口。
- 使用剪刀解剖皮肤从肌肉, 使口袋足够大, 以便放置颗粒。
- 插入含有18毫克 17β-e2的颗粒, 用6-0 不可吸收的缝合线缝合皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
- 将动物放入恢复区, 并给予最佳剂量的长效镇痛, 以缓解恢复期。
-
子宫内膜植入物手术
请注意:在开始子宫内膜碎片植入手术之前, 至少允许7天的隔离时间, 以便在卵巢切除术后完全恢复动物。为了与组织标记的最佳同步, 在植入手术前2-3天收集活检, 以避免外植体的长期培养。- 提前准备好特定无病原体区的手术室。准备引擎盖与所有需要的手术材料, 麻醉设备和术后恢复区也。
- 将动物带到房间, 在每只小鼠身上以 5 (mg/kg) 的剂量进行吗啡衍生物的皮下注射。注射后让小鼠休息 30分钟, 这样药物的镇痛作用就可以体现出来。
- 连接吸入麻醉设备, 让氧气和异氟醚 (2% mg/kg) 流动几分分钟进入密封麻醉室。
- 在开始手术之前, 将含有荧光标记碎片 (从步骤 2.10) 的盘子移入引擎盖, 解开它的密封, 并将碎片倒入 petri 培养皿中, 以便于处理。
- 将动物引入异氟烷麻醉室。等待 3-5分钟, 并检查动物是完全麻醉通过按它的爪子之一。将动物转移到手术区域, 并通过放置一个面膜, 使呼吸道上的异氟醚气体持续流动, 从而维持麻醉。
- 将麻醉后的动物脸朝上。对腹侧区域进行消毒。用锋利的剪刀在腹部进行1.5 厘米的纵向切口, 并将皮肤与肌肉分开。然后, 在肌肉上进行一个1.5 厘米的纵向切口, 以进入腹腔。
- 用微型钳子握住腹部肌肉壁的左边缘, 并将其折叠起来, 试图暴露腹膜的内侧表面。
- 服用子宫内膜植入物与迷你推拿器, 将其短暂浸泡在正丁酯氰基丙烯酸酯胶粘剂中, 并将其放置在腹膜, 在那里它将得到连接。让它干几秒钟。重复步骤3.3.6 和3.3.7 将植入物放置在腹膜的对侧。
- 用可吸收的6-0 缝合线关闭肌肉层, 然后用不可吸收的6-0 缝合线关闭皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
- 将动物放入恢复区, 并给予最佳剂量的长效镇痛。
4. 活体荧光成像系统
- 打开体内成像系统设备, 初始化程序, 并允许 ccd 摄像机冷却几分时间。
- 准备吸入麻醉设备。以2% 的速度打开异氟烷流动, 用几分钟的时间填充麻醉室。准备麻醉后恢复区。
- 程序启动并冷却 ccd 摄像机后, 单击 "成像向导" 工具: 教程从显示一系列连续窗口开始, 每个窗口对应于感兴趣的参数, 并有多个可供选择的选项通过点击在相应的框中。通过在每个窗口中选择相应的框向前移动, 然后单击"确定"按钮移动到下一组参数, 其顺序如下。
- 选择荧光参数的"发光" 框, 为筛选器对参数选择 mcherry 框。选中 "照片" 模式和 "确认焦点" 框, 然后选择曝光参数的 "自动" 框。
- 一旦仪器已设置好, 移动一个动物在麻醉室内。当完全麻醉时, 将动物转移到体内成像系统的笼子内, 并将其侧向, 头部放置在连接到麻醉机的小管内。合上盖子, 然后单击 "获取"进行监视。
- 获取显示的图像 (共五个图像, 每个选择的筛选器一个图像), 并通过单击 "另存为" 按钮保存数据。将鼠标移动到麻醉后恢复区域。与剩余的动物重复此过程。
- 每周重复监测两三次, 在时间过程中适当跟踪信号。
- 在时间结束时, 通过co2窒息进行祭祀动物。
5.活体荧光图像的定量
-
通过图像解混来分离实际荧光:
- 打开活体成像分析耦合软件程序。
- 选择 "序列信息" 文件以开始分析。将出现两个窗口: "序列视图" 和 "工具调色板"。选择"工具调色板" , 一旦显示菜单, 请选择以下选项。
- 选择 "更正",然后单击 "自适应 fl 背景减法" 框, 从发光图像数据中删除不需要的荧光信号。选择最大兴趣的阈值, 然后单击 "设置"。
- 单击"光谱不混合", 选择感兴趣的波长、为取消混合而选择的方法 (库、引导、自动或手动), 然后单击 "开始不混合"。
- 选择与 mcherry 信号相对应的"未混合图像", 然后双击。将出现一个新窗口, 其中包含感兴趣信号的最终图像。
