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Biology

endometriosis के एक विषमजात माउस मॉडल में घाव आकार की noninvasive निगरानी

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58358
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3,4, 1
1Instituto de Investigación Sanitaria, 2Unidad de Animalario del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 3Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología, Universidad de Valencia, 4Servicio de Obstetricia y Ginecología, Hospital Clínico Universitario de Valencia

Summary

यहां, हम प्रतिदीप्ति के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े चूहों में इसराईल लेबल । विधि की निगरानी और वास्तविक समय पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के परिमाणन के माध्यम से एंडोमेट्रियल घाव के आकार पर पसंद की दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है

Abstract

यहां, हम एक heterologous माउस मॉडल के कार्यांवयन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन जिसमें endometriosis की प्रगति प्रत्यारोपित अस्थानिक मानव एंडोमेट्रियल ऊतक द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की noninvasive निगरानी के माध्यम से वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रयोजन के लिए, मानव एंडोमेट्रियम की बायोप्सी दाता महिलाओं चल रही अंडक दान से प्राप्त कर रहे हैं । मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े एडिनोवायरस रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन mcherry के लिए cdna एक्सप्रेस के लिए इंजीनियर की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं । दृश्य पर, संक्रमण के बाद प्रतिदीप्ति की इष्टतम दर के साथ लेबल वाले ऊतकों को बाद में प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपण के लिए चुना जाता है । एक सप्ताह के प्रत्यारोपण सर्जरी से पहले, प्राप्तकर्ता चूहों oophorectomized हैं, और एस्ट्राडियोल छर्रों के अस्तित्व और घावों के विकास को बनाए रखने के लिए subcutaneously रखा जाता है । सर्जरी के दिन चूहों एनेस्थेटाइज्ड हैं, और पेरिटोनियल गुहा linea-अल्बा द्वारा एक छोटे (१.५ सेमी) चीरा के माध्यम से पहुँचा. प्रतिदीप्ति लेबल प्रत्यारोपण tweezed हैं, संक्षेप में गोंद और पेरिटोनियल परत से जुड़ी लथपथ । चीरों sutured कर रहे हैं, और जानवरों के कुछ दिनों के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया है । एंडोमेरिओटिक प्रत्यारोपण द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति आमतौर पर वीवो इमेजिंग सिस्टम के साथ 4 सप्ताह के लिए हर 3 दिनों में गैर-आक्रामक रूप से निगरानी की जाती है । एंडोमेट्रियल प्रत्यारोपण के आकार में भिन्नता mcherry संकेत के परिमाणन और प्रारंभिक समय-बिंदु अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखा के खिलाफ सामान्यीकरण द्वारा वास्तविक समय में अनुमान लगाया जा सकता है ।

endometriosis के मॉडल के पारंपरिक पूर्व नैदानिक कुतर वास्तविक समय में घाव की गैर आक्रामक निगरानी की अनुमति नहीं है बल्कि अंत बिंदु पर बीएसए दवाओं के प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति नहीं है । इस प्रोटोकॉल एक वास्तविक समय में घावों को ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है और endometriosis के पूर्व नैदानिक मॉडल में दवाओं की चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने के लिए और अधिक उपयोगी है । इस प्रकार उत्पन्न मॉडल की मुख्य सीमा यह है कि गैर-इनवेसिव मॉनिटरिंग विज्ञापन-वायरस के एपिसोमल अभिव्यक्ति के कारण समय की लंबी अवधि से संभव नहीं है ।

Introduction

एंडोमेट्रोसिस एक पुरानी स्त्रीरोगों विकार है जो गर्भाशय गुहा के बाहर कार्यात्मक एंडोमेट्रयम के प्रत्यारोपण द्वारा शुरू किया जाता है । एक्टोपिक घावों के बढ़ने और जीर्ण श्रोणि दर्द और बांझपन1के लिए अग्रणी भड़काऊ प्रक्रियाओं को प्रेरित । यह अनुमान है कि प्रजनन आयु की महिलाओं के 10 से 15% तक endometriosis2 से प्रभावित हैं, और यह लगभग 40 में मौजूद है-50% महिलाओं के3। endometriosis के लिए वर्तमान औषधीय उपचार पूरी तरह से घावों के उन्मूलन और साइड इफेक्ट से मुक्त नहीं करने में असमर्थ हैं4,5. अधिक कुशल चिकित्सा के लिए अनुसंधान इस तरह से endometriosis के मौजूदा पशु मॉडल के शोधन की आवश्यकता है कि मानव घावों को उचित रूप से नकल की जा सकती है, और दूसरों के बीच घाव आकार पर यौगिकों के प्रभाव बारीकी से मूल्यांकन किया जा सकता है ।

प्राइमेट मॉडल अस्थानिक घावों का imstologically समान और मनुष्यों के रूप में समान साइटों पर में endometriosis की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है6,7,8; हालांकि, नैतिक चिंताओं और उच्च आर्थिक प्राइमेट्स उनके उपयोग की सीमा के साथ प्रयोग से संबंधित लागत9। नतीजतन, छोटे जानवरों का उपयोग, विशेष रूप से कृंतकों, endometriosis के vivo मॉडल के कार्यान्वयन के लिए इष्ट के रूप में यह10,11व्यक्तियों की बड़ी संख्या के साथ अध्ययन की अनुमति देता है जारी है । endometriosis या तो कृंतक गर्भाशय सींग ("समजात मॉडल")12,13 या मानव एंडोमेट्रियल/endometriosis ऊतक अस्थानिक साइटों के लिए प्रत्यारोपण द्वारा इन पशुओं में प्रेरित किया जा सकता है (विषमजातीय मॉडल)14 . मनुष्यों के विपरीत, कृंतकों उनके एंडोमेट्रियल ऊतक शेड नहीं है और इस तरह endometriosis इन प्रजातियों में सहज रूप से विकसित नहीं किया जा सकता है । इसलिए, endometriosis के समजात माउस मॉडल तथ्य यह है कि प्रत्यारोपित अस्थानिक माउस गर्भाशय ऊतक मानव endometriosis घावों की विशेषताओं को प्रतिबिंबित नहीं करता है की वजह से आलोचना की गई है15.

