Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58358
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3,4, 1
1Instituto de Investigación Sanitaria, 2Unidad de Animalario del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 3Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología, Universidad de Valencia, 4Servicio de Obstetricia y Ginecología, Hospital Clínico Universitario de Valencia

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן אמת

Abstract

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליישום מודל העכבר heterologous שבו ההתקדמות של אנדומטריוזיס יכול להיות מוערך בזמן אמת באמצעות ניטור לא פולשנית של זריחה הנפלטת מושתל חוץ רחמי רקמה רירית הרחם אנושית. למטרה זו, ביופסיות של רירית הרחם האנושי מתקבלים מתרומה oocyte מתמשך של התורם נשים. קטעי רירית הרחם אדם מתורבתים בנוכחות adenoviruses מתוכנן cDNA אקספרס עבור mCherry חלבון פלואורסצנטי הכתב. על ויזואליזציה, תוויות רקמות עם שיעור אופטימלית של קרינה פלואורסצנטית לאחר זיהום נבחרו לאחר מכן עבור ההשתלה בעכברים הנמען. שבוע לפני ניתוח ההשתלה, עכברים הנמענים הם oophorectomized, כדורי אסטרדיול ממוקמים subcutaneously לקיים את הישרדות וצמיחה של נגעים. ביום של הניתוח עכברים הם מרדימים, ואת הצפק חלל לגשת דרך חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) על ידי לינאה-אלבה. שתלים fluorescently שכותרתו tweezed, בקצרה טבולים בדבק, מחוברת לשכבה הצפק. חתכים ומאחים והשאירו חיות להתאושש במשך כמה ימים. קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי שתלים endometriotic בדרך כלל לא פולשני מנוטר כל 3 ימים 4 שבועות עם מערכת הדמיה ויוו. וריאציות בגודל של endometriotic שתלים יכול להיות בזמן אמת לפי אומדן כימות של mCherry אות ו נורמליזציה נגד הראשונית הזמן נקודת-מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקסימלי.

מכרסמים פרה המסורתי של מודלים של אנדומטריוזיס אינם מאפשרים פיקוח בלתי פולשני של הנגע בזמן אמת אבל מאפשר הערכת ההשפעות של תרופות לבדיקה על נקודת הקצה. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחר נגעים בזמן אמת והוא שימושי יותר לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של תרופות במודלים פרה של אנדומטריוזיס. המגבלה העיקרית של המודל כך שנוצר הוא כי ניטור פולשני אינו אפשרי על פני תקופות זמן בשל ביטוי episomal של Ad-וירוס.

Introduction

אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית גניקולוגיות שיזם ההשתלה של רירית הרחם פונקציונלי מחוץ חלל הרחם. חוץ רחמי נגעים גדלים, זירוז תהליכים דלקתיים שמוביל כרונית האגן כאב שרירים פוריות1. ההערכה היא כי עד כדי 10 – 15% מהנשים בגיל הפריון הושפעו endometriosis2, זה קיים כ- 40%-50% של נשים עקרה3. טיפולים שוטפים תרופתי אנדומטריוזיס הינם מסוגל לחסל לחלוטין נגעים לא ללא תופעות לוואי4,5. המחקר עבור טיפולים יעילים יותר מחייב של העידון של הדגמים בעלי חיים הקיים של אנדומטריוזיס באופן כזה כי יכול להיות חיקה כראוי האנושי נגעים, ההשפעות של תרכובות על גודל הנגע בין היתר יכול להידרש מקרוב.

פרימטים הדגמים השתמשו כדי לחקות אנדומטריוזיס מאת נגעים חוץ רחמי implanting זהה בהיסטולוגיה, באתרים דומים כמו בני אדם6,7,8; עם זאת, חששות אתיים והעלויות כלכלית גבוהה קשורה ניסויים עם מגבלת פרימטים שלהם לשימוש9. כתוצאה מכך, השימוש של בעלי חיים קטנים, בעיקר מכרסמים, ליישום בבית-vivo מודלים של אנדומטריוזיס ימשיך להיות העדיף שכן היא מאפשרת לימודי עם מספר גדול של אנשים10,11. אנדומטריוזיס יכול להיגרם בבעלי חיים אלה על ידי משתילים חתיכות של מכרסמים הרחם קרניים ("מודלים הומולוגיים")12,13 או רקמה רירית הרחם/endometriotic אנושית לאתרים חוץ רחמי (מודלים heterologous)14 . בניגוד לבני אדם, מכרסמים אל תזילו רקמת רירית הרחם שלהם, ובכך אנדומטריוזיס לא ניתן לפתח באופן ספונטני במינים אלו. לכן, העכבר הומולוגי מודלים של אנדומטריוזיס ננזף בשל העובדה כי מושתל רקמת הרחם חוץ רחמי העכבר אינו משקף את מאפייני האנושי נגעים endometriotic15.

