Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in Echtzeit
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung einer heterologen Mausmodell, in dem Fortschreiten der Endometriose in Echtzeit durch eine nicht-invasive Überwachung der Fluoreszenz emittiert von implantierten ektopische menschlichen endometrial Gewebes beurteilt werden kann. Zu diesem Zweck werden Spender Frauen laufenden Eizellspende Biopsien des menschlichen Endometrium entnommen. Menschlichen endometrialen Fragmente sind im Beisein von Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche cDNA für Reporter fluoreszierendes Protein mCherry kultiviert. Bei der Visualisierung beschriftet Gewebe mit einer optimalen Rate der Fluoreszenz nach Infektion werden anschließend für die Implantation im Empfänger Mäuse ausgewählt. Eine Woche vor der Implantation Operation Empfänger Mäuse oophorectomized und Estradiol Pellets sind subkutan aufgestellt, um das Überleben und Wachstum der Läsionen aufrecht zu erhalten. Am Tag der Operation sind Mäuse narkotisierten und peritonealen Hohlraum erreicht durch einen kleinen (1,5 cm) Schnitt durch die Linea Alba. Eindringmittel beschrifteten Implantate sind tweezed, kurz in Klebstoff getränkt und die peritoneale Schicht an. Einschnitte vernäht, und Tiere übrig, um für ein paar Tage zu erholen. Fluoreszenz emittierten nichtmalignem Implantate wird in der Regel nicht-invasiv alle 3 Tage für 4 Wochen mit einer in-vivo imaging-System überwacht. Variationen in der Größe von nichtmalignem Implantaten können in Echtzeit durch Quantifizierung des mCherry Signal und Normalisierung gegen die anfängliche Zeit-Punkt zeigen maximale Fluoreszenzintensität geschätzt werden.
Traditionelle präklinischen Nagetiere von Modellen der Endometriose nicht erlauben, nicht-invasive Überwachung der Läsion in Echtzeit aber eher erlauben Bewertung der Auswirkungen von Drogen am Endpunkt untersucht. Dieses Protokoll ermöglicht es, Läsionen in Echtzeit verfolgen und ist nützlicher, das therapeutische Potenzial von Drogen in präklinischen Modellen der Endometriose zu erkunden. Die wichtigste Einschränkung des so erzeugten Modells ist, dass nicht-invasives monitoring über längere Zeit wegen der episomal Ausdruck des Ad-Virus nicht möglich ist.
Introduction
Endometriose ist eine chronische gynäkologische Erkrankung, initiiert durch die Implantation der funktionellen Gebärmutterschleimhaut außerhalb der Gebärmutterhöhle. Ektopische Läsionen wachsen und entzündliche Prozessen führt zu chronischen Becken-Schmerz und Unfruchtbarkeit1zu induzieren. Es wird geschätzt, dass bis zu 10 – 15 % der Frauen im gebärfähigen Alter von endometriosis2 betroffen sind, und es ist in ca. 40 – 50 % der unfruchtbaren Frauen3. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für Endometriose sind nicht in der Lage, vollständig auszurotten Läsionen und nicht frei von Nebenwirkungen4,5. Die Forschung für eine effizientere Therapien braucht der Verfeinerung von bestehenden Tiermodellen der Endometriose in einer Weise, dass menschliche Läsionen können entsprechend nachgeahmt, und die Auswirkungen der Verbindungen auf die Größe der Läsion unter anderem genau beurteilt werden können.
Primas Modelle wurden verwendet, um die Endometriose zu imitieren, durch Implantation ektopische Läsionen, die histologisch identisch und an ähnlichen Standorten wie in Menschen6,7,8; jedoch im Zusammenhang mit ethische Bedenken und der hohen volkswirtschaftliche Kosten experimentieren mit Primaten Begrenzung ihrer Verwendung-9. Daher weiterhin die Verwendung von kleinen Tieren, vor allem Nagetiere, für die Umsetzung von in Vivo Modellen der Endometriose bevorzugt werden, da es Studien mit einer größeren Anzahl von Personen10,11erlaubt. Endometriose kann bei diesen Tieren induziert werden, durch die Transplantation entweder Stücke von Nagetier uterine Hörner ("homologe Modelle")12,13 oder menschlichen Endometrium/nichtmalignem Gewebe, ektopische Websites (heterologe Modelle)14 . Im Gegensatz zu Menschen Nager ihre endometrial Gewebes nicht vergossen und somit Endometriose nicht entwickelt werden kann spontan in dieser Arten. Homologe Maus, die Modelle der Endometriose kritisiert wurden die ektopische Maus uterine Gewebe implantiert spiegelt daher nicht die Eigenschaften des menschlichen nichtmalignem Läsionen15.
