Summary
Nous présentons ici un protocole pour vivre-imagerie des fragments de l’endomètre humains fluorescent étiquetés greffés chez des souris. La méthode permet d’étudier les effets des médicaments de choix sur la taille de la lésion endometriotic grâce à la surveillance et la quantification de la fluorescence émise par le journaliste fluorescent en temps réel
Abstract
Nous décrivons ici un protocole pour la mise en œuvre d’un modèle de souris hétérologues dans lequel la progression de l’endométriose peut être évaluée en temps réel grâce à une surveillance non invasive de la fluorescence émise par le tissu endométrial humain ectopique implanté. À cette fin, biopsie de l’endomètre humain proviennent de don d’ovocytes en cours de donateurs femmes. Des fragments de l’endomètre humains sont cultivées en présence de l’adénovirus machinés pour cDNA express pour le mCherry de protéine fluorescente de journaliste. Après visualisation, étiqueté tissus avec un taux optimal de fluorescence après infection sont par la suite choisi pour l’implantation chez les bénéficiaires. Une semaine avant la chirurgie d’implantation, souris bénéficiaires sont chez et pastilles d’estradiol sont placés par voie sous-cutanée pour soutenir la survie et la croissance des lésions. Le jour de la chirurgie souris sont cavité péritonéale et anesthésiée, accédée via une incision de petite taille (1,5 cm) de la linea alba-. Les implants fluorescent étiquetés sont épilés, brièvement trempés dans la colle et attachées à la couche péritonéale. Incisions sont suturées et animaux à gauche pour récupérer pendant quelques jours. Fluorescence émise par les implants endometriotic est habituellement non invasive surveillé tous les 3 jours pendant 4 semaines avec un système d’imagerie in vivo. Variations de la taille des implants endometriotic peuvent être estimées en temps réel par quantification du signal mCherry et normalisation contre le temps-point initial indiquant l’intensité de la fluorescence maximale.
Les rongeurs précliniques traditionnelles des modèles de l’endométriose ne permettent pas la surveillance non invasive de la lésion en temps réel mais plutôt permettent une évaluation des effets des médicaments testés à la fin. Ce protocole permet de suivre en temps réel des lésions et est plus utile d’explorer le potentiel thérapeutique des médicaments dans les modèles précliniques de l’endométriose. La principale limitation du modèle ainsi produite est que surveillance non invasive n’est pas possible sur de longues périodes de temps en raison de l’expression épisomiques d’Ad-virus.
Introduction
L’endométriose est une affection gynécologique chronique initiée par l’implantation de l’endomètre fonctionnel en dehors de la cavité utérine. Les lésions ectopiques croissent et induisent des processus inflammatoires, conduisant à la chronique pelvienne douleur et l’infertilité1. On estime que vers le haut à 10 – 15 % des femmes en âge de procréer sont influencés par endometriosis2, et elle est présente dans environ 40 – 50 % des femmes infertiles3. Les traitements pharmacologiques actuels pour l’endométriose sont incapables d’éradiquer complètement les lésions et pas sans effets secondaires4,5. La recherche des thérapies plus efficaces requiert du raffinement des modèles animaux existants de l’endométriose, de telle sorte que les lésions humaines peuvent être imitées de manière appropriée, et évaluer attentivement les effets des composés sur la taille de la lésion entre autres.
Modèles de primates ont été utilisés pour imiter l’endométriose par implantation ectopiques lésions histologiquement identiques et sur des sites similaires comme les humains6,7,8; Toutefois, les préoccupations éthiques et le coût économique élevé liée à l’expérimentation avec les primates limite leur utilisation9. En conséquence, l’utilisation de petits animaux, surtout des rongeurs, pour la mise en œuvre de modèles in vivo de l’endométriose continue à être favorisée car elle permet des études avec un plus grand nombre de personnes10,11. L’endométriose peut être induite chez ces animaux en transplantant des morceaux de rongeurs cornes utérines (modèles « homologues »)12,13 ou tissu endométrial/endometriotic humain aux sites ectopiques (modèles hétérologues)14 . Contrairement aux humains, les rongeurs ne perdent pas leur tissu endométrial et ainsi l’endométriose ne peut pas être développé spontanément chez ces espèces. Par conséquent, homologue souris modèles de l’endométriose ont été critiquées en raison du fait qu’implanté des tissus utérins souris ectopique ne reflète pas les caractéristiques des lésions endometriotic humaines15.