פיזיולוגיה המתאים של אנדומטריוזיס יכול חיקה במודלים heterologous של אנדומטריוזיס איפה טריים האנושי קטעי רירית הרחם מושתלים לתוך חיות immunodeficient. במודלים heterologous המקובלת, ההשפעות הטיפוליות של תרכובות עניין הם בדרך כלל לאומדן בנקודת הקצה ההערכה של גודל הנגע בעזרת מחוגה16. מגבלה ברור הוא, ככזה, הקצה של מודלים בעלי חיים אינם מאפשרים לימוד הדינמיקה ההשתלה או התפתחות הנגע endometriotic לאורך זמן. מגבלה נוספת היא כי השימוש מחוגה אינו מאפשר מדידות מדויקות של גודל הנגע. אכן, שגיאת התקן שסופק על-ידי מחוגה הוא בטווח זהה (קרי, מילימטרים) כגודל של נגעים שהושתלו בעכברים, לפיכך הגבלת הקיבולת של כלים אלה כדי לזהות וריאציות בפועל בגודלם.

כדי להתגבר על מגבלות כאלה, במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל heterologous העכבר של אנדומטריוזיס בו מושתל רקמה אנושית מתוכנן לבטא m-שרי כתב חלבון פלואורסצנטי. זיהוי של האות פלורסנט עם מערכת התמונה מאפשר בקרה בלתי פולשני של מצב הנגע באמצעות כימות בו זמנית הגודל שלה בזמן אמת. לפיכך, המודל שלנו מספק יתרונות משמעותיים בהשוואה למודלים קצה קונבנציונאלי כשהוא מחזיר את ההזדמנות של ניטור פולשני בזמן אמת ועל האפשרות לביצוע יותר אובייקטיבית, אומדן מדויק של וריאציות בגודל הנגע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש של דגימות רקמה אנושית אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של בית החולים Universitario La Fe. כל המטופלים מסופקים בכתב הסכמה מדעת. המחקר המערבות בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים ב ולנסיה סנטרו דה Investigacion פרינסיפה פליפה, כל ההליכים שבוצעו בעקבות הנחיות טיפול ושימוש יונקים מן המוסדות הלאומיים של בריאות.

1. רירית הרחם רקמות איסוף ועיבוד קדם

  1. לקבל ביופסיה באיכות טובה של האדם וביופסיה רירית הרחם באמצעות של הצינורית מחוברת למכשיר suction. שופכים את הביופסיה לתוך בקבוקון המכיל 10 מ"ל של סטרילי מלוחים, תשטוף עם עצבנות ידני עדין.
    הערה: הליכים אודות אופן ההשגה של ביופסיות באיכות טובה כבר שתואר לעיל17.
  2. לשטוף את הביופסיה של ריר או דם הנותרים. חזור על התהליך על ידי מזיגת רקמות בקבוקונים המכילים תמיסת מלח טריים רבים שיני כנדרש עד רקמות נצפית נקי.
  3. העברת קטעים ביופסיה מראה בריא לתוך פתרון המכיל 10 מ"ל של השלם בינוני ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
  4. יוצקים את התוכן ב- 10 ס מ פטרי והמשך חותכים את הרקמה לחתיכות3 5 – 10 מ מ עם זוג ואזמלי מנתחים.

2. adenoviral תרביות תאים של רירית הרחם קטעים

הערה: כל החומרים שהולכים להיות מועסק בתהליך צריך להכיר בשכונה בתיאום מראש. . להוציא הכל. זה לא הולך להיות בשימוש בתהליך ולמקם בקבוקון עם אקונומיקה. כל החומר בא במגע עם וקטור adenoviral חייבים להיות נקיים עם המלבין לפני השלכת אותו בתוך המיכל הביולוגי

  1. לאחר הביופסיה קטועה, לוקחים צלחת פטרי חדש. Pipette טיפות DMEM µL 30 – 50 מרובים של התפשטות ברחבי המנה כולה. להשאיר מספיק מקום בין טיפות אז הם לא באים במגע.
  2. סייעו עם מחט מזרק מצורף, מניחים חתיכה אחת של קטע בתוך כל אחד הטיפות בינוני.
    הערה: כל טיפה צריך להכיל חתיכה אחת של רירית הרחם.
  3. הכן את הפתרון עובד Ad-mCherry על ידי דילול 20:1 mCherry adenoviral מניות הפתרון [pfu10 עונה 1 פרק 10/mL]) לתוך DMEM בינונית ללא אנטיביוטיקה (DMEM + 10% מסוננת FBS).
  4. לוותר על 100-200 μL של הפתרון Ad-mCherry לכל טוב על צלחת 96-ובכן, מילוי בארות רבות כמו שברי זמינים הטיפות פטרי (שלב 2.2). בנוסף, למלא לפחות 3 בארות עם אדנו חינם DMEM בינוני כפקד שלילי.
  5. סייעו עם מחט מזרק מצורף, להעביר כל אחד השברים בצלוחית הפטרי (שלב 2.2) לכל אחת מן הבארות המכיל ad-mCherry פתרון בצלחת 96-ובכן.
  6. מקום 96 טוב-הצלחת המכיל את קטעי רירית הרחם עם Ad-mCherry פתרון לתוך בריחה ב 37 ° C עם 5% CO2 16 h.
  7. תשטוף את adenoviruses הנותרים במדיום על ידי העברת רקמות לתוך צלחת 96-ובכן חדש מלא מלא DMEM בינוני (עם אנטיביוטיקה-antimycotics, חינם של אדנו) ואת תקופת דגירה של 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24-48 שעות.
    הערה: זכור לכסות עם אקונומיקה כל טוב צלחות וטיפים שבאו במגע עם Ad-וירוס לפני השלכת לתוך המיכל הביולוגי.
  8. להוציא לצלחת מן החממה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ זריחה-568 nm (ערוץ אדום) לבדיקת תיוג אופטימלית.
  9. לבחור השברים הכי מבריק, למקם אותם לתוך צלחת 96-ובכן חדשים טריים בינונית DMEM מלאה (עם אנטיביוטיקה-antimycotics, חינם של אדנו).
  10. לאטום את הצלחת היטב עם סרט פרפין פלסטיק ולהעביר אותה כדי לאזור ספציפי פתוגן-ללא בעלי חיים השרשת קטעי רירית הרחם חיות הנמען.