endometriosis के उपयुक्त शरीर क्रिया विज्ञान endometriosis के विषमजातीय मॉडल में नकल की जा सकती है जहां ताजा मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े immunoकी कमी जानवरों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । पारंपरिक विषमजात मॉडलों में, ब्याज के यौगिकों के उपचारात्मक प्रभाव सामान्यतः कैलिपर्स के उपयोग के साथ घाव के आकार के आकलन द्वारा अंत बिंदु पर मूल्यांकन कर रहे हैं16. एक स्पष्ट सीमा है कि, इस तरह के रूप में, समापन बिंदु पशु मॉडल समय के साथ प्रत्यारोपण गतिशीलता या एंडोमेट्रियल घाव के विकास का अध्ययन करने की अनुमति नहीं है । एक अतिरिक्त सीमा है कि कैलिपर्स का उपयोग घाव आकार की सटीक माप की अनुमति नहीं है । वास्तव में, मानक त्रुटि कैलिपर्स द्वारा प्रदान की एक ही श्रेणी में है (यानी, मिलीमीटर) घावों के आकार के रूप में चूहों में प्रत्यारोपित, इस प्रकार इन उपकरणों की क्षमता सीमित आकार में वास्तविक विविधताओं का पता लगाने के लिए.

आदेश में ऐसी सीमाओं पर काबू पाने के लिए, इस के साथ साथ, हम endometriosis के एक विषमजातीय माउस मॉडल की पीढ़ी का वर्णन जिसमें प्रत्यारोपित मानव ऊतक एक रिपोर्टर एम-चेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस इंजीनियर है । एक उचित छवि प्रणाली के साथ फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के वास्तविक समय में अपने आकार के एक साथ परिमाणन के साथ घाव स्थिति की गैर इनवेसिव निगरानी सक्षम बनाता है । इस प्रकार, हमारे मॉडल स्पष्ट लाभ प्रदान करता है जब पारंपरिक समापन बिंदु मॉडल की तुलना में यह वास्तविक समय गैर इनवेसिव निगरानी और अधिक उद्देश्य और घाव के आकार में बदलाव की सटीक अनुमान प्रदर्शन करने की संभावना का अवसर लाता है ।

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Protocol

मानव ऊतक नमूनों के उपयोग के संस्थागत समीक्षा बोर्ड और अस्पताल विश्विद्यालय ला Fe की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी मरीजों को लिखित सूचना सहमति प्रदान की । जानवरों से जुड़े अध्ययन centro डे जांचन प्रिंसिपे felipe डे valencia में संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी प्रक्रियाओं देखभाल और राष्ट्रीय संस्थानों से स्तनधारियों के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों का पालन किया गया स्वास्थ्य की ।

1. एंडोमेट्रियल ऊतक संग्रह और पूर्व प्रसंस्करण

  1. एक सक्शन डिवाइस से जुड़ी एक प्रवेला का उपयोग करके मानव एंडोमेट्रियल महाप्राण की एक अच्छी गुणवत्ता बायोप्सी प्राप्त करें । एक फ्लास्क में बायोप्सी डालो बाँझ खारा के 10 मिलीलीटर युक्त और कोमल मैनुअल आंदोलन के साथ धोने ।
    नोट: कैसे अच्छी गुणवत्ता बायोप्सी प्राप्त करने के लिए पर प्रक्रियाओं पहले वर्णित किया गया है17.
  2. किसी भी शेष रक्त या बलगम की बायोप्सी धो लें । जब तक ऊतक साफ मनाया जाता है के रूप में कई tines के रूप में ताजा खारा युक्त बोतल ऊतक डालने का क्रिया से प्रक्रिया को दोहराएं ।
  3. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमिकोटिक समाधान के साथ पूर्ण dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त एक समाधान में एक स्वस्थ उपस्थिति के साथ बायोप्सी टुकड़े स्थानांतरण ।
  4. एक 10 सेमी पेट्री डिश में सामग्री डालो और 5 में ऊतक काटना-10 मिमी3 टुकड़ों की एक जोड़ी के साथ scalpels ।

2. एंडोमेट्रियल टुकड़े के adenoviral ट्रांसफेक्शन

नोट: प्रक्रिया में नियोजित होने वाले सभी सामग्रियों को पहले से हुड में पेश किया जाना चाहिए । बाहर सब कुछ है कि इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा रहा है और जगह ब्लीच के साथ एक फ्लास्क नहीं ले लो । सभी सामग्री है कि adenoviral वेक्टर के साथ संपर्क में आता है यह biohazard कंटेनर में discarding से पहले ब्लीच के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए ।

  1. एक बार बायोप्सी कटी हुई है तो एक नई पेट्री डिश लें । पिपेट मल्टीपल 30 – 50 μl dmem बूंदों के पूरे पकवान भर में फैल गया । बूंदों के बीच पर्याप्त जगह छोड़ दें ताकि वे संपर्क में नहीं आते हैं ।
  2. सिरिंज से जुड़ी सुई के साथ सहायता प्राप्त, मध्यम बूंदों में से प्रत्येक के अंदर एक टुकड़ा के एक टुकड़े को रखें ।
    नोट: प्रत्येक बूंद endometrium का एक टुकड़ा शामिल करना चाहिए ।
  3. dmem मध्यम में एंटीबायोटिक्स (dmem + 10% फ़िल्टर किए गए fbs) के बिना mcherry adenoviral स्टॉक समाधान [1 x 1010 pfu/mL]) के 1:20 को पतला करके विज्ञापन-mcherry कार्य समाधान तैयार करें ।
  4. 100-200 μl का वितरण एक ९६-अच्छी थाली पर अच्छी तरह से प्रति विज्ञापन-mcherry समाधान, टुकड़े के रूप में कई कुओं को भरने के रूप में पेट्री डिश बूंदें (चरण २.२) में उपलब्ध हैं । इसके अलावा, एडीनोवायरस नि: शुल्क dmem मध्यम के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कम से कम 3 कुओं को भरें ।
  5. सिरिंज से जुड़ी सुई के साथ सहायता प्राप्त, पेट्री डिश में टुकड़ों में से प्रत्येक को हस्तांतरण (चरण २.२) ९६-अच्छी थाली में विज्ञापन-mcherry समाधान युक्त कुओं में से प्रत्येक के लिए ।
  6. ९६ अच्छी तरह से एक मशीन में विज्ञापन mcherry समाधान के साथ एंडोमेट्रियल टुकड़े युक्त प्लेट ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 के लिए 16 एच के साथ ।
  7. एक नया ९६-अच्छी तरह से पूर्ण dmem माध्यम से भरा थाली में ऊतकों के हस्तांतरण से मध्यम में शेष एडिनोवायरस बाहर धोने (एंटीबायोटिक्स-antimycotics के साथ, एडिनोवायरस से मुक्त) और ३७ के लिए सेते के साथ ° c के लिए 5% CO2 के लिए 24 – 48 एच.
    नोट: ब्लीच सभी अच्छी तरह से प्लेटें और सुझाव है कि biohazard कंटेनर में discarding से पहले विज्ञापन वायरस के साथ संपर्क में आया के साथ कवर करने के लिए याद रखें ।
  8. इंयूबेटर से प्लेट को बाहर ले जाएं और इसे इष्टतम लेबलिंग के लिए परीक्षण करने के लिए ५६८ एनएम (लाल चैनल) पर एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे रखें ।
  9. सबसे प्रतिभाशाली टुकड़े चुनें और उन्हें ताजा पूरा dmem माध्यम के साथ एक नया ९६-अच्छी थाली में जगह (एंटीबायोटिक्स के साथ-antimycotics, मुफ्त adenovirus).
  10. एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के साथ अच्छी तरह से थाली मुहर और यह विशिष्ट रोगज़नक़ में करने के लिए परिवहन-प्राप्तकर्ता जानवरों में एंडोमेट्रियल टुकड़े के प्रत्यारोपण के लिए मुक्त पशु क्षेत्र ।