Entsprechende Physiologie der Endometriose kann in die heterologe Modelle der Endometriose nachgeahmt werden, wo frische menschliche endometrialen Fragmente immungeschwächte Tiere implantiert werden. In herkömmlichen heterologen Modellen werden die therapeutischen Wirkungen von Verbindungen des Interesses häufig am Endpunkt durch die Beurteilung der Größe der Läsion mit dem Einsatz von Bremssättel16bewertet. Eine offensichtliche Einschränkung ist, dass als solche Endpunkt Tiermodelle nicht zulassen Implantation Dynamik oder nichtmalignem Läsion Entwicklung im Laufe der Zeit zu studieren. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Verwendung der Bremssättel genaue Messungen der Größe der Läsion nicht zulässt. In der Tat ist der Standardfehler von Bremssättel zur Verfügung gestellt in der gleichen Größenordnung wie die Größe der Läsionen implantiert bei Mäusen, so beschränken die Kapazität dieser Werkzeuge, tatsächliche Abweichungen in der Größe zu erkennen (z.B. Millimeter).
Um solche Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier die Generation der heterologen Mausmodell der Endometriose in der implantiertes menschlichen Gewebe entwickelt, um ein Reporter m-Cherry fluoreszierende Protein zum Ausdruck bringen. Erkennung von das Fluoreszenzsignal mit einem entsprechenden Image-System ermöglicht nichtinvasive Überwachung der Läsion Status mit gleichzeitige Quantifizierung dieser Größe in Echtzeit. So sieht unser Modell klare Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt Modelle wie es bringt die Möglichkeit, nicht-invasive Überwachung in Echtzeit und die Möglichkeit, weitere Objektive und präzise Einschätzung der Variationen in Größe der Läsion führen.
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Protocol
Die Verwendung von menschlichem Gewebeproben wurde von Institutional Review Board und Ethik-Kommission der Hospital Universitario La Fe genehmigt. Alle Patienten zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung. Die Studie an Tieren institutionelle Tier Pflege des Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia genehmigt wurde, und alle Eingriffe wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Säugetieren aus den nationalen Ämtern der Gesundheit.
(1) endometrial Gewebes Erfassung und Vorverarbeitung
- Erhalten Sie eine gute Qualität Biopsie des menschlichen Endometrium Absaugen mittels einer Kanüle mit einer Saugvorrichtung verbunden. Gießen Sie die Biopsie in ein Fläschchen mit 10 mL steriler Kochsalzlösung und waschen mit sanften manuellen Agitation.
Hinweis: Verfahren wie Sie erhalten gute Qualität Biopsien wurden zuvor beschriebenen17. - Waschen Sie die Biopsie der verbleibenden Blut oder Schleim. Wiederholen Sie den Vorgang durch das Gießen des Gewebes, Fläschchen mit frische Kochsalzlösung möglichst viele Zinken nach Bedarf bis Gewebe sauber eingehalten wird.
- Transfer Biopsie Fragmente mit einem gesunden Aussehen in eine Lösung mit 10 mL komplett Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung.
- Gießen Sie den Inhalt in einer 10 cm Petrischale und fahren Sie mit der Gewebe in 5 – 10 mm3 Stücke mit einem Paar Skalpelle zu hacken.
(2) adenoviralen Transfektion von endometrialen Fragmente
Hinweis: Alle Materialien, die dabei eingesetzt werden sollten im Voraus in der Haube eingeführt werden. Nehmen Sie alles, was nicht geht, im Prozess verwendet werden und eine Flasche mit Bleichmittel. Sämtliches Material, das in Kontakt mit der adenoviralen Vektor kommt muss mit dem Bleichmittel desinfiziert werden, bevor im Biohazard Container verwerfen.
- Sobald die Biopsie gehackt hat, nehmen Sie eine neue Petrischale. Pipette mehrere 30-50 µL DMEM Tropfen Ausbreitung die ganze Schüssel. Lassen Sie genügend Abstand zwischen Tropfen, so dass sie nicht in Berührung kommen.
- Unterstützt mit einer Nadel Spritze, legen Sie ein Stück des Fragments in jedem der mittleren Tropfen.
Hinweis: Jeder Tropfen sollte ein einziges Stück des Endometriums enthalten. - Bereiten Sie die Ad-mCherry-Arbeitslösung durch Verdünnung 01:20 von mCherry adenoviralen Stammlösung [1 x 1010 Pfu/mL]) in DMEM ohne Antibiotika (DMEM + 10 % gefiltert FBS) mittlere.
- 100 – 200 μL der Ad-mCherry-Lösung pro Bohrloch auf eine 96-Well-Platte, füllen so viele Brunnen wie Fragmente in der Petrischale Tropfen (Schritt 2.2 sind) zu verzichten. Darüber hinaus füllen Sie mindestens 3 Brunnen mit Adenoviren kostenlose DMEM Medium als Negativkontrolle.
- Unterstützt mit einer Nadel Spritze, jedes der Fragmente in der Petrischale (Schritt 2.2) zu jedem der Brunnen mit Ad-mCherry-Lösung in der 96-Well-Platte zu übertragen.
- Legen Sie die 96 Well-Platte mit der endometrialen Fragmente mit Ad-mCherry-Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 16 h.