3. הדור של דגם העכבר אנדומטריוזיס

הערה: להשתמש בשבוע 6-8-עירום athymic הישן (או דומים זנים immunocompromised) עכברים הנשי שוכנו חינם – פתוגן תנאים מסוימים, כמו חיות הנמען. כדי להימנע הורמונלי תלויי-מחזור וריאציות וצמיחה בו-זמנית דלק הנגע עם אסטרדיול, בעלי החיים שחרור 60 יום ovariectomized, ולהניחו עם קפסולות המכילה 18 מ"ג של βeta 17-אסטרדיול (17β-E2). Oophorectomy והשמת צניפה יש לבצע לפחות שבוע מראש הרכבה קטעי רירית הרחם לתוך החיות הנמען.

  1. Oophorectomy
    הערה: להכין חומר סטיריליים כירורגי בשכונה. להכין ציוד ההרדמה אזור ההחלמה שלאחר הניתוח מוכן באותו חדר.
    1. לבצע זריקה תת עורית של מורפיום נגזר במינון של 5 מ"ג/ק"ג לכל העכבר. תן העכברים לנוח 30 דקות לאחר ההזרקה כך כמו משככי כאבים יכולה להיות מבוטאת ההשפעות של התרופה.
    2. לחבר את שאיפת הרדמה ציוד ולתת חמצן, איזופלוריין (2% מ"ג/ק"ג) זרימה למשך כמה דקות לתא אטום הרדמה.
    3. להציג את החיה אל החדר הרדמה איזופלוריין. לחכות 3-5 דקות ולבדוק חיות הן מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על אחד את הטלפיים שלה. העברת החיה אל אזור הניתוח ולקיים הרדמה על ידי הצבת מסכה עם זרימה רציפה של גז איזופלוריין מכסה את דרכי הנשימה בדרכי הנשימה.
    4. לאחר חיטוי האזור עם chlorohexidine, לבצע רוחבי 0.5 ס מ costal חתך בערך בגובה של הירך עם מספריים חדות.
    5. להפריד את העור לשריר כדי לקבל גישה אל חלל הבטן, לזהות משטח שמן לבן המקיף את השחלה ומשכו את השחלה עם מלקחיים לנתיחה.
    6. לקשור סביב oviduct בתפר שנספג היטב כדי להבטיח hemostasis המתאים לפני excising השחלה.
    7. סגור את שכבת השרירים 6-0 בתפר שנספג ולאחר מכן סגור את העור עם תפרים נספגים 6-0. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
    8. חזור על הפעולות כדי להסיר את השחלה לרוחב קונטרה.
  2. אסטרדיול הצניפה שתל
    הערה: תשמרי החיה. הוא מורדם במהלך הניתוח oophorectomy למקום כדורי בנקודה זו.
    1. מיד לאחר השלמת ההליך oophorectomy, לנקות את העור עם פתרון חיטוי סביב הצוואר, עושים חתך קטן תת עורי רוחבי (0.5 ס מ) עם מספריים חדות על העורף.
    2. השתמש את המספריים לנתח את העור מן השריר, ביצוע כיס גדול מספיק כדי לאפשר הצבת כדורי.
    3. הוסף את גלולה המכילה 18 מ"ג של 17β-E2 , תפר את העור בתפר נספגים 6-0. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
    4. מקם את החיה באזור השחזור ולפקח מנה אופטימלי של שיכוך כאבים לטווח ארוך כדי להקל על תקופת ההחלמה.
  3. ניתוח שתל רירית הרחם
    הערה: אפשר לפחות תקופה של בידוד שבעה ימים כדי לאפשר החלמה מלאה של בעלי חיים לאחר oophorectomy לפני שמתחילים ניתוח ההשתלה פרגמנט רירית הרחם. עבור סינכרון אופטימלית עם תיוג של רקמות, לאסוף את הביופסיה 2 – 3 ימים לפני ניתוח ההשתלה כדי למנוע התרבות ארוכת טווח של explants.
    1. . תכין את החדר כירורגי באזור החופשי פתוגן מסוים מראש להכין גם את מכסה המנוע עם כל נדרש ניתוח חומר, ציוד הרדמה לאזור ההחלמה שלאחר הניתוח.
    2. להביא את החיות לחדר, לבצע זריקה תת עורית של נגזרת מורפיום במינון של 5 (מ"ג/ק"ג) כל עכבר. תן העכברים לנוח 30 דקות לאחר ההזרקה כך יכולה להיות מבוטאת משככי כאבים ההשפעות של התרופה.
    3. לחבר את שאיפת הרדמה ציוד ולתת חמצן, איזופלוריין (2% מ"ג/ק"ג) זרימה למשך כמה דקות לתא אטום הרדמה.
    4. לפני תחילת הניתוח, להעביר לצלחת המכילה fluorescently שכותרתו קטעים (מתוך שלב 2.10) לתוך המנוע, לפתוח אותו ואת שופכים את השברים לתוך צלחת פטרי עבור טיפול קל יותר.
    5. להציג את החיה אל החדר הרדמה איזופלוריין. לחכות 3-5 דקות ולבדוק חיות הן מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על אחד את הטלפיים שלה. העברת החיה אל אזור הניתוח ולקיים הרדמה על ידי הצבת מסכה עם זרימה רציפה של גז איזופלוריין מכסה את דרכי הנשימה בדרכי הנשימה.
    6. המקום החיה anesthetized פונות למעלה. לחטא את האזור הגחון. לבצע חתך אורכי 1.5 ס מ באזור הבטן עם מספריים חדות, להפריד את העור לשריר. לאחר מכן, לבצע חתך אורכי 1.5 ס מ בשריר לגשת חלל הצפק.
    7. להחזיק את הקצה השמאלי של הקיר שרירי הבטן עם מלקחיים מיני ומקפלים אותו מנסה לחשוף את הפן הפנימי של צפק מבחוץ.
    8. לקחת שתל רירית הרחם עם פינצטה מיני, לספוג אותו בקצרה דבק n-בוטיל-אסתר cyanoacrylate ולמקם אותו כדי הצפק איפה זה להיקשר. . תן לו להתייבש במשך כמה שניות. חזור על שלבים 3.3.6 ו 3.3.7 כדי למקם את השתל בצד contralateral של הצפק.
    9. לסגור את שכבת השרירים בתפר שנספג 6-0 ולאחר מכן סגור העור עם נספגים 6-0 בתפר. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
    10. מקם את החיה באזור השחזור ולפקח מנה אופטימלי של שיכוך כאבים לטווח ארוך.