- 重复步骤5.1.3。
- 可选: 如果需要非混合结果的代表性图像 (jpeg), 请在工具面板中选择所需的设置图像调整(颜色表、分组、对比度等), 然后单击 "取消混合" 窗口中的"导出图形" 将当前图像视图导出为图像。
- 保存未混合的文件:文件另存为选择 "文件夹"和"确定"。
- 在监测日的其余部分和所有动物中重复这一过程。
-
rois 设置和信号量化
- 单击 "浏览" , 然后选择要分析的"未混合文件" (请参阅步骤 5.1.8)。将出现一个新窗口。
- 单击 "添加到列表" 以包括每个动物在不同时间点的所有未混合文件, 然后单击 "加载为组".所有图像必须以单个序列显示。
- 转到工具调色板窗口: 单击框 "我个人缩放" 以获取相同比例的所有图像。
- 在序列的一个图像中双击, 并使用以下序列在感兴趣的区域上创建 roi。转到 roi 工具并选择 "计数和自动 1 " 选项, 单击显示的圆形形状, 将其放置在显示的荧光信号的中心, 然后单击显示窗口上的"创建" 。
注意: 这将自动突出显示背景值上方荧光强度的像素 (即病变), 并生成一个面积包含所述像素的形状。 - 复制创建的 roi 形状并粘贴到没有信号的背景区域上。
- 点击测量 roi选择 "全部"可显示荧光强度值。继续使用鼠标选择数据值, 单击右键, 按复制并粘贴到电子表格上。
6. 数据 (荧光信号) 正常化
- 选择信号强度最大的初始时间点。使用公式继续在每个时间点对信号进行规范化:
每个时间点的信号强度/在时间过程中观察到的最大信号强度) x 100。
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Representative Results
在这里, 我们描述了创建子宫内膜异位症异源模型的过程, 在这个模型中, 通过将荧光标记的人类子宫内膜植入免疫功能受损的小鼠来保存病变的结构, 从而允许非侵入性病灶进展的监测。子宫内膜碎片的标记是通过感染腺病毒设计来表达 mcherry, 一种在近红外区域的蛋白质发出荧光。在图 1中, 我们显示了在荧光显微镜下观察到的人类子宫内膜碎片感染的代表性图像。为了说明起见, 包括标记和非标记的片段, 以便可以注意到受感染和未受感染组织之间的荧光差异 (自荧光)。在监测过程中, 除了 mcherry 的参考波长外, 还使用不同对兴奋/发射波长滤波器 (图 2) 拍摄荧光图像, 以确定组织的荧光发射特征。此操作的目的是 "不混合" 由病变发出的背景和自体荧光发出的宿主组织和疤痕分别在手术过程中。图 3显示了未混合过程的示例。通过定量和规范化病灶在这一过程中发出的荧光信号来估计病变大小的变化。为此, 包含动物在每个时间点发出的原始荧光的监测图像首先在一个文件中汇总, 而不是归一化 (图 4)。随后荧光不混合, 归一化, 并表示为假彩色图像 (图 5)。最后, 程序会自动识别与特定病变和背景信号相对应的 roi 并进行量化 (图 6)。背景 roi 信号从病变 roi 信号中减去, 每个时间点的强度结果根据强度最大的时间点进行归一化 (图 7)。在监测过程结束时, 手术后几周, 小鼠被牺牲, 并可以恢复可行的植入物连接到小鼠腹膜 (图 8)。
图 1: 雅草感染后用荧光显微镜显示子宫内膜碎片.(a) 在37°c 和 5% co2 在24小时内作为阳性样本与 ad-mcherry 孵育的人子宫内膜片段。(b) 在37°c 和 5% co2 下孵育的人子宫内膜片段, 没有作为阴性对照样本。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 植入小鼠体内的标记片段所发射的原始成像荧光.图为同一动物在特定时间点发出的原始荧光信号的代表性成像。图像对应于在监测过程中使用软件与体内成像系统设备耦合获得的屏幕截图。每个包含老鼠的面板 (左上角编号为 1-5) 对应于使用不同的特定兴奋/发射对滤波器来获取图像所观察到的荧光。右侧的面板 (工具调色板) 显示为获取图像而选择的荧光参数请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 将背景与病变发出的特定荧光混合在一起.