- Auswaschen der verbleibenden Adenoviren in das Medium durch die Übertragung von Gewebe in eine neue 96-Well-Platte mit kompletten DMEM Medium gefüllt (mit Antibiotika-Antimykotika, frei von Adenoviren) und mit 5 % CO2 für 24 – 48 h bei 37 ° C inkubieren.
Hinweis: Denken Sie daran, mit Bleichmittel decken alle well-Platten und Tipps, die in Kontakt mit Ad-Virus kam vor verwerfen in den Biohazard Behälter. - Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie es unter dem Fluoreszenzmikroskop auf 568 nm (Rot-Kanal) für optimale Kennzeichnung zu testen.
- Wählen Sie die brillantesten Fragmente und legen Sie sie in eine neue 96-Well-Platte mit frischen kompletten DMEM Medium (Adenoviren mit Antibiotika-Antimykotika, kostenlos).
- Dichtplatte gut mit einem Kunststoff Paraffin-Film und in den spezifischen-Pathogen-freies Tier Bereich für die Implantation der endometrialen Fragmente in Empfänger Tiere zu transportieren.
3. Generation von der Endometriose-Maus-Modell
Hinweis: Verwenden Sie 6 – 8 Wochen-alte Athymic nackt (oder ähnliche immungeschwächten Stämme) weiblichen Mäusen unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies, als Empfänger Tiere untergebracht. Zur Vermeidung von Zyklus-abhängige Hormonschwankungen und gleichzeitig Kraftstoff Läsion Wachstum mit Estradiol sind Tiere ovariectomized und platzierten mit 60-Tage-Release-Kapseln enthalten 18 mg 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Zurückliegend und Pellet Platzierung müssen mindestens eine Woche im Vorfeld der Pfropfung endometrialen Fragmente in den Empfänger Tieren durchgeführt werden.
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Zurückliegend
Hinweis: Bereiten Sie chirurgische sterilisierte Material in eine Kapuze. Anästhesie-Geräte und eine postoperative Erholung Zone bereit im selben Raum vorbereiten.- Führen Sie eine subkutane Injektion von Morphin-Derivat in einer Dosis von 5 mg/kg pro Maus. Lassen Sie die Mäuse ausruhen für 30 min nach der Injektion, also als Analgetika Wirkungen der Droge manifestiert werden können.
- Verbinden Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung und lassen Sie Sauerstoff und Isofluran (2 % mg/kg) Strom für ein paar Minuten in einer versiegelten Anästhesie-Kammer.
- Stellen Sie das Tier in die Isofluran-Narkose-Kammer. 3 – 5 min warten Sie und überprüfen Sie, dass Tiere vollständig betäubt sind, indem eine seiner Pfoten. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich und erhalten Sie Anästhesie zu, indem man eine Maske mit kontinuierlichen Fluss von Isofluran Gas für die Atemwege.
- Führen Sie nach der Desinfektion mit Chlorohexidine einen quer 0,5 cm kostalen Schnitt etwa auf der Höhe der Hüfte mit einer scharfen Schere.
- Trennen Sie die Haut vom Muskel erhalten Zugang zur Bauchhöhle, identifizieren weiße Fettpolster, die den Eierstock umgibt und Zurückziehen des Eierstocks mit Dissektion Zangen.
- Einen Knoten um die Eileiter mit resorbierbaren Naht und ziehen Sie es dafür geeignete Blutstillung vor den Eierstock besteuert.
- Schließen Sie die Muskelschicht mit 6-0 resorbierbaren Naht, und schließen Sie dann die Haut mit 6-0 nicht resorbierbaren Naht. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
- Wiederholen Sie den Vorgang um die Contra seitliche Eierstock zu entfernen.
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Estradiol pellet-Implantat
Hinweis: Achten Sie darauf, dass das Tier während der Operation zurückliegend, Pellets an diesem Punkt setzen betäubt ist.- Unmittelbar nach dem Abschluss des Verfahrens zurückliegend reinigen Sie die Haut mit einer antiseptischen Lösung rund um den Hals und machen Sie einen Schnitt quer subkutane klein (0,5 cm) mit einer scharfen Schere im Nacken.
- Verwenden Sie die Schere, um die Haut vom Muskel, so dass eine Tasche groß genug, um die Platzierung der Pellets zu ermöglichen zu zergliedern.
- Legen Sie die Tablette mit 18 mg 17β-E2 und die Haut mit einer 6-0 nicht resorbierbaren Naht zu Naht. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
- Legen Sie das Tier im Bereich Erholung und verwalten Sie eine optimale Dosis der lang anhaltende Analgesie, die Erholungsphase zu erleichtern.
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Endometrial Implantat-Chirurgie
Hinweis: Lassen Sie mindestens einen Zeitraum von sieben Tagen Quarantäne um vollständige Genesung von Tieren nach zurückliegend vor Beginn der Endometrium Fragments Implantation Operation zu ermöglichen. Für optimale Synchronisation mit Kennzeichnung des Gewebes sammeln Sie die Biopsie 2 – 3 Tage vor der Implantation Operation um langfristige Kultur der Explantate zu vermeiden.- Bereiten Sie die OP in der Freizone spezifischen Erreger im Voraus. Bereiten Sie die Haube mit allen erforderlichen chirurgisches Material, das Anästhesie-Equipment und die postoperative Erholung Zone auch.