3. endometriosis माउस मॉडल की पीढ़ी

नोट: उपयोग 6 – 8 सप्ताह पुराने athymic नग्न (या इसी तरह प्रतिरक्षा उपभेदों) महिला चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ में रखे-मुक्त शर्तों, प्राप्तकर्ता जानवरों के रूप में. हार्मोनल चक्र-निर्भर विविधताओं से बचने के लिए और साथ ही एस्ट्राडियोल के साथ ईंधन के घाव के विकास, जानवरों को अंडाशय के साथ रखा जाता है और ६०-दिन रिलीज कैप्सूल के साथ रख दिया जाता है जिसमें 18 मिलीग्राम 17-एस्ट्राडियोल (17β-E2) शामिल है । oophorectomy और गोली प्लेसमेंट प्राप्तकर्ता जानवरों में एंडोमेट्रियल टुकड़ों को ग्राफ्टिंग के पहले से कम एक सप्ताह के लिए प्रदर्शन किया जाना है ।

  1. ओफोरेक्टोमी
    नोट: एक हुड में सर्जिकल निष्फल सामग्री तैयार करें । निश्चेतना उपकरण तैयार करने और एक ही कमरे में एक के बाद सर्जिकल वसूली क्षेत्र तैयार ।
    1. अमॉर्टिन व्युत्पंन के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन की एक खुराक पर प्रदर्शन 5 मिलीग्राम/ चूहों इंजेक्शन के बाद 30 मिनट के लिए आराम करते हैं ताकि दवा के दर्दनाशक दवाओं के प्रभाव प्रकट किया जा सकता है ।
    2. इनहेलेशन एनेस्थेसिया उपकरण को कनेक्ट करें और ऑक्सीजन और आइसोफ्लूराने (2% मिलीग्राम/किग्रा) को एक मुहरबंद संज्ञाहरण कक्ष में कुछ मिनट के लिए प्रवाह दें ।
    3. आइसोफ्लूराने संज्ञाहरण कक्ष में पशु परिचय । 3 के लिए रुको-5 मिनट और जांच लें कि जानवरों को पूरी तरह से अपने पंजे में से एक दबाने से एनेस्थेटाइज्ड हैं । सर्जरी क्षेत्र के लिए पशु हस्तांतरण और श्वसन वायुमार्ग को कवर आइसोफ्लूराने गैस के निरंतर प्रवाह के साथ एक मुखौटा रखकर संज्ञाहरण बनाए रखने के ।
    4. chlorohexidine के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित करने के बाद, एक अनुप्रस्थ ०.५ सेमी तटीय चीरा लगभग तेज कैंची के साथ कूल्हे की ऊंचाई पर प्रदर्शन.
    5. उदर गुहा तक पहुंच प्राप्त करने के लिए मांसपेशियों से त्वचा को अलग करें, सफेद वसा पैड की पहचान करें जो अंडाशय को घेर लेता है और विच्छेदन के साथ अंडाशय को वापस ले लेता है ।
    6. अवशोषक सीवन के साथ अंडवाहिनी के चारों ओर एक गाँठ बाँध और अंडाशय छांटना से पहले उचित हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करने के लिए इसे कसने.
    7. 6-0 अवशोषक सीवन के साथ मांसपेशियों की परत को बंद करें, और फिर 6-0 गैर-अवशोषित सीवन के साथ त्वचा को बंद करें । एंटीसेप्टिक समाधान के साथ फिर से क्षेत्र को साफ ।
    8. कॉंट्रा पार्श्व अंडाशय को हटाने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं ।
  2. एस्ट्राडियोल पेलेट प्रत्यारोपण
    नोट: ध्यान रखें कि पशु को उस बिंदु पर छर्रों को रखने के लिए oophorectomy सर्जरी के दौरान एनेस्थेटिज्ड है ।
    1. oophorectomy प्रक्रिया के पूरा होने के तुरंत बाद, गर्दन के आसपास एंटीसेप्टिक समाधान के साथ त्वचा को साफ करने और एक अनुप्रस्थ उपचर्म छोटे (०.५ सेमी) nape में तेज कैंची के साथ चीरा ।
    2. मांसपेशियों से त्वचा को काटना करने के लिए कैंची का प्रयोग करें, एक जेब काफी बड़ा बनाने के लिए छर्रों रखने की अनुमति.
    3. संमिलित करें गोली युक्त 18 मिलीग्राम 17β-E2 और एक 6-0 गैर अवशोषण सीवन के साथ त्वचा सीवन । एंटीसेप्टिक समाधान के साथ फिर से क्षेत्र को साफ ।
    4. वसूली क्षेत्र में पशु प्लेस और वसूली की अवधि को कम करने के लिए लंबे समय से स्थायी analgesia की एक इष्टतम खुराक प्रशासन.
  3. एंडोमेट्रियल प्रत्यारोपण सर्जरी
    नोट: एंडोमेट्रियल टुकड़ा प्रत्यारोपण सर्जरी शुरू करने से पहले oophorectomy के बाद पशुओं की पूर्ण वसूली की अनुमति देने के लिए कम से सात दिनों की एक अवधि की अनुमति दें । ऊतक के लेबलिंग के साथ इष्टतम तुल्यकालन के लिए, रोपण सर्जरी से पहले बायोप्सी 2-3 दिन लीजिए ताकि explants की दीर्घकालिक संस्कृति से बचें ।
    1. पहले से तैयार विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त क्षेत्र में सर्जिकल कक्ष प्राप्त करें । सभी आवश्यक शल्य सामग्री के साथ हुड तैयार, संज्ञाहरण उपकरण और बाद सर्जिकल वसूली क्षेत्र भी.
    2. कमरे में जानवरों को लाओ, प्रत्येक माउस में 5 (मिलीग्राम/किग्रा) की एक खुराक पर एक अफ़ीम व्युत्पंन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन । इंजेक्शन के बाद 30 मिनट के लिए चूहों को आराम दें ताकि दर्दनाशक दवाओं के प्रभाव को प्रकट किया जा सके ।
    3. इनहेलेशन एनेस्थेसिया उपकरण को कनेक्ट करें और ऑक्सीजन और आइसोफ्लूराने (2% मिलीग्राम/किग्रा) को एक मुहरबंद संज्ञाहरण कक्ष में कुछ मिनट के लिए प्रवाह दें ।
    4. सर्जरी शुरू करने से पहले, (चरण २.१० से) हुड में प्रतिदीप्ति लेबल टुकड़े युक्त थाली ले जाएँ, यह unseal और आसान से निपटने के लिए एक पेट्री डिश में टुकड़े डालना.
    5. आइसोफ्लूराने संज्ञाहरण कक्ष में पशु परिचय । 3 के लिए रुको-5 मिनट और जांच लें कि जानवरों को पूरी तरह से अपने पंजे में से एक दबाने से एनेस्थेटाइज्ड हैं । सर्जरी क्षेत्र के लिए पशु हस्तांतरण और श्वसन वायुमार्ग को कवर आइसोफ्लूराने गैस के निरंतर प्रवाह के साथ एक मुखौटा रखकर संज्ञाहरण बनाए रखने के ।
    6. एनेस्थेटिज्ड जानवर चेहरे को ऊपर रखें । वेंट्रल क्षेत्र को कीटाणुरहित करना । तेज कैंची के साथ पेट में एक अनुदैर्ध्य १.५ सेमी चीरा प्रदर्शन और मांसपेशियों से त्वचा अलग । फिर, पेरिटोनियल गुहा का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों में एक अनुदैर्ध्य १.५ सेमी चीरा प्रदर्शन.
    7. मिनी-forceps के साथ पेट पेशी दीवार के बाएं किनारे पकड़ो और यह बाहर पर पेरिटोनियम के भीतरी चेहरे का पर्दाफाश करने की कोशिश कर गुना ।
    8. मिनी चिमटी के साथ एक एंडोमेट्रियल प्रत्यारोपण ले लो, यह संक्षेप में एक n-butyl-एस्टर साइयनोऐक्रिलेट चिपकने वाला है और यह पेरिटोनियम जहां यह संलग्न हो जाएगा करने के लिए जगह है । इसे कुछ सेकेंड के लिए सूखने दें । 3.3.6 और 3.3.7 चरणों को दोहराएं पेरिटोनियम के contralateral पक्ष पर एक प्रत्यारोपण जगह है ।
    9. एक अवशोषण 6-0 सीवन के साथ पेशी परत बंद करो, और फिर एक गैर के साथ त्वचा बंद-शोषक 6-0 सीवन । एंटीसेप्टिक समाधान के साथ फिर से क्षेत्र को साफ ।
    10. वसूली क्षेत्र में जानवर प्लेस और लंबे समय से स्थायी analgesia की एक इष्टतम खुराक प्रशासन.