图片显示了使用体内成像系统耦合软件对病变的实际荧光进行解剖而进行的不混合过程的代表性图像。左侧面板上的图形表示由疤痕 (绿线、umx1)、病变 (红线、umx2) 和宿主组织 (蓝线、umx3 面板) 进行的荧光发射的归一化特定特征。不同发射波长 (x 轴) 的荧光强度以辐射效率 (y 轴) 表示。只需注意每个特定的结构 (即疤痕, 标记病变和宿主组织) 如何发出不同的荧光轮廓, 从而能够识别和分离它们的具体形成。在正确的面板上, 在小鼠的照片图像上显示了因发射疤痕 (umx1)、病变 (umx2) 和宿主组织 (umx3) 的特定发射剖面而产生的荧光。还包括一个复合图像 (复合), 用于说明, 以表示由疤痕或宿主组织发出的病变所发出的荧光的分割。中间面板显示了为与体内成像设备耦合的图像软件进行非混合而选择的参数请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: 病灶发出的原始荧光的时间过程监测.面板显示了在这段时间内植入标记人类病变 (明亮的黄斑) 的一只老鼠发出的原始荧光的代表性图像。进行监测的手术后时间点表示为 "日 (数目)"。用于监测的发射和励磁对滤波器在每个面板/图像中都有说明。每个面板由上半部分的特定代码 (bkg) 标识, 其中包含与获取荧光的日期有关的信息。
图 5: 病灶发出的归一化荧光的时间过程监测.在手术后几天内, 人类病变 (彩虹色斑点) 发出的非混合、归一化荧光信号的代表性图像叠加在一只老鼠身上。进行监测的手术后时间点表示为 "日 (数目)"。每个面板由下半部分的特定代码 (bkg) 标识, 其中包含与获取荧光的日期有关的信息。右侧的彩虹调色板颜色可识别病变在每个时间点发出的荧光强度 (辐射效率)。请注意, 在初始时间点 (即第1天、第5天和第8天病变中心的红色) 中, 荧光强度在时间过程中下降的程度 (即第20天和第25天病变中的蓝色)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 使用 roi 定量的荧光强度在整个过程中的病变.图显示了在时间过程中, 单个鼠标的病变所发出的归一化荧光图像面板 (即图 5), 并添加了 roi (划定病变和背景), 用于量化荧光强度。rod1 和 roi 2 确定两个病变在这一过程中的荧光量。bkg 识别宿主组织在这一过程中发出的荧光量 (背景荧光)。背景荧光从 roi 中减去, 用于定量目的。进行监测的手术后时间点表示为 "日 (数目)"。在每个时间点获得的图像在每个时间点的底部都贴上了特定代码 (bkg) 的标签, 其中包含与获取荧光日期有关的信息 (前8位数字是 year(2014) 月 (10) 和-day(10 到 31) 的详细数据), 一个单独的识别码 (最后6位数字) 和用于解开的荧光发射的具体轮廓 (umx2) 右侧的彩虹调色板颜色提供了一个荧光强度的视觉尺度 (辐射效率) 发出的病变每个时间点。请注意两个病变 (roi1 和 roi2) 中的荧光强度值在初始时间点 (第1天和第5天) 较高, 并在时间过程中衰减, 以达到结束时间点 (第20天和第25天) 的最低值。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 时间过程中荧光强度的归一化.上半部分的表格显示了植入小鼠 (r25) 的两个 mcherry 标记病变 (roi1 和 roi2) 发出的荧光强度值 (辐射效率) 的示例。术后不同日 (d5-d25) 对术后不同的时间进行荧光监测。d5-底部的图形说明了在这段时间内感染 mcherry 腐烂的病变发出的典型归一化荧光模式。y 轴显示荧光值归一化, 通过使用公式 (每个时间点的信号强度/在时间过程中观察到的最大信号强度) x 100 来表示衰变的百分比。在 x 轴中显示在 x 轴上监测荧光的时间点 (植入手术后的天数 (dx)。注意术后前24小时信号的初始增加, 对应于病变的稳定, d1-d5 周围的荧光强度的峰值, 以及其随后的衰变, 因为在时间过程中 mcherry 的会生表达请点击在这里查看这个数字的一个更大的版本.