- Bringen Sie die Tiere in den Raum zu, führen Sie eine subkutane Injektion von Morphin-Derivat in einer Dosis von 5 (mg/kg) in jeder Maus. Lassen Sie die Mäuse für 30 min nach der Injektion ruhen, so dass Analgetika Effekte der Droge manifestiert werden können.
- Verbinden Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung und lassen Sie Sauerstoff und Isofluran (2 % mg/kg) Strom für ein paar Minuten in einer versiegelten Anästhesie-Kammer.
- Bewegen Sie vor Beginn der Operation sich die Platte mit Gewebekulturen beschriftet Fragmente (aus Schritt 2.10) in die Haube entsiegeln sie und gießen Sie die Fragmente in einer Petrischale zur einfacheren Handhabung.
- Stellen Sie das Tier in die Isofluran-Narkose-Kammer. 3 – 5 min warten Sie und überprüfen Sie, dass Tiere vollständig betäubt sind, indem eine seiner Pfoten. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich und erhalten Sie Anästhesie zu, indem man eine Maske mit kontinuierlichen Fluss von Isofluran Gas für die Atemwege.
- Ort der narkotisierten Tier gerecht werden. Die ventralen Fläche zu desinfizieren. Führen Sie einen longitudinale 1,5 cm Schnitt im Bauch mit einer scharfen Schere und trennen Sie die Haut aus dem Muskel zu. Führen Sie dann einen longitudinale 1,5 cm Einschnitt in der Muskulatur auf der Bauchhöhle zugreifen.
- Halten Sie den linken Rand der muskulösen Bauch Wand mit Mini-Zange und Falten Sie es versuchen, die Innenfläche des Bauchfells nach außen verfügbar zu machen.
- Nehmen Sie ein Endometriumkarzinom Implantat mit Mini-Pinzette, ein n-Butyl-Ester Cyanacrylat-Klebstoff kurz einziehen Sie und legen Sie sie auf das Peritoneum, wo es angebracht wird, erhalten. Für ein paar Sekunden trocknen lassen. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.6 und 3.3.7 um ein Implantat auf der kontralateralen Seite des Bauchfells zu platzieren.
- Schließen Sie die Muskelschicht mit einer resorbierbaren 6-0-Naht, und anschließend der Haut mit einem nicht resorbierbaren Naht 6-0. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
- Legen Sie das Tier im Bereich Erholung und verwalten Sie eine optimale Dosis der lang anhaltende Analgesie zu.
(4) in Vivo Fluoreszenz Imaging mit einem In Vivo Imaging-System
- In-vivo imaging Systemgerät schalten Sie ein, initialisieren Sie das Programm und ermöglichen Sie die CCD-Kamera für ein paar Minuten abkühlen lassen.
- Bereiten Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung. Öffnen Sie Isofluran bei 2 % für ein paar Minuten um die Narkose Kammer füllen. Bereiten Sie die Post-Anästhesie-Erholung-Zone.
- Sobald das Programm gestartet hat und die CCD-Kamera abgekühlt sind, klicken Sie auf das Imaging-Assistent -Tool: eine Tutorial beginnt mit einer Reihe von aufeinander folgenden Windows angezeigt, jeweils entsprechend einen Parameter von Interesse mit mehreren Möglichkeiten gewählt werden mit einem Klick in das entsprechende Feld ein. Vorwärts durch das Tutorial durch Auswahl der entsprechenden Felder in jedem Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um zum nächsten Satz von Parametern mit der folgenden Sequenz bewegen.
- Wählen Sie das Epiluminescence Feld für die Fluoreszenz-Parameter, wählen Sie das mCherry Feld für die Paare-Parameter "Filter". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Modus zu fotografieren und Konzentrieren sich bestätigen und aktivieren Sie das automatische Belichtung Parameter.
- Sobald das Gerät eingerichtet hat, verschieben Sie ein Tier in der Anästhesie-Kammer. Wenn vollständig betäubt, übertragen Sie das Tier in der in-Vivo imaging System Käfig zu und legen Sie sie seitlich oben mit dem Kopf in ein Röhrchen mit dem Anästhesiegerät verbunden. Schließen Sie den Deckel, und klicken Sie auf erfassen für die Überwachung.
- Die Bilder erscheinen (insgesamt fünf Bilder, ein Bild für jedes Paar Filter ausgewählt) und Daten zu speichern, indem Sie auf die Schaltfläche " Speichern unter ". Bewegen Sie die Maus auf den Bereich der Post-Narkose Erholung. Wiederholen Sie den Vorgang mit den übrigen Tieren.
- Wiederholen Sie die Überwachung zwei oder dreimal pro Woche zum Anschluß das Signal entsprechend im Laufe der Zeit.