4. विवो इमेजिंग सिस्टम में वीवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में

  1. विवो इमेजिंग सिस्टम डिवाइस को चालू करें, प्रोग्राम को इनिशियलाइज़ कर दें और सीसीडी कैमरा को कुछ मिनट के लिए ठंडा होने दे ।
  2. इनहेलेशन एनेस्थेसिया उपकरण तैयार करें । संवेदनाहारी कक्ष को भरने के लिए मिनट के एक जोड़े के लिए 2% पर आइसोफ्लूरेन प्रवाह खोलें । संज्ञाहरण वसूली क्षेत्र के बाद तैयार करते हैं ।
  3. एक बार कार्यक्रम शुरू कर दिया है और सीसीडी कैमरा ठंडा हो गया है, इमेजिंग जादूगर उपकरण क्लिक करें: एक ट्यूटोरियल लगातार प्रदर्शित खिड़कियों की एक श्रृंखला के साथ शुरू होता है, हर एक को चुना जा करने के लिए उपलब्ध कई विकल्पों के साथ ब्याज की एक पैरामीटर के लिए इसी इसी बॉक्स में क्लिक करके । प्रत्येक विंडो में उपयुक्त बक्से का चयन करके ट्यूटोरियल के माध्यम से आगे बढ़ने और निम्न अनुक्रम के साथ मापदंडों के अगले सेट करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए ठीक बटन पर क्लिक करें ।
    1. प्रतिदीप्ति पैरामीटर के लिए epiluminescence बॉक्स का चयन करें, फ़िल्टर जोड़ियां पैरामीटर के लिए mcherry बॉक्स का चयन करें । फ़ोटोग्राफ़ मोड जांचें और फ़ोकस बक्सों की पुष्टि करें और एक्सपोज़र पैरामीटर के लिए स्वचालित बॉक्स का चयन करें ।
  4. एक बार साधन स्थापित किया गया है, संज्ञाहरण चैंबर के अंदर एक जानवर ले जाएँ. जब पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड, विवो इमेजिंग सिस्टम पिंजरे में जानवर को स्थानांतरित करें और इसे एक ट्यूबुले के अंदर अपने सिर के साथ संज्ञाहरण मशीन से जुड़ा हुआ रखें । ढक्कन बंद कर दें और निगरानी के लिए मोल क्लिक करें ।
  5. प्रदर्शित छवियों (पांच छवियों, चयनित फिल्टर के प्रत्येक जोड़ी के लिए एक छवि की कुल) और के रूप में सहेजें बटन पर क्लिक करके डेटा को बचाने के लिए प्राप्त करें । पोस्ट-निश्चेतना वसूली के क्षेत्र के लिए माउस ले जाएँ । शेष जानवरों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
  6. दोहराएँ दो या तीन बार एक सप्ताह का पालन करने के लिए समय पाठ्यक्रम के दौरान उचित रूप से संकेत की निगरानी.
  7. सह2 asphyxiation द्वारा समय पाठ्यक्रम के अंत में पशु बलिदान करने के लिए आगे बढ़ें ।