4. בתחום ההדמיה פלורסנט Vivo עם Vivo בתוך מערכת הדמיה

  1. הפעל את ההתקן מערכת הדמיה ויוו, לאתחל את התוכנית ולאפשר את מצלמת CCD להתקרר למשך כמה דקות.
  2. הכינו את מכשירי אינהלציה הרדמה. פתח את זרימת איזופלוריין ב-2% לכמה דקות כדי למלא תא הרדמה. הכינו את אזור התאוששות שלאחר ההרדמה.
  3. לאחר התוכנית החלה מצלמת CCD קיררה., לחץ על הכלי אשף הדמיה : ערכת לימוד מתחיל עם סדרה של רצופים של windows מוצג, כל אחד המתאים פרמטר עניין עם כמה אפשרויות זמינות להיבחר. על ידי לחיצה בתיבה המתאימה. מעבר קדימה דרך ההדרכה על-ידי בחירה בתיבות המתאימות בכל חלון ולחץ על לחצן אישור כדי לעבור מערך פרמטרים עם הרצף הבא הבא.
    1. בחר את תיבת Epiluminescence עבור הפרמטר פלורסצנטיות, בחר את תיבת mCherry עבור הפרמטר זוגות ' מסנן '. סמן את התיבות צילום מצב , המוקד לאשר ובחר את תיבת אוטומטית עבור הפרמטר חשיפה.
  4. ברגע המכשיר הוגדרה, לעבור חיה אחת בתוך החדר הרדמה. כשהוא מורדם לחלוטין, להעביר את. החיה בפנים ויוו הדמיה מערכת כלוב והנח אותו בצד את ראשו בתוך צנורית מחובר מכונת ההרדמה. סגור את המכסה ולחץ על ' רכוש ' עבור ניטור.
  5. לרכוש את כל תמונות (סך של חמש תמונות, תמונה אחת עבור כל זוג של מסננים שנבחרו), לשמור את הנתונים על-ידי לחיצה על הלחצן ' שמור בשם '. להזיז את העכבר אל האזור של התאוששות שלאחר ההרדמה. חזור על התהליך עם החיות הנותרים.
  6. חזור על ניטור שתיים או שלוש פעמים בשבוע מעקב האות כראוי במהלך הזמן.
  7. המשך להקריב את החיה בסוף מסלול הזמן בעזרת2 CO.