Physiologie appropriée de l’endométriose peut être imitée dans les modèles hétérologues d’endométriose où des fragments de l’endomètre humains frais sont implantés chez des animaux immunodéficients. Les modèles conventionnels hétérologues, les effets thérapeutiques des composés d’intérêt sont généralement évalués à la fin par l’évaluation de la taille de la lésion à l’aide d’étriers16. Une limitation évidente est que, par conséquent, les modèles animaux de point de terminaison ne permettent pas étudier la dynamique de l’implantation ou le développement des lésions endometriotic au fil du temps. Une autre limite est que l’utilisation des étriers ne permet pas de mesures précises de la taille de la lésion. En effet, l’écart-type fourni par étriers est dans la même gamme (c.-à-d. millimètres) que la taille des lésions implantés chez des souris, limitant ainsi la capacité de ces outils pour détecter les variations réelles dans la taille.
Afin de surmonter ces limitations, dans les présentes, nous décrivons la génération d’un modèle de souris hétérologues d’endométriose dans lequel les tissus humains implantés sont conçu pour exprimer une protéine fluorescente de journaliste m-Cherry. Détection du signal fluorescent avec un système d’image appropriée permet une surveillance non invasive de l’état de la lésion avec quantification simultanée de sa taille en temps réel. Ainsi, notre modèle prévoit des avantages évidents par rapport aux modèles de point de terminaison conventionnelle car elle apporte la possibilité de surveillance non invasive en temps réel et la possibilité d’effectuer les plus objectives et une estimation précise des variations dans la taille de la lésion.
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Protocol
L’utilisation d’échantillons de tissus humains a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’Hospital Universitario La Fe. Consentement éclairé a fourni tous les patients. L’étude impliquant des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection Animal au Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, et toutes les procédures ont été réalisées suivant les directives pour le soin et l’utilisation des mammifères auprès des instituts nationaux de la santé.
1. pré-traitement et Collection de tissu endométrial
- Obtenir une biopsie de bonne qualité d’aspiration l’endomètre humaine en utilisant une canule reliée à un appareil d’aspiration. Versez la biopsie dans un flacon contenant 10 mL de stérile saline et laver avec de l’agitation manuelle douce.
Remarque : Procédures à suivre afin d’obtenir des biopsies de bonne qualité ont été décrites précédemment17. - Laver la biopsie de sang ou de mucus restant. Répétez l’opération en versant le tissu pour flacons contenant solution saline frais dents autant que nécessaire jusqu'à ce que le tissu est propre.
- Fragments de biopsie de transfert avec une apparence saine dans une solution contenant 10 mL d’achever moyen (DMEM) moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco avec une solution antibiotique-antimycosiques sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % à 10 %.
- Verser le contenu dans une boîte de pétri de 10 cm et continuez à couper le tissu en 5 à 10 mm3 pièces avec une paire de bistouris.
2. adénovirale Transfection des Fragments de l’endomètre
Remarque : Tous les matériaux qui vont être utilisés dans le processus devraient être introduites dans la hotte à l’avance. Retirez tout ce qui ne va pas être utilisé dans le processus et placer un ballon avec l’eau de Javel. Tout le matériel qui entre en contact avec le vecteur adénoviral doit être désinfecté avec l’eau de Javel avant de jeter dans le conteneur de biohazard.
- Une fois la biopsie a été coupée, prenez une nouvelle boîte de pétri. Pipetter plusieurs gouttes DMEM µL 30 – 50 de propagation dans tout le plat entier. Laisser un espace suffisant entre les gouttes alors qu’ils n’entrent pas en contact.
- Avec l’aide d’une aiguille attachée à la seringue, placez un seul morceau de fragment à l’intérieur de chacune des baisses moyennes.
Remarque : Chaque goutte doit contenir un seul élément de l’endomètre. - Préparer la solution d’Ad-mCherry en diluant 01:20 de la solution mère adénoviraux mCherry [1 x 1010 UFP/mL]) en DMEM moyen sans antibiotiques (DMEM + 10 % filtré FBS).
- Pipeter 100 – 200 μL de la solution d’Ad-mCherry / puits sur une plaque à 96 puits, remplissage des puits autant que des fragments sont disponibles dans les boîte de pétri gouttes (étape 2.2). En outre, remplir au moins 3 puits avec un milieu DMEM sans adénovirus comme témoin négatif.