图 8: 植入子宫内膜异位病变的宏观外观.代表性的图像显示宏观外观的子宫内膜异位病变植入小鼠在监测过程结束时牺牲请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
本文详细介绍了子宫内膜异位症动物模型的实施情况, 在该模型中, 植入病变结构的结构得以保存, 同时允许实时评估 mcherry 发出的荧光标记的子宫内膜组织。在这个协议中, 我们描述了使用一个特定的体内成像系统和相关软件, 以非侵入性评估荧光发射的标记病变。每个用户都应根据其机构提供的特定成像设备和相关软件调整协议。通过将异氟烷气体麻醉机与体内成像系统结合, 在麻醉动物身上进行监测。为避免伤口发出的自动荧光干扰, 建议在植入手术后至少三天开始监测病变荧光。
异种小鼠子宫内膜异位症模型类似于本文所显示的模型, 以前曾被描述为由带有绿色荧光蛋白 (gfp)18,19标记的植入物子宫内膜片段组成。然而使用 mcherry 作为记者为标记人的组织提供了一个优势比 gfp 由于前者的增强的组织渗透。由于其更大的发射光谱和更高的光稳定性 mcherry 发出更明亮的信号, 更适合于腹膜内碎片的可视化。
由于其体积小, 腺病毒是整个组织碎片感染 (即标记) 的首选载体, 因为这些片段通过三维结构提供可接受的扩散。即使有了这种比例, 受组织感染的细胞的百分比也不高于30–35%。因此, 该模型的局限性依赖于组织的低效标记和腺病毒所实现的瞬态表达。事实上, 荧光不能监测超过 4-6周, 因为它逐渐消失, 由于会代短暂表达的阿氏病毒。标记的效率和监测周期可能会增加干扰供体组织和感染孤立的单个上皮基质细胞与广告病毒之前被注射到接收小鼠 19,20。然而, 这种方法降低了动物模型模仿子宫内膜异位症生理的程度, 前提是异位人类病变不是由单一上皮基质细胞的无序积累构成的, 而是结构良好的子宫内膜异位组织。
在这个协议中, 最关键的一步是组织的标签, 最具体的是确定最佳感染所需的广告病毒的适当浓度。事实上, 议定书中指出的 1x10 pfaml 浓度大多是根据我们的经验得出的东方共识数字。根据活检的类型和质量以及处理速度的速度, 每个实验的最佳浓度可能会有所不同。因此, 我们建议在每个实验中测试至少三种不同 (双重) 滴度, 并根据荧光显微镜下的可视化选择一种可提供最佳标记的滴度。
我们的协议模型是有用的研究机制牵连的建立和早期发展的子宫内膜异位病变。尽管监测时间段有限, 但该模型仍可用于研究和检测能够在短时间内对病变大小产生显著影响的药理化合物的影响, 如抗血管生成药物或抗雌激素药物。开发更有效和更持久的方法标记人体组织预计将传播非侵入性监测作为一个综合技术, 以探索更广泛的药物在临床前模型子宫内膜异位症的潜在治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙经济和竞争力部的支持, 该方案得到了 miguel servet 方案的支持, 该方案由欧洲区域发展基金 (feder) 共同发起, 并颁发给了 r. gómez 博士以及卡洛斯三世卫生研究所颁发的赠款给 r gómez 博士 [pi14/00547 和 pi17/12329] 和 a. cano 教授 [PI14/00547]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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