5. כימות In Vivo פלורסצנטיות תמונות

  1. סגרגציה של זריחה בפועל באמצעות תמונות unmixing:
    1. פתח את In Vivo הדמיה ניתוח משולב תוכנה.
    2. לבחור את הקובץ "Sequenceinfo" כדי להתחיל את הניתוח. שני חלונות יופיעו: "רצף view" ו- "כלי Palette". לבחור צבעים הכלי , לאחר התפריט הוצגה לבחור את האפשרויות הבאות.
    3. בחר תיקונים ולחץ על תיבת מסתגלת חיסור רקע FL כדי להסיר את אותות פלואורסצנט לא רצויה נתוני התמונה זורח. לבחור את סף הגדול הריבית ולחץ על הגדר.
    4. לחץ על הספקטרום Unmixing, בחר אורכי הגל של עניין, השיטה במחירים unmixing (ספריית, מודרכים, אוטומטית או ידנית) ולאחר מכן לחץ על להתחיל Unmix.
    5. בחר את התמונה Unmixed המתאים לאות mCherry ולאחר לחיצה כפולה. יופיע חלון חדש עם התמונה הסופית של האות עניין.
    6. חזור על שלב 5.1.3.
    7. אופציונלי: אם דמות ייצוגית (JPEG) של התוצאה unmix יש צורך, בחר את ההגדרות הרצויות ב- כלי לוח | תמונה כוונן (צבע שולחן, binning, לעומת זאת, וכו.), ולאחר מכן לחץ על ייצוא גרפיקה בחלון ' unmix ' כדי לייצא את התצוגה הנוכחית של התמונה כתמונה.
    8. שמור את הקובץ החלקיות: קובץ | שמירת | בחר תיקיית , בסדר.
    9. חזור על התהליך עם שאר הימים ניטור ועם כל בעלי החיים.
  2. ROIs להגדיר ו אות כמת
    1. לחץ על עיון ובחר את הקובץ החלקיות (ראה שלב 5.1.8) לעניין להיות מנותח. יופיע חלון חדש.
    2. לחץ על הוסף לרשימת כדי לכלול את כל הקבצים החלקיות של כל בעל חיים בנקודות זמן שונות ולאחר מכן לחץ על טען בתור קבוצה. כל התמונות להופיע כרצף אחד.
    3. עבור אל חלון כלי הצבעים : לחץ על מהקופסא אניוהקבוצתית קנה מידה כדי לקבל את כל התמונות באותה רמה.
    4. לחץ פעמיים על תמונה אחת של הרצף וליצור של רועי ב- zone עניין באמצעות הרצף הבא. ללכת רועי כלים , בחר Countour ואת האפשרות Auto 1 , לחץ על צורת מעגל המופיעים, להניחה על המרכז האות פלורסנט ולאחר מכן לחץ על צור על החלון המוצג.
      הערה: זו באופן אוטומטי מדגיש פיקסלים עם עוצמות של זריחה מעל ערכי הרקע (קרי, הנגע), יוצרת צורה של מי האיזור מחבק את הפיקסלים מחולקת לרמות.
    5. להעתיק את הצורה רועי שנוצר ולהדביק על רקע אזור שבו אין אות.
    6. לחץ על מדד ROIs | בחר הכל כדי להציג את הערכים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. המשך לבחור ערכי נתונים עם העכבר, לחץ על הלחצן הימני, לחץ על העתק והדבק בגיליון אלקטרוני.

6. נתונים (אות ניאון) נורמליזציה

  1. בחר בנקודת הזמן הראשוני ברמזור שבו עוצמת הוא מקסימלי. המשך לנרמל את האות בכל נקודה בזמן באמצעות הנוסחה:
    אות בעוצמה בכל נקודה בזמן / עוצמת האות המקסימלי שנצפה במהלך הזמן) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מתארים את התהליך ליצירת מודל heterologous של אנדומטריוזיס שבו הארכיטקטורה של נגעים נשמר על ידי השתלת fluorescently שכותרתו פיסות רירית הרחם אנושי לתוך immunocompromised עכברים, ובכך מאפשר לא פולשנית ניטור של התקדמות הנגע. תיוג של קטעי רירית הרחם מושגת על-ידי זיהום עם אדנו מתוכנן mCherry אקספרס, חלבון פולטות קרינה פלואורסצנטית באזור אינפרא-אדום ליד. איור 1, אנו מראים נציג תמונות של האדם קטעי רירית הרחם נגוע Ad-mCherry נצפתה תחת המיקרוסקופ זריחה. להמחשה, שברי שכותרתו והן עם התווית שאינם כלולים אז ניתן לציין הבדלים זריחה בין רקמות נגועות, לבריא (autofluorescence). במהלך ניטור, בנוסף הגל הפניה עבור mCherry, תמונות פלורסנט נלקחים עם זוגות שונים של עירור/פליטה אורכי גל מסננים (איור 2) כדי להגדיר את הפרופיל האופייני פליטה פלורסנט של רקמות. המטרה של פעולה זו היא "unmix" זריחה בפועל הנפלטת נגעים מן הרקע autofluorescence הנפלטים על ידי המארח רקמות והצלקת מקורו במהלך הניתוח בהתאמה. דוגמה להמחשה של תהליך unmix מוצג באיור3. הערכות של וריאציה של גודל הנגע מתבצע על ידי לכימות, נורמליזציה פלורסנט איתות הנפלטת נגעים במהלך הזמן. למטרה זו, תמונות של ניטור המכיל פלורסצנטיות raw הנפלטים על ידי חיות במהלך כל נקודת זמן קודם מובאים ביחד לא מנורמלת (איור 4) בקובץ יחיד. לאחר מכן הוא החלקיות, מנורמל, מייצגים כמו תמונה שקרית (איור 5). לבסוף, ROIs המתאים ספציפית הנגע ורקע איתות אוטומטי מזוהה על-ידי התוכנית, לכמת (איור 6). רקע רועי איתות יופחת מן הנגע רועי איתות ותוצאות בעוצמה בזמן כל נקודה הם מנורמל נגד נקודת זמן שבה עוצמת הוא מקסימלי (איור 7). בסופו של תהליך ניטור, מספר שבועות לאחר הניתוח עכברים הם הקריבו קיימא השתל ניתן לשחזר לצרף העכבר הצפק (איור 8).