- Avec l’aide d’une aiguille attachée à la seringue, chacun des fragments dans la boîte de pétri (étape 2.2) transfert à chaque puits contenant une solution ad-mCherry dans la plaque à 96 puits.
- Placer la plaque de 96 puits contenant les fragments de l’endomètre avec une solution Ad-mCherry dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 16 h.
- Laver à l’adénovirus restants dans le milieu en transférant des tissus dans une nouvelle plaque de 96 puits remplie de milieu DMEM complet (avec antibiotiques-Antimycotiques, libre d’adénovirus) et laisser incuber à 37 ° C avec 5 % CO2 pendant 24 à 48 h.
Remarque : N’oubliez pas de recouvrir d’eau de Javel tous les plats et des conseils qui sont venus en contact avec Ad-virus avant de le jeter dans le récipient de biohazard. - Retirez la plaque de l’incubateur et placez-le sous un microscope à fluorescence à 568 nm (canal rouge) pour tester l’étiquetage optimales.
- Choisissez les fragments plus brillants et les placer dans une nouvelle plaque de 96 puits avec un milieu DMEM complet frais (avec antibiotiques-Antimycotiques, libre d’adénovirus).
- Sceller la plaque avec un film plastique paraffine et à voyager dans la zone spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes animale pour implantation de fragments de l’endomètre dans les receveuses.
3. génération du modèle souris endométriose
Remarque : Utilisez 6 à 8 semaines-vieux nude athymiques (ou des souches similaires immunodéprimés) des souris femelles logées dans des conditions particulières – exempts de pathogènes, comme les animaux receveurs. Pour éviter les variations hormonales de cycle-dépendante et en même temps alimenter la croissance lésion avec l’estradiol, les animaux sont ovariectomisées et placé avec le communiqué de 60 jours en gélule 18 mg de 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Ovariectomie et pellet de placement doivent être effectuées au moins une semaine avant la greffe de fragments de l’endomètre dans les receveuses.
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Ovariectomie
Remarque : Préparer le matériel stérilisé chirurgical sous une hotte. Préparer le matériel d’anesthésie et une zone de récupération post-chirurgicale prête dans la même pièce.- Effectuer une injection sous-cutanée de dérivé de morphine à la dose de 5 mg/kg / souris. Laissez les souris reposer pendant 30 min après l’injection donc comme analgésiques des effets du médicament peuvent se manifester.
- Connectez l’inhalation anesthésie matériel et laissez oxygène et isoflurane (2 % mg/kg) de flux pendant quelques minutes dans une chambre scellée de l’anesthésie.
- Introduire l’animal dans la chambre d’anesthésie isoflurane. Attendre 3 à 5 min et vérifier que les animaux est complètement anesthésiés en appuyant sur une de ses pattes. Transférer l’animal dans le domaine de la chirurgie et maintenir l’anesthésie en plaçant un masque avec un flux continu de gaz isoflurane couvrant les voies respiratoires.
- Après la désinfection de la zone avec la chlorhexidine, effectuer une incision costale transversal 0,5 cm environ à la hauteur de la hanche avec des ciseaux pointus.
- Séparer le muscle pour accéder à la cavité abdominale, d’identifier les coussinets adipeux blanc qui entoure l’ovaire et de rétracter l’ovaire avec une pince de dissection de la peau.
- Faire un noeud autour de l’oviducte avec suture résorbable et serrez-la pour assurer l’hémostase appropriée avant l’excision de l’ovaire.
- Fermez la couche musculaire avec suture résorbable 6-0 et puis fermez la peau avec une suture non résorbable 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
- Répétez la procédure pour enlever l’ovaire latérale contra.
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Estradiol-pellet implant
Remarque : Veiller à ce que l’animal est anesthésié pendant la chirurgie de l’ovariectomie pour placer les boulettes à ce moment-là.- Immédiatement après l’achèvement de la procédure de l’ovariectomie, nettoyer la peau avec une solution antiseptique qui entoure le cou et faire une incision transversale petit sous-cutanée (0,5 cm) avec des ciseaux pointus dans la nuque.
- Utilisez des ciseaux à disséquer la peau du muscle, faire une poche assez grande pour permettre de placer les boulettes.
- Insérez le culot contenant 18 mg de 17β-E2 et suture de la peau avec une suture non résorbable 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
- Placer l’animal dans la zone de récupération et d’administrer une dose optimale de longue durée analgésie pour faciliter la période de récupération.