5. विवो प्रतिदीप्ति छवियों में quantification

  1. छवि के माध्यम से वास्तविक प्रतिदीप्ति का पृथक्करण अनमिक्सिंग:
    1. में Vivo इमेजिंग विश्लेषण युग्मित सॉफ्टवेयर प्रोग्रामखोलें ।
    2. विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए "sequenceinfo" फ़ाइल का चयन करें । दो खिड़कियां दिखाई देंगी: "अनुक्रम दृश्य" और "टूल पैलेट" । उपकरण पैलेट चुनें और एक बार मेनू प्रदर्शित किया गया है निंनलिखित विकल्पों का चयन करें ।
    3. सुधार चुनें और luminescent छवि डेटा से अवांछनीय फ्लोरोसेंट संकेतों को हटाने के लिए बॉक्स अनुकूली FL पृष्ठभूमि घटाव पर क्लिक करें । सबसे बड़ी रुचि की दहलीज चुनें और सेटक्लिक करें ।
    4. क्लिक करें वर्णक unmixing, ब्याज की तरंग दैर्ध्य का चयन, unmixing के लिए चुना विधि (पुस्तकालय, गाइडेड, स्वत: या मैनुअल) और फिर क्लिक करें शुरू अनमिक्स.
    5. mcherry संकेत और डबल क्लिक करने के लिए इसी अमिश्रित छवि का चयन करें । एक नई विंडो ब्याज के संकेत की अंतिम छवि के साथ दिखाई देगा ।
    6. चरण 5.1.3 दोहराएं ।
    7. वैकल्पिक: अनमिक्स परिणाम की एक प्रतिनिधि छवि (JPEG) की जरूरत है, तो उपकरण पैलेट में वांछित सेटिंग्स चुनें । छवि को समायोजित (रंग तालिका, binning, इसके विपरीत, आदि), और फिर एक छवि के रूप में वर्तमान छवि दृश्य निर्यात करने के लिए unmix खिड़की में निर्यात ग्राफिक्स पर क्लिक करें.
    8. अमिश्रित फ़ाइल सहेजें: फ़ाइल । इस रूप में सहेजें । फ़ोल्डर और ठीकचुनें ।
    9. निगरानी दिनों के बाकी के साथ और सभी जानवरों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
  2. rois की स्थापना की और संकेत परिमाणन
    1. ब्राउज़ करें और विश्लेषण किया जा करने के लिए ब्याज की अमिश्रित फ़ाइल (चरण 5.1.8 देखें) का चयन करेंक्लिक करे । एक नई विंडो दिखाई देगी ।
    2. विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक जानवर से सभी अमिश्रित फ़ाइलें शामिल करने के लिए सूची में जोड़ें पर क्लिक करें और फिर समूह के रूप में लोडकरें पर क्लिक करे. सभी छवियां एक एकल अनुक्रम के रूप में प्रकट होना चाहिए ।
    3. टूल पैलेट विंडो पर जाएं: बॉक्स पर क्लिक करें Iनडिविदल स्केल समान स्केल पर सभी छवियां प्राप्त करने के लिए ।
    4. अनुक्रम की एक छवि में डबल क्लिक करें और निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र पर एक रॉय बनाने. ROI उपकरण पर जाएं और काउंटूर और ऑटो 1 विकल्प का चयन करें, वृत्त आकार प्रदर्शित होने पर, इसे फ्लोरोसेंट संकेत केंद्र पर रखें और फिर प्रदर्शित विंडो पर बनाएं क्लिक करें ।
      नोट: यह स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि मूल्यों के ऊपर प्रतिदीप्ति की तीव्रता के साथ पिक्सल पर प्रकाश डाला गया (यानी, घाव) और एक आकार जिसके क्षेत्र उल्लिखित पिक्सल गले लगाती है उत्पन्न करता है ।
    5. बनाए गए ROI आकृति की प्रतिलिपि बनाएँ और किसी पृष्ठभूमि ज़ोन पर चिपकाएँ जहाँ कोई संकेत नहीं है.
    6. उपाय rois पर क्लिक करें | प्रतिदीप्ति तीव्रता के मान प्रदर्शित करने के लिए सभी का चयन करें । माउस के साथ डेटा मानों का चयन करने के लिए आगे बढ़ें, दायां बटन क्लिक करें, किसी स्प्रेडशीट पर प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं दबाएं ।

6. डेटा (फ्लोरोसेंट संकेत) सामान्यीकरण

  1. जिस पर संकेत तीव्रता अधिकतम है प्रारंभिक समय बिंदु का चयन करें । सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर संकेत सामान्य करने के लिए आगे बढ़ें:
    समय पाठ्यक्रम के दौरान हर समय बिंदु/अधिकतम संकेत तीव्रता पर संकेत तीव्रता) x १०० ।

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Representative Results

यहां, हम endometriosis के एक heterologous मॉडल बनाने के लिए प्रक्रिया का वर्णन जिसमें घावों की वास्तुकला प्रतिरक्षा चूहों में प्रतिदीप्ति मानव endometriosis के टुकड़े लेबल दाखिल द्वारा संरक्षित है, इस प्रकार गैर इनवेसिव की अनुमति घाव प्रगति की निगरानी । एंडोमेट्रियल टुकड़े के लेबलिंग mcherry व्यक्त करने के लिए इंजीनियर एडीनोवायरस के साथ संक्रमण से हासिल की है, एक प्रोटीन के पास अवरक्त क्षेत्र में प्रतिदीप्ति उत्सर्जक । चित्र 1में, हम मानव एंडोमेट्रियल के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के लिए विज्ञापन-mcherry से संक्रमित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत मनाया । उदाहरण के लिए, लेबल और गैर लेबल दोनों टुकड़ों को शामिल किया गया है ताकि संक्रमित और गैर-संक्रमित ऊतकों (autofluorescence) के बीच प्रतिदीप्ति में अंतर देखा जा सकता है । निगरानी के दौरान, mcherry के लिए संदर्भ तरंग दैर्ध्य के अलावा, फ्लोरोसेंट छवियों उत्तेजना के विभिन्न जोड़े के साथ लिया जाता है/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य फिल्टर (चित्रा 2) ऊतकों की विशेषता फ्लोरोसेंट उत्सर्जन प्रोफ़ाइल को परिभाषित करने के लिए । इस कार्रवाई के प्रयोजन के लिए "अनमिक्स" वास्तविक प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि से घावों से उत्सर्जित और autofluorescence मेजबान ऊतकों और निशान से उत्सर्जित सर्जरी के दौरान क्रमशः । चित्र 3में अनमिक्स प्रक्रिया का एक उदाहरण दिखाया गया है । घाव के आकार में भिन्नता के अनुमानों को बढ़ाता और समय पाठ्यक्रम के दौरान घावों द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेतन को सामान्य करके किया जाता है । इस प्रयोजन के लिए, प्रत्येक समय बिंदु के दौरान पशुओं द्वारा उत्सर्जित कच्चे प्रतिदीप्ति युक्त निगरानी की छवियों को पहले एक साथ एक ही फाइल में असामान्यीकृत (चित्रा 4) लाया जाता है । बाद में प्रतिदीप्ति अमिश्रित है, सामान्यीकृत और एक झूठी रंग छवि के रूप में प्रतिनिधित्व (चित्रा 5). अंत में, विशिष्ट घाव और पृष्ठभूमि संकेतन करने के लिए इसी rois स्वचालित रूप से कार्यक्रम और मात्रा निर्धारित द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं (चित्रा 6). पृष्ठभूमि रॉय संकेतन घाव रॉय सिग्नलिंग और प्रत्येक समय बिंदु में तीव्रता के परिणामों से घटाया है समय बिंदु पर जो तीव्रता अधिकतम है के खिलाफ सामान्यीकृत हैं (चित्रा 7). निगरानी की प्रक्रिया के अंत में, कई हफ्तों के बाद सर्जरी चूहों बलिदान और व्यवहार्य प्रत्यारोपण माउस पेरिटोनियम से जुड़ी बरामद किया जा सकता है (चित्रा 8).

Figure 1
चित्रा 1: विज्ञापन-mcherry संक्रमण के बाद प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ एंडोमेट्रियल टुकड़े का दृश्य । (क) मानव एंडोमेट्रियल टुकड़ा ३७ डिग्री सेल्सियस पर विज्ञापन-mcherry के साथ incubated और 5% सह2 के दौरान 24 एच एक सकारात्मक नमूना के रूप में । (ख) मानव एंडोमेट्रियल टुकड़ा ३७ डिग्री सेल्सियस पर incubated और 5% CO2 बिना विज्ञापन-mcherry एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: रॉ इमेजिंग चूहों में प्रत्यारोपित टुकड़े द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति । चित्र एक विशिष्ट समय बिंदु पर एक ही जानवर द्वारा उत्सर्जित कच्चे प्रतिदीप्ति संकेत के प्रतिनिधि इमेजिंग से पता चलता है । छवियां एक निगरानी सत्र के दौरान vivo इमेजिंग सिस्टम डिवाइस में एक करने के लिए युग्मित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त स्क्रीनशॉट के अनुरूप हैं । चूहों वाले प्रत्येक पैनल (गिने 1 – 5 बाएँ कोने में) छवियों को प्राप्त करने के लिए एक अलग विशिष्ट उत्तेजना/उत्सर्जन जोड़ी फिल्टर का उपयोग करके मनाया प्रतिदीप्ति से मेल खाती है । सही पर पैनल (उपकरण पैलेट) छवियों के अधिग्रहण के लिए चयनित प्रतिदीप्ति मापदंडों दिखाएँ इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पृष्ठभूमि के अनमिक्सिंग घावों से उत्सर्जित विशिष्ट प्रतिदीप्ति बनाम । चित्र में विवो इमेजिंग सिस्टम युग्मित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके घावों से वास्तविक प्रतिदीप्ति को काटना करने के लिए निष्पादित की गई अनमिक्सिंग प्रक्रिया के प्रतिनिधि चित्र दिखाता है । बाएं पैनल पर ग्राफ निशान (ग्रीन लाइन, UMX1), घावों (लाल रेखा, UMX2) और मेजबान ऊतक (नीली रेखा, UMX3 पैनल) द्वारा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के सामान्यीकृत विशिष्ट प्रोफाइल को निरूपित करता है । विभिन्न उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता (X-अक्ष) उज्ज्वल दक्षता (Y-अक्ष) की इकाइयों में दर्शाई जाती है । बस ध्यान दें कि कैसे प्रत्येक विशिष्ट संरचना (यानी, निशान, लेबल घावों और मेजबान ऊतक) एक अलग प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल जो की पहचान करने की अनुमति देता है और उंहें segregating विशेष रूप से एक दूसरे के रूप का उत्सर्जन करता है । सही पैनल पर, निशान (UMX1), घावों (UMX2) और मेजबान ऊतक (UMX3) के लिए विशिष्ट उत्सर्जन प्रोफाइल शुरू करने से उत्पन्न प्रतिदीप्ति चूहों की तस्वीर छवियों पर अध्यारोपित दिखाया जाता है । एक समग्र छवि (समग्र) भी उदाहरण के लिए शामिल किया गया है कि निशान या मेजबान के ऊतकों द्वारा उत्सर्जित से घावों से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के विभाजन को निरूपित करने के लिए । मध्य पैनल छवि विवो इमेजिंग डिवाइस के लिए युग्मित सॉफ्टवेयर के साथ unmixing के लिए चयनित मापदंडों से पता चलता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कच्चे प्रतिदीप्ति घावों से उत्सर्जित की समय पाठ्यक्रम निगरानी । पैनल समय पाठ्यक्रम के दौरान लेबल मानव घावों (शानदार पीले धब्बे) के साथ प्रत्यारोपित एक एकल माउस द्वारा उत्सर्जित कच्चे प्रतिदीप्ति के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है । सर्जरी के बाद समय अंक जिस पर निगरानी की गई थी "दिन (संख्या)" के रूप में चिह्नित किया गया है । उत्सर्जन विज्ञापन उत्तेजन जोड़ी निगरानी के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर प्रत्येक पैनल में संकेत कर रहे हैं/ प्रत्येक पैनल के ऊपरी भाग में एक विशिष्ट कोड (bkg) से पहचाना जाता है जिसमें उस तारीख से संबंधित जानकारी होती है जिस पर प्रतिदीप्ति का अधिग्रहण किया गया था ।

Figure 5
चित्रा 5: घावों द्वारा उत्सर्जित सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति का समय पाठ्यक्रम निगरानी. प्रतिनिधि अमिश्रित करने के लिए इसी छवियों, मानव घावों द्वारा उत्सर्जित सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट संकेतन (इंद्रधनुष रंग के साथ स्पॉट) समय पाठ्यक्रम (सर्जरी के बाद दिनों) के दौरान एक एकल माउस में अध्यारोपित. सर्जरी के बाद समय अंक जिस पर निगरानी की गई थी "दिन (संख्या)" के रूप में चिह्नित किया गया है । प्रत्येक पैनल के निचले भाग में एक विशिष्ट कोड (bkg) से पहचाना जाता है जिसमें उस तारीख से संबंधित जानकारी होती है जिस पर प्रतिदीप्ति का अधिग्रहण किया गया था । दाईं ओर इंद्रधनुष पैलेट रंग हर समय बिंदु पर घावों से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति तीव्रता (रेडियंट दक्षता) की पहचान करता है । ध्यान दें कि प्रारंभिक समय बिंदुओं के दौरान कैसे मजबूत प्रतिदीप्ति तीव्रता (यानी, 1, 5 और 8 दिनों पर घावों के केंद्र में लाल रंग) समय पाठ्यक्रम (यानी, 20 और 25 दिनों में घावों में नीले रंग) के दौरान गिरावट आती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: समय पाठ्यक्रम के दौरान घावों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिमाणन के लिए rois का उपयोग. आंकड़ा समय पाठ्यक्रम के दौरान एक ही माउस में घावों द्वारा उत्सर्जित सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति की छवियों के पैनल से पता चलता है (यानी, चित्रा 5) रोइस के अलावा के साथ (घावों और पृष्ठभूमि delineating) प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिमाणन के लिए. roi 1 और roi 2 समय पाठ्यक्रम के दौरान प्रत्येक दो घावों द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की मात्रा की पहचान करते हैं । बीकेजी समय पाठ्यक्रम के दौरान मेजबान ऊतक (पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति) द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की मात्रा को पहचानें । पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति परिमात्रा के प्रयोजनों के लिए rois से घटाया है । सर्जरी के बाद समय अंक जिस पर निगरानी की गई थी "दिन (संख्या)" के रूप में चिह्नित किया गया है । प्रत्येक समय बिंदु पर अधिग्रहीत छवियां एक विशिष्ट कोड (bkg) के साथ हर एक तारीख जिस पर प्रतिदीप्ति का अधिग्रहण किया गया था से संबंधित जानकारी युक्त के नीचे लेबल रहे है (पहले आठ वर्ष के लिए bkg विस्तार डेटा के बाद अंक (2014)-महीने (10) और दिन (10 से 31)) , एक व्यक्तिगत पहचान कोड (पिछले 6 अंक) और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए इस्तेमाल की विशिष्ट प्रोफाइल (UMX2) सही पक्ष पर इंद्रधनुष पैलेट रंग प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक दृश्य पैमाने प्रदान करता है (रेडियंट दक्षता) घावों से उत्सर्जित पर हर बार बिंदु । नोट कैसे दो घावों (ROI1 और ROI2) में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को प्रारंभिक समय अंक (दिन 1 और 5) और decays समय पाठ्यक्रम के दौरान अंत समय अंक (दिन 20 और 25) पर निंनतम मूल्यों तक पहुंचने में अधिक हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: समय पाठ्यक्रम के दौरान प्रतिदीप्ति तीव्रता का सामान्यीकरण. ऊपरी भाग में सारणी एक माउस (R25) में प्रत्यारोपित दो mcherry लेबल घावों (ROI1 और ROI2) द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति तीव्रता (रेडियंट दक्षता) के मूल्यों के उदाहरण दर्शाते हैं । समय पाठ्यक्रम के दौरान सर्जरी (D5-D25) के बाद विभिन्न दिनों में प्रतिदीप्ति की निगरानी की जाती थी । D5-ग्राफ तल पर समय पाठ्यक्रम के दौरान mcherry क्षय से संक्रमित घावों से उत्सर्जित सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के विशिष्ट पैटर्न को दिखाता है । Y-अक्ष सूत्र का उपयोग करके क्षय का प्रतिशत व्यक्त करने के लिए सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति के मूल्यों से पता चलता है (समय पाठ्यक्रम के दौरान देखा गया हर समय बिंदु/अधिकतम संकेत तीव्रता पर संकेत तीव्रता) x १००. समय अंक (दिन (Dx) सर्जरी प्रत्यारोपण के बाद) जिस पर प्रतिदीप्ति की निगरानी की गई एक्स अक्ष में संकेत दिया जाता है । नोट सर्जरी के बाद पहले 24 एच के दौरान संकेतन की प्रारंभिक वृद्धि, घाव के स्थिरीकरण के लिए इसी, D1-D5 के आसपास प्रतिदीप्ति तीव्रता में चोटी और इसके बाद के क्षय के कारण mcherry के episomal अभिव्यक्ति के लिए समय पाठ्यक्रम के दौरान कृपया क्लिक करें यहां इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: प्रत्यारोपित एंडोमेट्रियल घावों की स्थूल उपस्थिति । प्रतिनिधि छवियों एंडोमेट्रियल घावों की स्थूल उपस्थिति दिखा बलिदान पर निगरानी प्रक्रिया के अंत में चूहों में प्रत्यारोपित कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

इस के साथ साथ विस्तृत प्रोटोकॉल endometriosis के एक पशु मॉडल है जिसमें घावों वास्तुकला प्रत्यारोपण की वास्तुकला संरक्षित है whilst एक साथ mcherry द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के वास्तविक समय आकलन की अनुमति के कार्यान्वयन का वर्णन करता है लेबल एंडोमेट्रियल ऊतक । इस प्रोटोकॉल में, हम विवो इमेजिंग प्रणाली में एक विशिष्ट के उपयोग का वर्णन करते हैं और संबंधित सॉफ्टवेयर को गैर-आक्रामक रूप से लेबल के घाव से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का आकलन करते हैं । प्रत्येक उपयोगकर्ता को अपने संस्थान में उपलब्ध विशिष्ट इमेजिंग डिवाइस और संबंधित सॉफ़्टवेयर के आधार पर प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना चाहिए । निगरानी एक आइसोफ्लूराने गैस संज्ञाहरण मशीन के माध्यम से एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में किया जाता है जो vivo इमेजिंग सिस्टम में एक के साथ युग्मित होता है । घावों द्वारा उत्सर्जित ऑटो-फ्लोरीसेंस के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए, प्रत्यारोपण सर्जरी के कम से तीन दिनों के बाद प्रतिदीप्ति घावों की निगरानी शुरू करने की सिफारिश की जाती है ।

endometriosis के विषमजात माउस मॉडल एक के समान दिखाया गया है पहले प्रत्यारोपण एंडोमेट्रियल टुकड़े हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp)18,19के साथ लेबल में शामिल वर्णित किया गया है । मानव ऊतक टैगिंग के लिए एक रिपोर्टर के रूप में mcherry का उपयोग लेकिन क्योंकि पूर्व के बढ़ाया ऊतक पैठ के gfp पर एक लाभ प्रदान करता है । अपने बड़े उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और उच्च photostability mcherry के कारण एक उज्जवल संकेत है कि intraperitoneal टुकड़े के दृश्य के लिए और अधिक उपयुक्त है उत्सर्जन करता है ।

अपने छोटे आकार एडिनोवायरस के कारण संक्रमण के लिए पसंद के वैक्टर (यानी, लेबलिंग) पूरे ऊतक के टुकड़े के रूप में उन 3 डी संरचनाओं के माध्यम से स्वीकार्य प्रसार प्रदान कर रहे हैं । यहां तक कि ऊतक संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत से अधिक नहीं है के साथ 30 – 35%. इस प्रकार, इस मॉडल की सीमा ऊतक के असक्षम लेबलिंग पर निर्भर करता है और इसके अतिरिक्त adenoviruses द्वारा प्राप्त क्षणिक अभिव्यक्ति. दरअसल, प्रतिदीप्ति को 4-6 सप्ताह से परे मॉनिटर नहीं किया जा सकता क्योंकि यह विज्ञापन-वायरस के एपिसोमल क्षणिक अभिव्यक्ति के कारण उत्तरोत्तर fades । लेबलिंग की दक्षता और निगरानी की अवधि दाता ऊतक को बाधित करने से बढ़ सकती है और विज्ञापन-वायरस के साथ पृथक एकल उपकला/स्ट्रोमल कोशिकाओं को संक्रमित किया जा सकता है जो कि प्राप्तकर्ता चूहों19,20में इंजेक्ट किया जा रहा है । इस तरह के एक दृष्टिकोण, लेकिन, हद तक कम कर देता है जिस पर पशु मॉडल endometriosis के फिजियोलॉजी mimics प्रदान की है कि अस्थानिक मानव घावों एकल उपकला/stromal कोशिकाओं के एक अव्यवस्थित संचय में शामिल नहीं है, बल्कि अच्छी तरह से संरचित में एंडोमेट्रियल ऊतक ।

इस प्रोटोकॉल में, सबसे महत्वपूर्ण कदम ऊतक के लेबलिंग और सबसे विशेष रूप से इष्टतम संक्रमण के लिए आवश्यक विज्ञापन-वायरस की उचित एकाग्रता का निर्धारण है । वास्तव में, 1 x 1010 pfu/एमएल एकाग्रता प्रोटोकॉल में बताया ज्यादातर हमारे अनुभव के आधार पर एक ओरिएन्टेटिव/आम सहमति आंकड़ा है । इष्टतम एकाग्रता के प्रकार और बायोप्सी की गुणवत्ता और/या कितनी जल्दी यह संसाधित है के आधार पर प्रत्येक प्रयोग में अलग हो सकता है । हम इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग में कम से तीन अलग (दो गुना) टिटर्स का परीक्षण करने और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत विज़ुअलाइज़ेशन के आधार पर इष्टतम लेबलिंग प्रदान करने का सुझाव देते हैं ।

हमारे प्रोटोकॉल/मॉडल की स्थापना और एंडोमेट्रियल घावों के प्रारंभिक विकास में फंसा तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है । निगरानी के समय की अवधि के बावजूद विवश है, मॉडल अभी भी अध्ययन और औषधीय यौगिकों के प्रभाव का पता लगाने के लिए इस तरह के रूप में एंटीएंजियोजेनिक या antiestrogenic दवाओं के रूप में समय की एक छोटी अवधि में घाव के आकार पर नाटकीय प्रभाव डालती करने में सक्षम है. मानव ऊतक लेबल के अधिक कुशल और टिकाऊ तरीकों के विकास के लिए एक समेकित तकनीक के रूप में गैर आक्रामक निगरानी प्रसार के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल endometriosis में दवाओं की एक व्यापक रेंज की क्षमता का पता लगाने की उंमीद कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के miguel servet कार्यक्रम के माध्यम से [CP13/00077] feder द्वारा cofounded (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष) और डॉ आर gómez को संमानित किया गया और साथ ही कार्लोस III स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा संमानित डॉ आर gómez करने के लिए [PI14/00547 and PI17/02329] और प्रो A. cano करने के लिए [PI12/02582] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endosampler™ Medgyn 22720 Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium VWR HYCLSH30285.FS Medium
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767 Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 VWR E504-500ML Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days Innovative Research of America SE-121 Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive 3M 780-680 Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal Levantina 367-P101VR20 Petri dishes
Penicillin-Streptomicin Sigma P4333-100ML Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml VWR CODA626616 Syringes
Nitrile gloves, powder-free VWR 112-2754 Gloves
Soft swiss nude mice Charles River SNUSSFE05S Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system Perkin Elmer 124262 In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software) Perkin Elmer --- In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147 Enrichment serum
96-well cell culture treated plates Life technologies 167008 Culture plates
Urine flasks Summedical 4004-248-001 Flasks for washes
Sterile surgical blades (Aesculap Division) Sanycare 1609022-0008 Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g B-BRAUN --- Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg Schering Plough S.A. --- Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL B BRAUN --- Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures COVIDIEN --- Sutures
Desinclor chlorhexidine Promedic SA --- Antiseptic solution
Microscopy DMi8 Leica Mycrosystems --- fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator Thermo Scientific 51026282 Incubator

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References

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जीव विज्ञान मुद्दा १४४ endometriosis विषमजात माउस मॉडल mcherry vivo निगरानी में
endometriosis के एक विषमजात माउस मॉडल में घाव आकार की noninvasive निगरानी
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Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., … More

Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis. J. Vis. Exp. (144), e58358, doi:10.3791/58358 (2019).

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