Figure 1
איור 1: ויזואליזציה של רירית הרחם קטעים עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ לאחר ההדבקה Ad-mCherry. (א) שבר רירית הרחם האנושי מודגרות עם Ad-mCherry-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במהלך 24 שעות כמדגם חיובי. (B) האדם שבר רירית הרחם מתפשט-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ללא Ad-mCherry כמדגם שליטה שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Raw פלורסצנטיות הדמיה הנפלטת שכותרתו שברי שהושתלו בעכברים. התמונה מציגה הדמיה נציג של האות פלורסצנטיות raw הנפלטת החיה אותו בנקודת זמן מסוימת. תמונות תואמות צילומי מסך שהושג באמצעות תוכנה מצמידים התקן מערכת דימות ויוו במהלך הפעלת הפיקוח. כל לוח המכיל עכברים (בפינה השמאלית, שמספרו 1-5) מקביל קרינה פלואורסצנטית שנמדדו באמצעות מסנן זוג עירור/פליטה ספציפיים שונים לרכישת תמונות. לוח בצד הימין (החלונית ' הכלי ') להראות פלורסצנטיות פרמטרים נבחרים עבור רכישת תמונות לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Unmixing של הרקע לעומת ספציפית פלורסצנטיות הנפלטת נגעים. התמונה מראה להחליפן בתמונות של תהליך unmixing ביצע לנתח פלורסצנטיות בפועל של נגעים באמצעות מערכת הדמיה ויוו יחד תוכנה. גרף בלוח השמאלי מציינות מנורמל פרופילים ספציפיים של פליטת קרינה פלואורסצנטית על ידי צלקת (הקו הירוק, UMX1), נגעים (הקו האדום, UMX2) ורקמות המארח (קו כחול, UMX3 לוח). עוצמת קרינה פלואורסצנטית באורכי גל שונים פליטה (ציר x) מיוצג ביחידות של קורנים יעילות (ציר y). רק שימו לב איך כל מבנה ספציפי (קרי, צלקת, שכותרתו פצעים ורקמות מארח) פולט פרופיל פלורסצנטיות שונים אשר מאפשר זיהוי של פנקסי אותם במיוחד טופס אחד את השני. בלוח השמאלי, זריחה הנובעים משיקה פליטה ספציפיים פרופילים עבור צלקת (UMX1), נגעים (UMX2) ורקמות מארח (UMX3) מוצגים פסיפסים זו על זו על צילום תמונות של עכברים. ללא הפרדות צבע התמונה (קומפוזיט) כלולה גם לצרכי המחשה לציון את פילוח של זריחה הנפלטת נגעים מזו הנפלטת רקמות צלקת או שם המחשב המארח. בחלונית האמצעית מראה הפרמטרים שנבחרו עבור unmixing עם התוכנה תמונה מצמידים התקן הדימות ויוו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הגיע הזמן קורס ניטור קרינה פלואורסצנטית raw הנפלטת נגעים. החלונית מציגה תמונות נציג של raw פלורסצנטיות הנפלטים על ידי עכבר אחת. מושתל שכותרתו האנושי נגעים (מבריק כתמים צהובים) במהלך הזמן. נקודות זמן לאחר הניתוח שבו ניטור בוצעה מסומנים כמו "יום (מספר)". פליטה לספירה עירור זוג המסננים המשמשים לניטור הם הצביעו על כל לוח/תמונה. כל לוח מזוהה על פי קוד מסוים (BKG) בחלק העליון המכיל מידע הקשורים לתאריך שבו נרכשה זריחה.