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Chirurgie d’implantation de l’endomètre
Remarque : Laisser au moins une période de quarantaine de sept jours pour permettre une récupération complète des animaux après l’ovariectomie avant de commencer l’implantation chirurgicale de fragments de l’endomètre. Pour une synchronisation optimale avec étiquetage des tissus, recueillir la biopsie 2 – 3 jours avant la chirurgie d’implantation afin d’éviter à long terme culture des explants.- La salle chirurgicale dans la zone franche de pathogènes spécifiques se préparent à l’avance. Préparation de la hotte avec tout le matériel chirurgical nécessaire, le matériel d’anesthésie et de la zone de récupération après une chirurgie aussi.
- Amener les animaux à la chambre, effectuer une injection sous-cutanée d’un dérivé de la morphine à la dose de 5 mg/kg () dans chacune des souris. Laissez les souris reposer pendant 30 min après l’injection donc les effets analgésiques de drogue peuvent se manifester.
- Connectez l’inhalation anesthésie matériel et laissez oxygène et isoflurane (2 % mg/kg) de flux pendant quelques minutes dans une chambre scellée de l’anesthésie.
- Avant de commencer la chirurgie, déplacer la plaque contenant fluorescent étiqueté fragments (de l’étape 2.10) dans la hotte, il desceller et versez les fragments dans une boîte de pétri pour une manipulation plus facile.
- Introduire l’animal dans la chambre d’anesthésie isoflurane. Attendre 3 à 5 min et vérifier que les animaux est complètement anesthésiés en appuyant sur une de ses pattes. Transférer l’animal dans le domaine de la chirurgie et maintenir l’anesthésie en plaçant un masque avec un flux continu de gaz isoflurane couvrant les voies respiratoires.
- Place l’animal anesthésié face vers le haut. Désinfecter la zone ventrale. Effectuer une incision longitudinale 1,5 cm au ventre avec des ciseaux pointus et séparer la peau du muscle. Ensuite, effectuer une incision longitudinale de 1,5 cm dans le muscle pour accéder à la cavité péritonéale.
- Maintenez le bord gauche de la paroi musculaire de l’abdomen avec une mini pince et pliez-la tente d’exposer la face interne du péritoine à l’extérieur.
- Prenez un implant de l’endomètre avec mini pinces à épiler, tremper brièvement dans un adhésif cyanoacrylate n-butyl-ester et placez-le au péritoine où il sera attaché. Laisser sécher pendant quelques secondes. Répétez les étapes 3.3.6 et 3.3.7 pour placer un implant du côté controlatéral du péritoine.
- Fermez la couche musculaire avec une suture résorbable 6-0 et puis fermez la peau avec un non-résorbable suture 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
- Placer l’animal dans la zone de récupération et d’administrer une dose optimale de longue durée analgésie.
4. imagerie in Vivo Fluorescent avec un In Vivo, système d’imagerie
- Allumez l’appareil de système d’imagerie in vivo, initialiser le programme et permettent à la caméra CCD se refroidir pendant quelques minutes.
- Préparer le matériel d’anesthésie par inhalation. Ouvrez le flux de l’isoflurane à 2 % pendant quelques minutes pour remplir la chambre anesthésique. Préparer la zone de récupération après l’anesthésie.
- Une fois que le programme a démarré et la caméra CCD ont refroidi, cliquez sur l’outil Assistant Imaging : un tutoriel commence par une série de fenêtres consécutives affichée, chacun correspondant à un paramètre d’intérêt avec plusieurs options disponibles à choisir en cliquant sur la case correspondante. Aller de l’avant par le tutoriel en sélectionnant les cases appropriées dans chaque fenêtre et cliquez sur le bouton OK pour passer à la prochaine série de paramètres avec la séquence suivante.
- Activez la case à Épiluminescence pour le paramètre de fluorescence, activez la case à mCherry pour le paramètre de paires filtre. Cochez les cases de la photographie de mode et de Confirmer la mise au point et sélectionnez la case automatique pour le paramètre d’exposition.
- Une fois que l’instrument a été mis en place, déplacer un animal à l’intérieur de la chambre de l’anesthésie. Lorsque complètement anesthésiés, transférer l’animal à l’intérieur de l' in vivo cage de système d’imagerie et placez-le à l’endroit qui a la tête à l’intérieur d’un tube relié à la machine d’anesthésie. Fermer le couvercle et cliquez sur acquérir pour la surveillance.