- Fahren Sie fort, das Tier am Ende den zeitlichen Verlauf von CO2 Erstickung zu opfern.
(5) Quantifizierung der In Vivo Fluoreszenz-Bilder
-
Segregation der tatsächliche Fluoreszenz durch entmischen Bild:
- Öffnen Sie die In-Vivo Imaging Analyse Softwareprogramm gekoppelt.
- Wählen Sie die Datei "Sequenceinfo", um die Analyse zu starten. Zwei Fenster werden angezeigt: "Sequenzansicht" und "Werkzeugpalette". Wählen Sie die Werkzeugpalette und sobald das Menü wählen Sie die folgenden Optionen.
- Wählen Sie Korrekturen aus , und klicken Sie auf das Kontrollkästchen Adaptive FL Hintergrundabzug , die unerwünschte fluoreszierende Signale aus den leuchtenden Bilddaten zu entfernen. Wählen Sie die Schwelle von größtem Interesse und klicken Sie auf festlegen.
- Klicken Sie auf Spectral Unmixing, wählen Sie die Wellenlängen von Interesse, die Methode für unmixing (Bibliothek, geführte, automatische oder manuelle) ausgewählt und klicken Sie dann auf starten Unmix.
- Wählen Sie das entsprechende mCherry Signal Unmixed -Bild, und doppelklicken Sie auf. Ein neues Fenster erscheint mit das letzte Bild des Signals von Interesse.
- Wiederholen Sie Schritt 5.1.3.
- OPTIONAL: Wenn ein repräsentatives Bild (JPEG) des Unmix Ergebnisses benötigt wird, wählen Sie die gewünschten Einstellungen in Tool-Palette | Bild einstellen (Farbe, binning, Kontrast, etc.), und klicken Sie dann auf Exportieren Sie Grafiken im Fenster "Unmix" die aktuellen Bildansicht als Bild exportieren.
- Speichern Sie die ungemischte Datei: Datei | Speichern als | Wählen Sie Ordner und Ok.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Rest der Überwachung Tage und mit allen Tieren.
-
ROIs einrichten und Quantifizierung zu signalisieren
- Klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie die ungemischte Datei (siehe Schritt 5.1.8) von Interesse, die analysiert werden. Ein neues Fenster wird angezeigt.
- Klicken Sie auf Add To List um die ungemischten Dateien von jedem Tier zu unterschiedlichen Zeitpunkten und klicken dann auf Als A Lastgruppe. Alle Bilder müssen als eine einzelne Sequenz angezeigt.
- Weiter zur Werkzeugpalette Fenster: Wählen Sie aus der Box ichgerne Maßstab um alle Bilder in der gleichen Größenordnung zu erhalten.
- Doppelklick in ein Bild der Sequenz und einen ROI in der Zone mit der folgenden Sequenz zu erstellen. Zur ROI-Tools und wählen Sie Contour und Auto 1 Option, klicken Sie auf die Form des Kreises erscheinen, legen Sie es in der Mitte das Fluoreszenzsignal und klicken Sie dann auf Erstellen auf das angezeigte Fenster.
Hinweis: Dies automatisch highlights Pixel mit einer Intensität der Fluoreszenz über Hintergrundwerte (d.h. Läsion) und erzeugt eine Form, deren Gebiet die skizzierten Pixel umfasst. - Die erstellten ROI-Form kopieren und Einfügen in ein Hintergrund-Zone wo kein Signal vorhanden ist.
- Klicken Sie auf Maß ROIs | Wählen Sie alle Werte der Fluoreszenzintensität anzuzeigen. Fahren Sie mit Datenwerte mit der Maus auswählen, Rechte Maustaste klicken, drücken kopieren und auf einem Arbeitsblatt einfügen.
6. Datennormalisierung (Fluoreszenzsignal)
- Wählen Sie die erste Zeitpunkt, an welches Signal Intensität maximal. Gehen Sie zum Signal zu jedem Zeitpunkt zu normalisieren, mithilfe der Formel:
Signal-Intensität zu jedem Zeitpunkt / maximale Signalstärke beobachtet im Laufe der Zeit) X 100.
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Representative Results
Hier beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen einer heterologen Modell der Endometriose, in dem die Architektur der Läsionen durch Implantation von Eindringmittel beschrifteten Teile des menschlichen Endometrium in immungeschwächte Mäuse erhalten bleibt, damit nicht-invasive Überwachung der Läsion Progression. Kennzeichnung von endometrialen Fragmente wird durch Infektion mit Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche mCherry, ein Protein emittierende Fluoreszenz im nahen Infrarotbereich erreicht. In Abbildung 1zeigen wir Vertreter, die Bilder der menschlichen endometrialen Fragmente infiziert mit Ad-mCherry unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Zur Veranschaulichung sind beschriftet und nicht-markierten Fragmente enthalten, so dass Unterschiede Fluoreszenz zwischen infizierten und nicht infizierten Gewebe (Autofluoreszenz) festgestellt werden können. Während der Überwachung, neben der Referenzwellenlänge für mCherry, fluoreszierende Bilder mit verschiedenen Paaren von Erregung/Emission Wellenlängen Filtern (Abbildung 2) unternommen, um das charakteristische Fluoreszenz Emission Profil von Geweben zu definieren. Der Zweck dieser Aktion ist es, "tatsächliche Fluoreszenz emittiert durch Läsionen von Hintergrund und Autofluoreszenz Host Gewebe abgegebene und Narbe entstanden während der Operation bzw. unmix". Ein anschauliches Beispiel für den Unmix-Prozess ist in Abbildung 3dargestellt. Schätzungen der Variation in der Größe der Läsion erfolgt durch Quantifizierung mit fluoreszierenden Signalisierung emittiert durch Läsionen im Laufe der Zeit normalisieren. Zu diesem Zweck werden Bilder der Überwachung mit rohen Fluoreszenz emittiert von Tieren während jeden Zeitpunkt zunächst follgendes (Abbildung 4) in einer einzigen Datei zusammengeführt. Anschließend wird Fluoreszenz unvermischt, normalisierte und vertreten wie ein Falschfarbenbild (Abbildung 5). Zu guter Letzt ROIs entsprechend spezifische Läsion und Hintergrund Signalisierung werden automatisch vom Programm erkannt und quantifiziert (Abbildung 6). Hintergrund-ROI Signalisierung von Läsion ROI Signal- und Ergebnisse der Intensität bei jedem Punkt werden normalisiert, gegen die Zeitpunkt an der Intensität ist maximal subtrahiert wird (Abbildung 7). Am Ende des Überwachungsprozesses beigefügt einige Wochen nach der Operation Mäuse geopfert und tragfähige Implantat zurückgewonnen werden die Maus Peritoneum (Abbildung 8).
Abbildung 1: Visualisierung der endometrialen Fragmente mit Fluoreszenzmikroskop infectionem Ad-mCherry. (A) menschlichen Endometrium Fragments mit Ad-mCherry bei 37 ° C und 5 % CO2 während 24 h als eine positive Probe inkubiert. (B) menschlichen Endometrium Fragments inkubiert bei 37 ° C und 5 % CO2 ohne Ad-mCherry als Negativkontrolle Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Raw imaging Fluoreszenz emittierten beschriftet Fragmente in Mäuse implantiert. Bild zeigt repräsentative Darstellung der rohen Fluoreszenzsignal emittiert durch das gleiche Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt. Bilder entsprechen Screenshots mit Software gekoppelt, um eine in-vivo imaging Systemgerät während einer Überwachungssitzung erzielt. Jedes Paneel mit Mäusen (nummeriert von 1 – 5 in der linken Ecke) entspricht die Fluoreszenz beobachtet mit einem unterschiedlichen spezifischen Erregung/Emission paar Filter für den Erwerb der Bilder. Panel auf der rechten Seite (Tool-Palette) zeigen Fluoreszenz-Parameter für die Aufnahme von Bildern ausgewählt Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Hintergrund Vs spezifische Fluoreszenz emittiert durch Läsionen entmischen. Bild zeigt repräsentative Bilder des unmixing Prozesses durchgeführt, um die tatsächliche Fluoreszenz von Läsionen, die mit dem in-vivo imaging System sezieren gekoppelt Software. Grafik auf der linken Seite kennzeichnen normalisierte bestimmte Profile der Fluoreszenzemission durch Narbe (grüne Linie, UMX1), Läsionen (rote Linie, UMX2) und Wirtsgewebe (blaue Linie, UMX3 Panel). Fluoreszenzintensität an verschiedenen Emission Wellenlängen (X-Achse) ist in Einheiten von strahlenden Effizienz (Y-Achse) vertreten. Beachten Sie wie jede spezifische Struktur (d. h. Narbe, mit der Bezeichnung Läsionen und Wirtsgewebe) strahlt eine unterschiedliche Fluoreszenz-Profil die Identifizierung und Trennung von ihnen speziell Form ermöglicht miteinander. Auf der rechten Seite, Fluoreszenz aus spezifischen Emissionen Profile für Narbe (UMX1) Einleitung, sind Läsionen (UMX2) und Wirtsgewebe (UMX3) überlagert auf Foto Bilder von Mäusen gezeigt. Eines zusammengesetzten Bild (Composite) ist auch für illustrative Zwecke zu bezeichnen, die Segmentierung der Fluoreszenz emittiert durch Läsionen von emittiert durch Narben oder Host Gewebe enthalten. Mittleren Bereich zeigt Parameter ausgewählt für entmischen mit der Image-Software, die in-vivo imaging-Gerät gekoppelt Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Zeit Kurs Überwachung der rohen Fluoreszenz emittiert durch Läsionen. Panel zeigt repräsentative Bilder von rohen Fluoreszenz emittiert von einem einzigen Mausklick im Laufe der Zeit mit beschrifteten menschlichen Läsionen (glänzende gelbe Flecken) implantiert. Zeitpunkten nach der Operation bei der Überwachung durchgeführt wurde sind als "Tag (Zahl)" bezeichnet. Emission Ad Erregung paar Filter zur Überwachung eingesetzt werden in jedem Panel/Bild angegeben. Jede Platte wird durch einen bestimmten Code (BKG) identifiziert, im oberen Teil mit Informationen rund um das Datum, an dem Fluoreszenz erworben wurde.
Abbildung 5: Zeitüberwachung Kurs der Fluoreszenz emittiert durch Läsionen normalisiert. Repräsentative Bilder entsprechend unvermischt, normalisierte fluoreszierende Signalisierung durch menschliche Läsionen (Flecken mit Regenbogen Farbe) während der Zeit in einem einzigen Mausklick überlagert emittiert Kursdauer (Tage nach der Operation). Zeitpunkten nach der Operation bei der Überwachung durchgeführt wurde sind als "Tag (Zahl)" bezeichnet. Jede Platte wird durch einen bestimmten Code (BKG) identifiziert, im unteren Teil mit Informationen rund um das Datum, an dem Fluoreszenz erworben wurde. Regenbogen-Palettenfarbe auf der rechten Seite identifiziert Fluoreszenzintensität (strahlende Effizienz) von Läsionen zu jedem Zeitpunkt emittiert. Beachten Sie wie starke Fluoreszenzintensität während der Anfangszeit Punkte (d. h. rote Farbe in der Mitte der Läsionen an den Tagen 1,5 und 8) sinkt im Laufe der Zeit (d. h., Blau Farbe in Läsionen an den Tagen 20 und 25). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Verwendung des ROIs für die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität bei Läsionen im Laufe der Zeit. Abbildung zeigt Panel von Bildern der normalisierten Fluoreszenz emittierten Läsionen in einem einzigen Mausklick im Laufe der Zeit (d. h., Abbildung 5) mit dem Zusatz des ROIs (Abgrenzung Läsionen und Hintergrund) für die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität. ROI-1 und ROI 2 identifizieren die Höhe der Fluoreszenz emittiert von jedem der beiden Läsionen im Laufe der Zeit. BKG bestimmen die Höhe der Fluoreszenz emittierten Wirtsgewebe (Hintergrundfluoreszenz) im Laufe der Zeit. Hintergrundfluoreszenz wird für Zwecke der Quantifizierung von ROIs abgezogen. Zeitpunkten nach der Operation bei der Überwachung durchgeführt wurde sind als "Tag (Zahl)" bezeichnet. Bilder zu jedem Zeitpunkt erworben sind war beschriftet mit einem bestimmten Code (BKG) am unteren Rand jeder ein enthaltenden Informationen im Zusammenhang mit dem Datum, an welchem Fluoreszenz erworbenen (ersten acht Ziffern nach BKG Detaildaten für Jahr (2014)-Monat (10) und -Tag (10 bis 31)) , einen individuellen Identifikationscode (letzten 6 Ziffern) und die speziellen Profile der Fluoreszenzemission verwendet für unmixing (UMX2) Rainbow Palettenfarben auf der rechten Seite bietet eine visuelle Skala der Fluoreszenzintensität (strahlende Effizienz) emittiert durch Läsionen an jedem Zeitpunkt. Hinweis wie Fluoreszenz-Intensität-Werte in den beiden Läsionen (ROI1 und ROI2) höher sind die Ausgangszeit Punkte (Tage 1 und 5) und zerfällt im Laufe der Zeit, die niedrigsten Werte am Ende Zeitpunkte zu erreichen (20 und 25 Tage). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Normalisierung der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit. Im oberen Teil der Tabelle anschaulichen Beispiel für die Werte der Fluoreszenzintensität (strahlende Effizienz) emittiert durch zwei mCherry mit der Bezeichnung Läsionen (ROI1 und ROI2) in eine Maus (R25) implantiert. Überwachung der Fluoreszenz wurde im Laufe der Zeit an verschiedenen Tagen nach der Operation (D5-D25) durchgeführt. D5 - Grafik unten zeigt typische Muster der normalisierten Fluoreszenz emittiert durch Läsionen infiziert mit mCherry im Laufe der Zeit verfallen. Y-Achse zeigt Werte von Fluoreszenz normalisiert, um den Prozentsatz des Verfalls express mithilfe der Formel (Signal Intensität zu jedem Zeitpunkt / maximale Signalstärke beobachtet im Laufe der Zeit) X 100. Zeit zeigt (Tage (Dx) nach Implantation Operation) auf die Fluoreszenz überwacht wurde in der X-Achse angegeben sind. Hinweis: erste Erhöhung der Signalisierung während der ersten 24 Stunden nach der Operation, Stabilisierung der Läsion, die Spitze im Fluoreszenzintensität um D1-D5 und seine anschließende Zerfall durch episomal Ausdruck der mCherry Laufe der Zeit entspricht, klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur sehen.
Abbildung 8: makroskopische Erscheinungsbild der implantierten nichtmalignem Läsionen. Vertreter Bilder zeigen makroskopischen aussehen nichtmalignem Läsionen in Mäuse am Ende des Überwachungsprozesses auf Opfer implantiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Umsetzung von einem Tiermodell der Endometriose in die Architektur der Implantation Läsionen Architektur bewahrt wird während gleichzeitig ermöglicht Echtzeit-Bewertung der Fluoreszenz emittiert durch mCherry mit der Bezeichnung endometrial Gewebes. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines speziellen in-vivo imaging-System und zugehöriger Software nicht-invasiv Fluoreszenz emittierten die beschrifteten Läsion einzuschätzen. Jeder Benutzer sollte das Protokoll abhängig von den spezifischen imaging-Gerät und die zugehörige Software verfügbar in ihrer Institution anzupassen. Die Überwachung erfolgt bei narkotisierten Tieren durch eine Isofluran Gas Anästhesiegerät gekoppelt an eine in-vivo imaging-System. Um Interferenzen mit Auto-Fluoreszenz emittiert von Wunden zu vermeiden, empfiehlt es sich, starten Sie die Überwachung Läsionen Fluoreszenz mindestens drei Tage nach der Implantation Operation.
Heterologe Mausmodelle der Endometriose, die ähnlich wie das hier abgebildete wurden zuvor beschrieben, besteht in der Implantation endometrialen Fragmente beschriftet mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP)18,19. Die Verwendung von mCherry als Reporter für die Kennzeichnung des menschlichen Gewebes bietet jedoch einen Vorteil gegenüber GFP wegen der verstärkten Gewebe eindringen der ehemaligen. Aufgrund seiner größeren Emissionsspektrum und höhere Photostabilität strahlt mCherry ein heller Signal, das für die Visualisierung der intraperitonealen Fragmente besser geeignet ist.
Aufgrund seiner geringen Größe Adenoviren sind die Träger der Wahl für Infektion (z. B. Beschriftung) der ganze Gewebe Stücke wie die bieten akzeptable Diffusion durch 3D-Strukturen. Sogar mit, dass der Anteil der infizierten Gewebezellen nicht höher als 30 – 35 %. So setzt die Begrenzung dieses Modells auf die ineffiziente Kennzeichnung von Gewebe und zusätzlich die transiente Expression durch Adenoviren erreicht. In der Tat kann Fluoreszenz über 4 – 6 Wochen überwacht werden, als es aufgrund der episomal transiente Expression des Ad-Virus nach und nach verblasst. Effizienz der Kennzeichnung und die Dauer der Überwachung können durch stören das Spendergewebe und infizieren epithelialen/Stromazellen isolierte Einzelzellen mit Ad-Virus vor in Empfänger Mäuse19,20injiziert werden erhöht werden. Ein solcher Ansatz reduziert jedoch das Ausmaß an dem Tiermodell die Physiologie der Endometriose imitiert, vorausgesetzt, dass menschliche ektopische Läsionen nicht in eine ungeordnete Ansammlung von epithelialen/Stromazellen Einzelzellen, sondern in gut strukturierten bestehen nichtmalignem Gewebe.
In diesem Protokoll ist die wichtigste Schritt, die Kennzeichnung des Gewebes und die meisten speziell die Bestimmung der entsprechenden Konzentration des Ad-Virus benötigt für optimale Infektion. 1 x 1010 Pfu/mL Konzentration darauf hingewiesen, in dem Protokoll ist meist eine orientative/Konsens Abbildung basierend auf unserer Erfahrung. Die optimale Konzentration abweichen in jedem Experiment abhängig von der Art und Qualität der Biopsie bzw. wie schnell dies verarbeitet wird. So empfehlen wir mindestens drei verschiedene (zweifach)-Titer in jedem Experiment testen und wählen Sie die Bereitstellung von optimalen Kennzeichnung anhand der Visualisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Unser Protokoll/Modell ist nützlich, um die Mechanismen beteiligt an der Gründung und frühe Entwicklung der nichtmalignem Läsionen zu studieren. Trotz der Zeitraum der Überwachung ist eingeschränkt, das Modell ist immer noch nützlich zu studieren und zu erkennen, die Auswirkungen von pharmakologischen Substanzen dramatische Auswirkungen auf die Größe der Läsion in kurzer Zeit z. B. Anti-angiogenetische oder antiestrogenic Medikamente ausüben. Die Entwicklung von effizienten und dauerhaften Methoden der Kennzeichnung von menschlichen Gewebes sollen verbreitet, nicht-invasives monitoring als eine konsolidierte Technik, um das Potenzial eines breiteren Spektrums von Drogen in präklinischen Modell Endometriose therapeutische.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit durch Miguel Servet Programm [CP13/00077] mitgegründet von FEDER (europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und Dr. R. Gómez sowie von Carlos III Institute of Health Stipendien vergeben Dr R Gómez [PI14/00547 und PI17/02329] und Prof. A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
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