Figure 5
איור 5: הזמן קורס ניטור של מנורמל פלורסצנטיות הנפלטת נגעים. להחליפן בתמונות התואמות החלקיות, איתות פלורסנט מנורמל הנפלטת האנושי נגעים (כתמים בצבע הקשת) superposed ב עכבר אחת בזמן הקורס (ימים לאחר הניתוח). נקודות זמן לאחר הניתוח שבו ניטור בוצעה מסומנים כמו "יום (מספר)". כל לוח מזוהה על פי קוד מסוים (BKG) בחלק התחתון המכיל מידע הקשורים לתאריך שבו נרכשה זריחה. קשת הצבעים צבע בצד ימין מזהה עוצמת קרינה פלואורסצנטית (יעילות זוהרת) הנפלטת נגעים בכל נקודה בזמן. שימו לב עד כמה חזקה עוצמת קרינה פלואורסצנטית במהלך ירידות נקודות (קרי, צבע אדום במרכז של נגעים בימים 1, 5 ו-8) הזמן הראשוני במהלך הזמן (קרי, צבע כחול בנגעים בימים 20 ו- 25). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: השימוש ROIs על כימות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית בנגעים במהלך הזמן. איור מציג לוח של תמונות של זריחה מנורמל הנפלטת נגעים ב עכבר אחת במהלך הזמן (קרי, איור 5) עם התוספת של ROIs (בהתוויית נגעים ורקע) על כימות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. רועי 1 ו- 2 רועי לזהות את כמות קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי כל אחד של שני נגעים במהלך הזמן. BKG לזהות את כמות קרינה פלואורסצנטית הנפלטת הרקמה המארח (רקע זריחה) במהלך הזמן. רקע זריחה יופחת מ ROIs למטרות כמת. נקודות זמן לאחר הניתוח שבו ניטור בוצעה מסומנים כמו "יום (מספר)". רכשה בכל נקודה בזמן שהתמונות שכותרתו עם קוד ספציפי (BKG) בחלק התחתון של כל פרטי המכיל אחד הקשורים לתאריך-זריחה אילו היה הנרכש (הראשון שמונה ספרות בעקבות BKG נתוני פירוט עבור שנה (2014)-החודש (10) והיום -(10 עד 31)) , קוד זיהוי אישי (6 הספרות האחרונות) סולם חזותי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית (יעילות זוהרת) הנפלטת נגעים ב מספק פרופילים ספציפיים של פליטת קרינה פלואורסצנטית המשמש עבור קשת (UMX2) unmixing לוח צבעים בצד ימין כל נקודת זמן. הערה כמה קרינה פלואורסצנטית ערכי העוצמה של הנגעים שני (ROI1 ו- ROI2) הם גבוהים יותר-זו הפעם הראשונה נקודות (ימים 1 ו- 5), נרקב במהלך הזמן להגיע הערכים הנמוכים ביותר בסוף נקודות זמן (ימים 20 ו- 25). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: הנורמליזציה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית במהלך הזמן. הטבלה בחלק העליון מראה דוגמה להמחשה הערכים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית (יעילות זוהרת) הנפלטים על ידי שני mCherry עם התווית נגעים (ROI1 ו- ROI2) מוטמן בתוך עכבר (R25). ניטור קרינה פלואורסצנטית בוצעה ימים שונים לאחר הניתוח (D5-D25) במהלך הזמן. D5 - גרף בתחתית מדגים דפוס אופייני של זריחה מנורמל הנפלטת נגעים נגוע mCherry מרקיבים במהלך הזמן. ציר ה-y מציגה את הערכים של זריחה מנורמל לבטא את האחוז של דעיכה באמצעות הנוסחה (אות בעוצמה בכל נקודה בזמן / עוצמת האות המקסימלי שנצפה במהלך הזמן) x 100. הזמן מצביע (ימים (Dx) לאחר ניתוח השתלת) על איזו קרינה פלואורסצנטית נוטרו הם הצביעו על ציר ה-x. הערה גידול ראשוני של איתות במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח, המתאים ייצוב של הנגע, הפסגה בעוצמתם פלורסצנטיות סביב D1-D5 ו שלה הבאים דעיכה עקב ביטוי episomal mCherry במהלך הזמן אנא לחצו כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: מאקרוסקופית הופעת נגעים endometriotic מושתל. נציג תמונות מראה מראה מאקרוסקופית של נגעים endometriotic שהושתלו בעכברים בסופו של תהליך הפיקוח על הקרבה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול מפורט במסמך זה מתאר את היישום של מודל חיה של אנדומטריוזיס שבו נשמר את הארכיטקטורה של השתלת נגעים אדריכלות בזמן בו זמנית ומאפשר הערכה בזמן אמת של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי mCherry מתויג רקמת רירית הרחם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש של מערכת הדמיה ויוו ספציפיות וכן תוכנות קשורות להעריך לא פולשני פלורסצנטיות הנפלטת שכותרתו הנגע. כל משתמש צריך להתאים את הפרוטוקול בהתאם התקן הדימות ספציפיים הקשורים התוכנה זמינה במוסד שלהם. ניטור מתבצע בבעלי חיים ומורדמת באמצעות מכונת הרדמה גז איזופלוריין מצמידים אל מערכת הדמיה ויוו. כדי למנוע הפרעה אוטומטי-זריחה הנפלטת פצעים, מומלץ להתחיל ניטור קרינה פלואורסצנטית נגעים לפחות שלושה ימים לאחר ניתוח ההשתלה.

עכבר heterologous מודלים של אנדומטריוזיס דומה לזו המוצגת בזאת תוארו קודם לכן המורכבת בתוך שברי רירית הרחם ההשתלה המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)18,19. השימוש mCherry ככתב עבור תיוג הרקמה האנושית מספק אולם יתרון על פני ה-GFP בגלל חדירת רקמות משופרת לשעבר. בשל ספקטרום פליטה גדול שלה גבוה יותר פוטוסטביליטי mCherry פולטת אות בהיר מתאים יותר עבור הפריט החזותי של קטעים בקרום הבטן.