- Acquérir les images qui apparaissent (un total de cinq images, une image pour chaque paire de filtres sélectionnés) et enregistrer des données en cliquant sur le bouton Enregistrer sous . Déplacez la souris vers la zone de récupération après anesthésie. Répétez le processus avec les animaux restants.
- Répétez suivi deux ou trois fois par semaine à suivi le signal approprié au cours du temps.
- Passez à sacrifier l’animal à la fin de l’évolution temporelle de CO2 asphyxie.
5. quantification des In Vivo les Images de la Fluorescence
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Ségrégation de fluorescence réel par le biais de déconvolution d’images :
- Ouvrez le In Vivo analyse d’imagerie couplé logiciel.
- Choisissez le fichier « Sequenceinfo » pour lancer l’analyse. Deux fenêtres seront affichera : « Séquence vue » et « Palette d’outils ». Choisissez la Palette d’outils et une fois que le menu a été affiché, sélectionnez les options suivantes.
- Sélectionnez les Corrections et cliquez sur la case Adaptive FL fond soustraction pour supprimer les signaux fluorescents indésirables des données image luminescent. Choisir le seuil du plus grand intérêt, puis cliquez sur définir.
- Cliquez sur Spectral Unmixing, sélectionner les longueurs d’onde d’intérêt, la méthode choisie pour la déconvolution (bibliothèque, guidée, automatique ou manuelle) et puis cliquez sur Démarrer Unmix.
- Sélectionnez l’image Unmixed correspondant au signal mCherry et double cliquez. Une nouvelle fenêtre apparaîtra avec l’image finale du signal d’intérêt.
- Répétez l’étape 5.1.3.
- FACULTATIF : Si une image représentative (JPEG) du résultat unmix est nécessaire, choisissez les paramètres souhaités dans la Palette d’outils de | Ajustez l’image (color table, binning, contraste, etc..), puis cliquez sur Exporter des graphiques dans la fenêtre d’unmix pour exporter la vue active d’image sous forme d’image.
- Enregistrez le fichier non mélangé : fichier | Enregistrer sous | Choisissez le dossier et Ok.
- Répétez l’opération avec le reste des jours surveillance et avec tous les animaux.
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ROIs, mis en place et quantification du signal
- Cliquez sur parcourir et sélectionnez le fichier non mélangé (voir étape 5.1.8) intéressant à analyser. Une nouvelle fenêtre apparaîtra.
- Cliquez sur Ajouter à la liste pour inclure tous les fichiers non mélangés de chaque animal à des moments différents, puis cliquez sur Groupe de chargement comme A. Toutes les images doivent apparaître comme une seule séquence.
- Allez dans la fenêtre de la Palette d’outils : cliquez sur la case j’aiindividuel à obtenir toutes les images sur la même échelle.
- Double-cliquez sur une image de la séquence et créer un retour sur investissement sur la zone d’intérêt en utilisant la séquence suivante. Aller aux Outils de retour sur investissement et sélectionnez contour et option Auto 1 , cliquez sur le cercle apparaissant, placez-le sur le centre le signal fluorescent et puis cliquez sur Create sur la fenêtre qui s’ouvre.
Remarque : Cela met en lumière des pixels avec une intensité de fluorescence au-dessus des valeurs de fond (par exemple, lésion) automatiquement et génère une forme dont le secteur englobe les pixels indiqués. - La forme ROI créée le Copy et collent sur une zone de fond où il n’y a aucun signal.
- Cliquez sur mesure ROIs | Select All pour afficher les valeurs d’intensité de fluorescence. Continuez à sélectionner des valeurs de données avec la souris, cliquez sur le bouton de droite, appuyez sur copier et coller sur une feuille de calcul.
6. données (signal fluorescent) normalisation
- Sélectionnez le point de temps initial à quel signal intensité est maximale. Passez à normaliser le signal à chaque point dans le temps en utilisant la formule :
Signal d’intensité en chaque point du temps / intensité du signal Maximal observé au cours du temps) x 100.
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Representative Results
Nous décrivons ici le processus de création d’un modèle hétérologue d’endométriose dans lequel l’architecture des lésions est préservée par l’implantation de fluorescent étiquetés morceaux d’endomètre humain dans des souris immunodéficientes, permettant ainsi non invasif suivi de la progression de la lésion. Étiquetage des fragments de l’endomètre est réalisée par l’infection à adénovirus machinés pour express mCherry, une protéine à l’émission de fluorescence dans la région infrarouge proche. Dans la Figure 1, nous montrons représentant des images de fragments de l’endomètre humains infectés par Ad-mCherry observées au microscope à fluorescence. À titre illustratif, marqués et non marqué les fragments sont inclus donc peuvent être noté des différences dans la fluorescence entre les tissus infectés et non infectés (autofluorescence). Pendant la surveillance, en plus de la longueur d’onde de référence pour les mCherry, les images fluorescentes sont prises avec différentes paires de filtres de longueur d’onde d’excitation/émission (Figure 2) pour définir le profil d’émission de fluorescence caractéristique des tissus. Cette action vise à « unmix » réelle fluorescence émise par des lésions du fond et autofluorescence émis par les tissus de l’hôte et la cicatrice proviennent respectivement pendant la chirurgie. Un exemple illustrant le processus unmix est illustré à la Figure 3. Estimations des variations dans la taille de la lésion est effectuée en quantifiant et normaliser la signalisation fluorescente émise par des lésions au cours du temps. À cette fin, des images de surveillance contenant brut fluorescence émise par les animaux au cours de chaque point dans le temps sont tout d’abord réunis non normalisé (Figure 4) dans un seul fichier. Par la suite la fluorescence est non mélangés, normalisée et représentés sous forme d’image fausses couleurs (Figure 5). Enfin, ROIs correspondant à la lésion spécifique et fond de signalisation sont automatiquement reconnus par le programme et quantifiés (Figure 6). Fond de ROI de signalisation est soustraite de la lésion ROI de signalisation et de résultats d’intensité à chaque fois que point sont normalisées contre le moment où l’intensité est maximale (Figure 7). À la fin de la procédure de suivi, plusieurs semaines après la chirurgie souris sont euthanasiées et implant viable peut être récupéré attaché à du péritoine de souris (Figure 8).
Figure 1 : visualisation des fragments de l’endomètre avec microscope à fluorescence après infection de Ad-mCherry. (A) fragment de l’endomètre humains incubé avec Ad-mCherry à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24h comme un échantillon positif. Fragment (B) de l’endomètre humains incubés à 37 ° C et 5 % de CO2 sans Ad-mCherry comme un échantillon de contrôle négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Raw fluorescence d’imagerie émis par étiquetée fragments implantés chez des souris. Photo montre représentatif d’imagerie de fluorescence raw signal émis par le même animal à un moment précis. Images correspondent aux captures d’écran obtenues à l’aide du logiciel couplé à un dispositif de système d’imagerie in vivo au cours d’une session de contrôle. Chaque panneau contenant des souris (numérotées de 1 à 5 dans le coin gauche) correspond à la fluorescence observée en utilisant un filtre de paire de différentes d’excitation/émission spécifique d’acquisition d’images. Panneau sur la droite (palette d’outils) afficher des paramètres de fluorescence sélectionnés pour l’acquisition d’images s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : déconvolution de fond vs spécifiques fluorescence émise par lésions. Montre l’image images représentatives du processus déconvolution interprétés à disséquer la fluorescence réel de lésions à l’aide du système d’imagerie in vivo couplé logiciel. Graphique sur le panneau de gauche correspondent aux profils spécifiques normalisées d’émission de fluorescence par scar (ligne verte, UMX1), des lésions (ligne rouge, UMX2) et les tissus de l’hôte (ligne bleue, panneau de UMX3). Intensité de la fluorescence aux longueurs d’onde de différentes émissions (axe x) est représentée dans les unités d’efficacité radiante (axe y). Il suffit de noter comment chaque structure spécifique (c.-à-d., cicatrice, étiqueté les lésions et les tissus de l’hôte) émet un profil différent de fluorescence qui permet d’identifier et en les séparant spécifiquement forme mutuellement. Sur le panneau de droite, fluorescence découlant de lancer des profils d’émission spécifique pour les cicatrices (UMX1), des lésions (UMX2) et les tissus de l’hôte (UMX3) apparaissent superposées sur des images de la photographie de souris. Un composite image (Composite) est également incluse à titre illustratif désigner la segmentation de la fluorescence émise par des lésions de celle émise par les tissus cicatriciels ou hôte. Panneau central montre les paramètres choisis pour déconvolution avec le logiciel image couplé à l’appareil d’imagerie in vivo s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : temps de parcours suivi de raw fluorescence émise par des lésions. Panneau affiche des images représentatives des brute fluorescence émise par une seule souris implantée avec lésions humaines marquées (taches de jaune brillants) au cours du temps. Points dans le temps après l’opération de surveillance a été réalisée au cours de laquelle sont désignés comme « Jour (nombre) ». D’émission ad excitation paire filtres utilisés pour la surveillance sont indiqués dans chaque panneau/image. Chaque panneau est identifié par un code spécifique (BKG) dans la partie supérieure contenant les infos liées à la date à laquelle a été acquise par fluorescence.
Figure 5 : suivi en cours du temps normalisé fluorescence émise par lésions. Images représentant correspondant aux non mélangés, normalisée de signalisation fluorescente émise par lésions humaines (taches de couleur arc en ciel) superposées dans une souris unique pendant la durée du cours (jours après la chirurgie). Points dans le temps après l’opération de surveillance a été réalisée au cours de laquelle sont désignés comme « Jour (nombre) ». Chaque panneau est identifié par un code spécifique (BKG) dans la partie inférieure contenant des infos liées à la date à laquelle a été acquise par fluorescence. Couleur palette arc-en-ciel sur le côté droit identifie intensité de fluorescence (efficacité radiante) émise par les lésions à chaque instant. Notez comment forte intensité de la fluorescence pendant le temps initial points (c'est-à-dire, la couleur rouge dans le centre des lésions aux jours 1, 5 et 8) diminue au cours du temps (c'est-à-dire,, bleu couleur des lésions 20 et 25 jours). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : utilisation des ROIs pour la quantification de l’intensité de la fluorescence dans les lésions au cours du temps. La figure montre le panneau d’images de fluorescence normalisée émise par lésions chez une souris unique au cours du temps (c'est-à-dire, Figure 5) avec l’ajout des ROIs (délimitation des lésions et fond) pour la quantification de l’intensité de la fluorescence. 1 ROI et ROI 2 indiquer le montant de la fluorescence émise par chacun des deux lésions au cours du temps. BKG identifier la quantité de fluorescence émise par les tissus de l’hôte (fluorescence de fond) au cours du temps. Fluorescence de fond est soustraite de ROIs à des fins de quantification. Points dans le temps après l’opération de surveillance a été réalisée au cours de laquelle sont désignés comme « Jour (nombre) ». Les images acquises à chaque instant sont étiquetés avec un code spécifique (BKG) au bas de chaque contenant une information de liées à la date à laquelle fluorescence a été acquises (huit premiers chiffres après les données de détail BKG pour année (2014)-mois (10) et - jour (10 à 31)) , un code d’identification individuelle (6 derniers chiffres) et les profils spécifiques de l’émission de fluorescence servant de déconvolution (UMX2) Rainbow palette couleur sur le côté droit fournit une échelle visuelle de l’intensité de fluorescence (efficacité radiante) émis par des lésions à chaque point dans le temps. Note comment les valeurs d’intensité de fluorescence dans les deux lésions (ROI1 et ROI2) sont plus élevés à l’instant initial points (jours 1 et 5) et se désintègre au cours du temps pour atteindre les valeurs les plus faibles à la fin des temps (jours 20 et 25). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : normalisation de l’intensité de la fluorescence au cours du temps. Tableau de la partie supérieure montre exemple illustrant les valeurs de l’intensité de fluorescence (efficacité radiante) émis par les deux mCherry marqué de lésions (ROI1 et ROI2) implantées dans une souris (R25). Surveillance de fluorescence a été réalisée à différents jours après la chirurgie (D5-D25) au cours du temps. D5 - graphique en bas montre le modèle typique de normalisé fluorescence émise par les lésions infectées par mCherry en décomposition au cours du temps. Axe des y indique les valeurs de fluorescence normalisée pour exprimer le pourcentage de décomposition à l’aide de la formule (Signal d’intensité en chaque point du temps / intensité du signal Maximal observé au cours du temps) x 100. Temps pointe (jours (Dx) après chirurgie de l’implantation) à laquelle fluorescence a été surveillée sont indiqués dans l’axe des abscisses. Remarque une augmentation initiale de la signalisation durant les premières 24 heures après la chirurgie, correspondant à une stabilisation de la lésion, le pic d’intensité de fluorescence autour D1-D5 et sa désintégration subséquente en raison de l’expression épisomiques de mCherry au cours du temps s’il vous plaît cliquez sur ici pour obtenir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : aspect macroscopique des lésions endometriotic implantées. Représentant des images montrant des aspect macroscopique des lésions endometriotic implantés chez des souris à la fin de la procédure de suivi sur le sacrifice s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole détaillé ci-après décrit la mise en œuvre d’un modèle animal de l’endométriose, dont l’architecture d’implantation architecture des lésions est préservée tout en permettant simultanément en temps réel de la fluorescence émise par mCherry marqués de tissu endométrial. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un appareil d’imagerie in vivo spécifique et des logiciels d’évaluation non invasive fluorescence émise par la lésion étiquetée. Chaque utilisateur doit adapter le protocole selon le périphérique d’imagerie spécifique et des logiciels connexes disponibles dans leur établissement. Surveillance est effectuée dans une machine anesthésie à l’isoflurane gaz couplée à un système d’imagerie in vivo chez des animaux anesthésiés. Pour éviter toute interférence avec l’auto-fluorescence émise par les blessures, il est recommandé de commencer surveillance fluorescence de lésions au moins trois jours après la chirurgie d’implantation.
Modèles murins hétérologues d’endométriose semblable à celui qui est indiqué dans les présentes ont été décrits précédemment composé dans les fragments de l’endomètre implantation marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP)18,19. L’utilisation de mCherry comme reporter pour le marquage des tissus humains prévoit toutefois un avantage sur GFP en raison de la pénétration accrue des tissus du précédent. En raison de son plus grand spectre d’émission et la photostabilité supérieure mCherry émet un signal lumineux qui est plus approprié pour la visualisation des fragments intrapéritonéales.
En raison de sa petite taille, adénovirus sont les vecteurs de choix pour l’infection (p. ex., étiquetage) de morceaux de tissus entiers comme ceux fournir diffusion acceptable par le biais de structures 3D. Même avec ça, le pourcentage de cellules de tissus infectés n’est pas supérieur à 30-35 %. Ainsi, la limitation de ce modèle s’appuie sur l’étiquetage inefficace des tissus et, en outre, l’expression transitoire obtenue par adénovirus. En effet, la fluorescence ne peut être surveillé au-delà de 4 à 6 semaines car il s’estompe progressivement en raison de l’épisomiques expression transitoire du Ad-virus. L’efficacité de l’étiquetage et la période de surveillance pourraient être augmentés de perturber le tissu du donneur et d’infecter des cellules épithéliales/stromales unique isolées avec ad-virus avant d’être injecté dans les souris destinataire19,20. Une telle approche, cependant, réduit l’étendue à laquelle le modèle animal imite la physiologie de l’endométriose, pourvu que les lésions humaines ectopiques ne consistent pas en une accumulation désordonnée des cellules épithéliales/stromales simples mais plutôt en bien structuré tissu endometriotic.
Dans ce protocole, l’étape la plus critique est l’étiquetage du tissu et plus spécifiquement la détermination de la concentration appropriée d’ad-virus requis pour infection optimale. En effet, la concentration d’UFP/mL10 1 x 10 a souligné dans le protocole est essentiellement une figure d’orientation/consensus basée sur notre expérience. La concentration optimale peut être différent dans chaque expérience selon le type et la qualité de la biopsie et/ou la vitesse à laquelle il est traité. Nous suggérons donc tester au moins trois différentes (double) titres dans chaque expérience et choisir celui fournissant étiquetage optimale basée sur la visualisation sous le microscope de fluorescence.
Notre protocole/modèle est utile pour étudier les mécanismes impliqués dans la création et le développement précoce des lésions endometriotic. En dépit de la période de surveillance est limitée, le modèle est toujours utile d’étudier et de détecter les effets des composés pharmacologiques capables d’exercer des effets dramatiques sur la taille de la lésion dans un court laps de temps comme anti-angiogéniques ou des médicaments anti-ostrogénique. Le développement de méthodes plus efficaces et durables de l’étiquetage des tissus humains sont censés propager une surveillance non invasive comme une technique codifiée à explorer le potentiel thérapeutique d’un plus large éventail de médicaments en endométriose modèle préclinique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité par le biais de Miguel Servet programme [CP13/00077] a cofondé par le FEDER (fonds européen de développement régional) et attribué au docteur R. Gómez, ainsi que par Carlos III Institut de la santé subventions accordées Dr R Gómez [IP14/00547 et PI17/02329] et Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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