בגלל גודלו הקטן adenoviruses הם הווקטורים של בחירה עבור זיהום (קרי, תיוג) של רקמות כל חתיכות כמו אלה מספקים מקובל דיפוזיה דרך מבנים תלת-ממד. אפילו עם זה האחוז של תאי הרקמות נגוע אינה גבוהה יותר 30 – 35%. לפיכך, המגבלה של מודל זה מסתמך על תיוג לא יעיל של רקמת בנוסף הביטוי ארעי מושגת על-ידי adenoviruses. אכן, קרינה פלואורסצנטית שהדבר מעבר בשבוע 4-6 כמו זה דוהה בהדרגה בשל הביטוי ארעית episomal של Ad-וירוס. היעילות של תיוג ואת תקופת הפיקוח יכול להיות מוגברת על ידי שיבוש הרקמה. ולהדביק תאים אפיתל/סטרומה בודדים מבודדת עם ad-וירוס הקודם כדי להיות מוזרק עכברים הנמען19,20. גישה כזו, עם זאת, מפחית במידה שבה מחקה המודל החייתי הפיזיולוגיה של אנדומטריוזיס ובלבד חוץ רחמי האנושי נגעים אינם מורכבים הצטברות לא מאורגן של תאים אפיתל/סטרומה בודדים אלא מעדיף בנוי היטב רקמה endometriotic.

פרוטוקול זה, הוא השלב הקריטי ביותר תיוג של הרקמה, לרוב במיוחד הקביעה של הריכוז המתאים של ad-וירוס הדרושים עבור זיהום אופטימלית. אכן, הריכוז pfu/mL10 עונה 1 פרק 10 הצביע בפרוטוקול הוא בעיקר דמות orientative/קונצנזוס המבוסס על הניסיון שלנו. ריכוז אופטימלי עלולות להיות שונות ניסוי בהתאם לסוג איכות של הביופסיה ו/או כמה מהר זה מעובד. אנו מציעים לכן בדיקות titers (כפולה) שונים לפחות שלוש ניסוי, בחירת מספק אופטימלית תיוג מבוסס על ויזואליזציה תחת המיקרוסקופ זריחה.

הפרוטוקול/המודל שלנו שימושי לחקור את המנגנונים ערבו הקמה ופיתוח מוקדם של נגעים endometriotic. למרות תקופת הזמן של ניטור מוגבלת, המודל הוא עדיין שימושי ללמוד ולגלות את ההשפעות של תרכובות תרופתי מסוגל להפעיל השפעה דרמטית על גודל הנגע בתקופה קצרה של זמן כגון אנטי-אנגיוגנטי או סמים antiestrogenic. פיתוח שיטות עמיד ויעיל יותר של תיוג רקמות אנושיות צפויים להתפשט ניטור פולשני כמו טכניקה המאוחדים לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של מגוון רחב יותר של תרופות דגם פרה אנדומטריוזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה הזאת הייתה נתמך על ידי ספרדית משרד הכלכלה ואת התחרותיות באמצעות התוכנית Servet מיגל [CP13 00077] הקים על ידי פדר (קרן פיתוח אזורי אירופה), זכה ד ר ר גומז כמו גם על ידי קרלוס השלישי המכון לבריאות מענקים ד ר גומז R [PI14/00547, PI17/02329], פרופ ' / ח' א קאנו [PI12 02582].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endosampler™ Medgyn 22720 Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium VWR HYCLSH30285.FS Medium
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767 Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 VWR E504-500ML Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days Innovative Research of America SE-121 Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive 3M 780-680 Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal Levantina 367-P101VR20 Petri dishes
Penicillin-Streptomicin Sigma P4333-100ML Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml VWR CODA626616 Syringes
Nitrile gloves, powder-free VWR 112-2754 Gloves
Soft swiss nude mice Charles River SNUSSFE05S Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system Perkin Elmer 124262 In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software) Perkin Elmer --- In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147 Enrichment serum
96-well cell culture treated plates Life technologies 167008 Culture plates
Urine flasks Summedical 4004-248-001 Flasks for washes
Sterile surgical blades (Aesculap Division) Sanycare 1609022-0008 Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g B-BRAUN --- Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg Schering Plough S.A. --- Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL B BRAUN --- Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures COVIDIEN --- Sutures
Desinclor chlorhexidine Promedic SA --- Antiseptic solution
Microscopy DMi8 Leica Mycrosystems --- fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator Thermo Scientific 51026282 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
  2. Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
  3. Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
  4. Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
  5. Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
  6. D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
  7. Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
  8. Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
  9. Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
  10. Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
  11. Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
  12. Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
  13. Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
  14. Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
  15. Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
  16. Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
  17. Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
  18. Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
  19. Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
  20. Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 144 אנדומטריוזיס heterologous העכבר מודל mCherry ויוו ניטור
ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., … More

Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis. J. Vis. Exp. (144), e58358, doi:10.3791/58358 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter