Summary
Здесь мы представляем протокол для жить изображений дневно обозначенные человека эндометрия фрагментов, привитые на мышах. Этот метод позволяет изучать последствия препаратами выбора размера endometriotic поражения посредством мониторинга и количественной оценки флуоресценции, испускаемых флуоресцентные репортер в реальном времени
Abstract
Здесь мы описываем протокол для реализации гетерологичных мыши модели, в которой прогрессирования эндометриоз может оцениваться в реальном времени через неинвазивного мониторинга флуоресценции, испускаемых имплантированных внематочная эндометрия ткани человека. Для этой цели биопсии эндометрия человека получены от доноров женщин продолжающихся ооцитов. Человека эндометрия фрагменты культивированный присутствии аденовирусов спроектирован, чтобы выразить cDNA для репортера флуоресцентный белок mCherry. После визуализации помечены тканей с оптимальной скоростью флуоресценции после инфекции, впоследствии выбрали для имплантации в получателей мышей. Одну неделю до операции имплантации, oophorectomized получателей мышей, и эстрадиола гранулы находятся подкожно для поддержания выживания и роста поражений. В день операции мыши являются наркотизированных и брюшной полости, осуществляется через небольшой (1,5 см) разрез linea alba. Дневно обозначенные имплантатов являются tweezed, кратко пропитанной клеем и придает перитонеальных слоев. Зашиваются надрезы, и животных осталось вернуть на пару дней. Флуоресцирование, излучаемых endometriotic имплантаты обычно неинвазивным контролируется каждые 3 дня за 4 недели с системой визуализации в естественных условиях. Вариации в размере endometriotic имплантантов может быть оценена в реальном времени путем количественной оценки mCherry сигнал и нормализации против начальный момент времени, показаны максимальные флуоресценции интенсивности.
Традиционные грызунов доклинических моделей эндометриоз не позволяют Неинвазивный мониторинг поражения в режиме реального времени, но скорее позволяют производить оценку воздействия наркотиков assayed в конечной точке. Этот протокол позволяет отслеживать поражений в режиме реального времени и более полезным для изучения терапевтический потенциал наркотиков в доклинических моделях эндометриоза. Основным ограничением модели таким образом, что Неинвазивный мониторинг не возможно более длительных периодов времени из-за episomal выражение Ad-вируса.
Introduction
Эндометриоз является хронические гинекологические расстройства, инициированных имплантации функциональных эндометрия вне полости матки. Эктопическая поражения растут и вызвать воспалительные процессы, ведущие к хронической тазовой боли и бесплодие1. Предполагается, что до 10 – 15% женщин репродуктивного возраста страдают от endometriosis2, и она присутствует в примерно 40 – 50% от бесплодных женщин3. Текущий фармакологического лечения эндометриоза удалось полностью искоренить поражения и не свободной от побочных эффектов4,5. Исследования для более эффективного лечения требует уточнения существующих животных моделей эндометриоза таким образом, что можно надлежащим образом имитировать человека поражений, и воздействие соединений на размер поражения среди прочего могут оцениваться тесно.
Предводитель модели были использованы для имитации эндометриоза, по разработке внематочная поражения гистологически идентичные и подобные сайты как люди6,,78; Однако этические проблемы и высокие экономические издержки связанные с эксперименты с приматов предел их использования9. Следовательно использование мелких животных, особенно грызунов, для реализации моделей-vivo эндометриоза продолжает отдавать предпочтение как позволяет исследования с большим количеством лиц10,11. Эндометриоз может быть наведено в этих животных путем пересадки куски грызунов маточные Рожки («гомологичных модели»)12,13 или эндометрия/endometriotic тканей человека внематочная сайты (гетерологичных модели)14 . В отличие от людей грызуны не сбрасывают их эндометрия ткани и тем самым эндометриоз может не быть разработаны спонтанно в этих видов. Таким образом гомологичных мышь, которую модели эндометриоза подверглись критике с тем, что имплантированных внематочная мыши маточных тканей не отражает характеристик человека endometriotic поражений15.
В гетерологичных модели эндометриоз, где свежий человека фрагменты эндометрия вживляются в иммунодефицитных животных можно имитировать соответствующий физиологии эндометриоза. В обычных гетерологичных модели терапевтическое воздействие соединений интерес обычно оцениваются в конечной точке оценки размера поражения с использованием суппорта16. Очевидным ограничением является, что, таким образом, конечной Животные модели не позволяют изучать динамику имплантации или endometriotic поражение развития с течением времени. Дополнительное ограничение, что использование суппорта не позволяет точные измерения размера поражения. Действительно стандартная ошибка, предоставляемый суппортами находится в том же диапазоне (то есть, миллиметров) размер повреждений, имплантированные в мышей, таким образом ограничивая потенциал этих инструментов для выявления фактического изменения в размер.
Для того, чтобы преодолеть такие ограничения, здесь, мы описываем поколения гетерологичных мышиной модели эндометриоза, в котором спроектирован имплантированных тканей человека выразить репортер m вишня флуоресцентный белок. Обнаружение флуоресцентного сигнала с системой соответствующего изображения позволяет Неинвазивный мониторинг состояния поражения с одновременным количественного определения его размера в режиме реального времени. Таким образом наша модель имеет явные преимущества по сравнению с обычными конечной модели, как он приносит возможность Неинвазивный мониторинг в режиме реального времени и возможность для выполнения более объективной и точной оценки вариации размеров поражения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование образцов человеческой ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике из больницы Университарио La Fe. Все пациенты условии письменного информированного согласия. Исследование с участием животных была одобрена Комитетом институционального ухода животных на Centro де инвестигасьон Принсипи Фелипе де Валенсия, и все процедуры были выполнены следующие руководящие принципы для ухода и использования млекопитающих из национальных институтов здравоохранения.
1. эндометрия ткани сбора и предварительной обработки
- Получите хорошее качество биопсии человеческой аспирата эндометрия с помощью канюли, подключенный к устройству всасывания. Залейте биопсии в колбу, содержащие 10 мл стерильным физиологическим и мыть с нежным ручной агитации.
Примечание: Процедуры на как получить хорошее качество биопсии были ранее описанных17. - Вымойте биопсии любых оставшихся крови или слизи. Повторите этот процесс, поливая ткань для фляги, содержащий свежие солевых столько пальцев при необходимости до тех пор, пока ткань наблюдается чистый.
- Перенос биопсии фрагментов с здоровый внешний вид в раствор, содержащий 10 мл завершить среднего среднего (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1% раствор антибиотика противогрибковое.
- Залить содержимое в 10 см Петри и приступить к нарезать3 штук 5-10 мм с парой скальпели ткани.
2. аденовирусных Transfection эндометрия фрагментов
Примечание: Все материалы, которые будут использоваться в процессе должен вводиться в капюшоне заранее. Взять все, что не будет использоваться в процессе и место колбу с хлоркой. Весь материал, который вступает в контакт с аденовирусных вектор должен быть вылечен с отбеливателем прежде чем выбросить его в контейнере биологической опасности.
- После биопсии были рубленые, принять новый Петри. Пипетка несколько 30 – 50 мкл DMEM капли распространения на протяжении всего блюдо. Оставьте достаточно места между капли, так что они не вступают в контакт.
- Помогал с иглой, прилагается к шприцу, место одного куска фрагмент внутри каждого из среднего капель.
Примечание: Каждая капля должен содержать одну часть эндометрия. - Приготовить рабочий раствор Ad-mCherry путем разбавления 1:20 от mCherry аденовирусных Стоковый раствор [1 x 1010 ОРП/мл]) в среде DMEM средних без антибиотиков (DMEM + 10% фильтруют FBS).
- Отказаться от 100 – 200 мкл Ad-mCherry раствора в скважину на 96-луночных плита, заполнение как многие скважины, как фрагменты доступны в чашке Петри капель (шаг 2.2). Кроме того заполните по крайней мере 3 скважины с аденовирус бесплатно DMEM среднего как отрицательный контроль.
- Помогал с иглой, прилагается к шприцу, передачи каждый из фрагментов в Петри (шаг 2.2) каждому из скважин, содержащий объявление mCherry решение в 96-луночных пластины.
- Место 96 хорошо плита, содержащие фрагменты эндометрия с Ad-mCherry раствор в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 для 16 h.
- Промывают оставшиеся аденовирусов в среде путем передачи тканей в новую плиту 96-луночных заполнены с полным DMEM среднего (с антибиотиками противогрибковые, бесплатно аденовирус) и проинкубируйте 37 ° C с 5% CO2 за 24-48 ч.
Примечание: Не забудьте покрытия с хлоркой, все хорошо пластины и советы, которые вступил в контакт с Ad вирус прежде чем выбросить в контейнер биологической опасности. - Вынуть пластину из инкубатора и поместите его под микроскопом флуоресценции в 568 Нм (красный канал) для тестирования для оптимального маркировки.
- Выбрать самых блестящих осколков и поместить их в новую плиту 96-луночных с свежий полный DMEM среднего (с антибиотиками противогрибковые, бесплатно аденовирус).
- Уплотнение пластину с пластиковой парафин фильм и транспортировки его в зоне свободной от конкретного патогена животного для имплантации эндометрия фрагментов в получателей животных.
3. Создание модели мыши эндометриоза
Примечание: Использовать 6-8 недели-старый Атинические ню (или аналогичных ослабленным штаммы) самок мышей, в конкретных условиях, возбудитель – бесплатно, как получателей животных. Чтобы избежать гормонального цикла зависимых вариации и одновременно рост поражения топлива с эстрадиол, животные, ovariectomized и размещены с 60-дневной версии капсулы, содержащие 18 мг 17 βeta-эстрадиола (217β-E). Придатками и Пелле размещения должны выполняться по крайней мере за одну неделю до прививки эндометрия фрагменты в получателя животных.
-
Овариэктомия
Примечание: Подготовьте хирургической стерилизации материал в капюшоне. Подготовьте оборудование для анестезии и послеоперационного восстановления зоны готовы в той же комнате.- Выполните подкожной инъекции морфина производной в дозе 5 мг/кг в мышь. Пусть отдых 30 мин после инъекции, так как анальгетиков может проявляться эффекты препарата мышей.
- Подключите ингаляционной анестезии оборудование и пусть кислорода и изофлюрановая (2% мг/кг) поток на несколько минут в запечатанном анестезии камеру.
- Ввести животное в зале изофлюрановая анестезии. Подождите 3-5 мин и проверьте, что животные полностью находятся под наркозом, нажав одну из его лапы. Передача животное в области хирургии и поддержания анестезии, поставив маска с непрерывным потоком газа изофлюрановая, охватывающих дыхательных путей.
- После дезинфекции области с chlorohexidine, выполнить поперечной 0,5 см реберного разрез приблизительно на высоте бедра с острыми ножницами.
- Отделите кожу от мышцы, чтобы получить доступ к брюшной полости, выявления белой жировой ткани, которая окружает завязи и убрать яичника с щипцами рассечение.
- Завязывайте узел вокруг маточных труб с рассасывающиеся шовные и затяните его обеспечить соответствующие гемостаз до иссечения яичника.
- Закройте мышечный слой с рассасывающиеся шовные 6-0, а затем закройте кожи с 6-0 не рассасывающиеся шовные. Чистота области снова с антисептическим раствором.
- Повторите эту процедуру для удаления яичника боковое contra.
-
Эстрадиол Пелле имплантат
Примечание: Позаботьтесь, что животное под наркозом во время операции овариэктомия поставить окатышей на тот момент.- Сразу же после завершения процедуры овариэктомия Очистите кожу с антисептическим раствором, вокруг шеи и сделать разрез поперечной подкожной малых (0,5 см) с острыми ножницами в затылке.
- Используйте ножницы, чтобы вскрыть кожу от мышц, делая кармане достаточно большой, чтобы позволить размещение гранулы.
- Вставьте гранулы, содержащие 18 мг 17β-E2 и шовные кожи с не рассасывающиеся шовные 6-0. Чистота области снова с антисептическим раствором.
- Поместите животное в зоне восстановления и администрировать оптимальную дозу долговечные обезболивания для облегчения восстановительного периода.
-
Эндометрия имплантации
Примечание: Позвольте по крайней мере в течение семи дней карантина позволяет полного восстановления животных после овариэктомии перед началом операции имплантации эндометрия фрагмент. Для оптимальной синхронизации с маркировки ткани Соберите биопсии 2 – 3 дня до операции имплантации с тем, чтобы избежать долгосрочных культуры эксплантов.- Получите хирургические комнаты в свободной зоне конкретного возбудителя готовы заранее. Также подготовьте капот с все необходимые хирургические материалы, оборудование для анестезии и послеоперационного восстановления зоны.
- Принесите животных в комнату, выполните подкожной инъекции морфина производной в дозе 5 мг/кг () в каждой мыши. Дайте отдохнуть в течение 30 мин после инъекции так обезболивающие эффекты препарата может проявляться мышей.
- Подключите ингаляционной анестезии оборудование и пусть кислорода и изофлюрановая (2% мг/кг) поток на несколько минут в запечатанном анестезии камеру.
- Перед началом операции, двигаться пластину, содержащие дневно надписью фрагменты (из шага 2.10) в капот, распечатать его и налить в чашку Петри для обработки проще фрагменты.
- Ввести животное в зале изофлюрановая анестезии. Подождите 3-5 мин и проверьте, что животные полностью находятся под наркозом, нажав одну из его лапы. Передача животное в области хирургии и поддержания анестезии, поставив маска с непрерывным потоком газа изофлюрановая, охватывающих дыхательных путей.
- Место наркотизированных животного лицом вверх. Продезинфицируйте брюшной области. Выполните продольной 1,5 см разрез в брюшной полости с острыми ножницами и отделить кожу от мышц. Затем выполните разрез продольной 1,5 см в мышцы для доступа к брюшной полости.
- Удерживайте левый край мышечной стенки живота мини-пинцетом и сложите его пытаются подвергать внутренней поверхности брюшины снаружи.
- Возьмите имплантат эндометрия с помощью пинцета, Мини, кратко вымочить в n бутил Эстер Цианакрилатный клей и поместить его в брюшине, где он будет привязываться. Дайте ему высохнуть в течение нескольких секунд. Повторите шаги 3.3.6 и 3.3.7 поставить имплант на контралатеральную сторону брюшины.
- Закройте мышечный слой с швом рассасывающиеся 6-0, а затем закройте кожи с не рассасывающиеся шовные 6-0. Чистота области снова с антисептическим раствором.
- Поместите животное в зоне восстановления и администрировать оптимальную дозу долговечные анальгезии.
4. в Vivo флуоресцентных изображений с в Vivo, изображений системы
- Включите в естественных условиях устройство обработки изображений системы, инициализировать программу и разрешить CCD камеры остыть в течение нескольких минут.
- Подготовка оборудования ингаляционной анестезии. Откройте изофлюрановая потока на 2% на пару мин для заполнения обезболивающий камеры. Подготовьте зоны восстановления после анестезии.
- После начала программы и ПЗС-камеры остыли, щелкните инструмент Визуализации мастера : учебник начинается с серии последовательных windows отображается, каждый из которых соответствует параметру интерес с несколькими вариантов могут быть использованы нажав на соответствующее поле. Двигаться вперед с учебником, установив соответствующие флажки в каждом окне и нажмите кнопку ОК , чтобы перейти к следующему набору параметров с следующую последовательность.
- Выберите поле Epiluminescence для параметра флуоресценции, выберите поле mCherry для параметра filter пар. Установите флажки фотография режиме и Подтвердить фокус и выберите поле автоматическое для параметра экспозиции.
- После того, как был создан прибор, переместите одно животное в камере анестезии. Когда полностью под наркозом, передачи животное внутри в vivo imaging системы клетки и поместите его в бок вверх с его голову внутрь трубочка, подключенный к машине анестезии. Закройте крышку и нажмите получить для мониторинга.
- Приобрести изображения (в общей сложности пять изображений, один образ для каждой пары фильтров выбран) и сохранение данных, нажав кнопку Сохранить как . Переместите мышь в области восстановления после анестезии. Повторите процесс с остальных животных.
- Повторяйте наблюдение два или три раза в неделю по итогам сигнал надлежащим образом в течение времени.
- Перейти в жертву животное в конце курса время CO2 удушение.
5. Количественная оценка в Vivo флуоресценции изображений
-
Сегрегация фактической флуоресценции через расслоение изображения:
- Откройте в Vivo Imaging анализ сочетании программного обеспечения.
- Выберите файл «Sequenceinfo», чтобы начать анализ. Появится два окна: «Последовательность взгляд» и «Палитра». Выберите Палитру и после отображения меню выберите следующие параметры.
- Выберите исправления и нажмите на поле Адаптивное вычитание фона FL для удаления нежелательных флуоресцентные сигналы из данных светящиеся изображения. Выберите порог наибольший интерес и нажмите кнопку установить.
- Нажмите кнопку спектральные Unmixing, выберите длин волн интерес, метод, выбранный для unmixing (Библиотека, экскурсии, автоматическая или ручная) и нажмите кнопку начать Unmix.
- Выберите Unmixed изображения, соответствующие mCherry сигнала и дважды щелкните. Появится новое окно с окончательное изображение сигнала интерес.
- Повторите шаг 5.1.3.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если требуется представитель изображение (JPEG) unmix результата, выберите нужные параметры в палитру | Изображение отрегулируйте (цвет таблицы биннинга, контраст, и т.д.), а затем выберите команду Экспортировать графику в окне unmix для экспорта текущего представления изображение как изображение.
- Сохраните файл несмешанных: файл | Сохранить как | Выберите папку и ОК.
- Повторите процесс с остальной частью мониторинга дней и со всеми животными.
-
Трансформирования создана и сигнал количественной оценки
- Нажмите кнопку Обзор и выберите файл несмешанных (см. шаг 5.1.8), представляющих интерес для анализа. Появится новое окно.
- Нажмите кнопку Добавить в список , чтобы включить все несмешанных файлы от каждого животного в разное время точки и нажмите на Нагрузку как группа. Все изображения должны появиться как единую последовательность.
- Перейдите в окно Палитры инструментов : нажмите покинуть полендивидуальное шкалу для получения всех изображений на той же шкале.
- Дважды щелкните в одном изображении последовательности и создавать ROI в зоне интереса, используя следующую последовательность. Пойдите к Инструменты ROI и выберите параметр Auto 1 и контурной , нажмите на круглую появляться, поместите его на центре флуоресцентного сигнала и нажмите кнопку создать на открывшемся окне.
Примечание: Это автоматически выделяет пикселей с интенсивностью флуоресценции выше фоновых значений (т.е., поражения) и генерирует форму, OBLASTь которого охватывает изложенные пикселей. - Скопируйте созданный ROI форму и вставьте на фоне зоны там, где нет сигнала.
- Нажмите на мера ROI | Выбрать все для отображения значений интенсивности флуоресценции. Приступить к выбрать значения данных с помощью мыши, щелкните правой кнопкой, нажмите кнопку Копировать и вставить в таблицу.
6. данные (флуоресцентные сигнал) нормализации
- Выберите начальное время точку, в которой сигнал максимальной интенсивности. Перейти к нормализации сигнала на каждом этапе, используя формулу:
Сигнал интенсивности в каждой точке время / интенсивность максимального сигнала наблюдается в течение времени) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описывают процесс создания гетерологичных модели эндометриоза, в котором сохраняется архитектура поражений путем имплантации дневно обозначенные частей человеческого эндометрия в ослабленным мышей, таким образом позволяя неинвазивных мониторинг прогрессирования поражения. Маркировка эндометрия фрагментов достигается инфекции с аденовирус, спроектирован, чтобы выразить mCherry, белок, испуская флуоресценции в регионе ближнего инфракрасного. На рисунке 1мы показываем представитель изображения человека фрагментов эндометрия, инфицированных Ad-mCherry наблюдал под флуоресцентным микроскопом. Для иллюстративных целей маркировку и не помечены фрагменты включены, так что можно отметить различия в флуоресцировании между инфицированных и не инфицированных тканей (аутофлюоресценция). Во время мониторинга, помимо волны ссылка для mCherry, флуоресцентного изображения взяты с различными парами фильтры длин волн возбуждения/выбросов (рис. 2) для определения характерных Флуоресцентные выбросов профиль тканей. Цель этой акции — «unmix», фактические флуоресценции, испускаемых поражения от фона и аутофлюоресценция, испускаемых хост тканей и шрам, возникло во время операции соответственно. Наглядным примером процесса unmix показано на рисунке 3. Оценки изменения в размер поражения осуществляется количественной оценки и нормализующее флуоресцентные сигнализации, испускаемых поражений во время курса. Для этой цели изображения мониторинга, содержащий сырье флуоресценции, испускаемых животных в каждый момент времени впервые собраны вместе ненормализованных (рис. 4) в одном файле. Впоследствии флуоресценции несмешанные, нормализованные и представлены как образ ложный цвет (рис. 5). Наконец ROIs соответствующие конкретные поражения и фона, сигнализации, автоматически признаются программой и количественно (рис. 6). Справочная сигнализации, вычитается из поражения ROI сигнализации и результаты интенсивности в каждом точкой нормализуются против времени точку, в которой максимальная интенсивность ROI (рис. 7). В конце процесса мониторинга через несколько недель после хирургии мышей приносятся в жертву и жизнеспособной имплантат может быть восстановлен придает мыши брюшины (рис. 8).
Рисунок 1: Визуализация фрагментов эндометрия с флуоресцентным микроскопом после инфекции Ad-mCherry. (A) человека эндометрия инкубировали с Ad-mCherry при 37 ° C и 5% CO2 в течение 24 ч в качестве позитивного примера фрагмент. (B) человека эндометрия фрагмент инкубировали при 37 ° C и 5% CO2 без Ad-mCherry как пример отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Raw изображений флуоресценции, испускаемых надписью фрагменты, имплантированные в мышах. На снимке представитель изображений сырья флуоресценции сигнала, излучаемого же животных в определенное время точке. Изображения соответствуют скриншоты, полученных с помощью программного обеспечения, в сочетании с в естественных условиях тепловизионные системы устройства в ходе мониторинга сессии. Каждая группа, содержащая мышей (пронумерованы 1-5 в левом углу) соответствует флуоресценции, наблюдается с помощью различных конкретных возбуждения/выбросов пара фильтра для получения изображений. Группа справа (палитра) показывают флуоресценции параметры, выбранные для приобретения изображений пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: расслоение фон против конкретных флуоресценции испускаемых поражений. Картина показывает, представитель изображения unmixing процесса выполняется вскрыть фактической флуоресценции от поражения, с использованием в естественных условиях тепловизионные системы сочетании программного обеспечения. Граф на левой панели обозначения нормализованных конкретных профилей выбросов флуоресценции шрам (зеленая линия, UMX1), поражения (красная линия, UMX2) и ткани макроорганизма (синяя линия, UMX3 группа). Интенсивности флуоресценции в длинах волн различных выбросов (ось x) представлены в единицах лучистого эффективности (ось y). Просто обратите внимание, как каждой конкретной структуры (то есть шрам, помечены поражений и ткани макроорганизма) выдает различные флуоресценции профиль, который позволяет выявить и разделения их специально формы друг друга. На правой панели, флюоресценция, вытекающих из Запуск профилей конкретных выбросов для СКАР (UMX1), наложенного на фотографию изображений мышей показаны поражений (UMX2) и принимающей ткани (UMX3). Композитные изображения (композитный) также включены в иллюстративных целях для обозначения сегментации флуоресценции, испускаемых поражения от породившего шрам или хост тканями. Средняя группа показывает параметры, выбранные для расслоение с программным обеспечением изображение соединен в естественных условиях устройство обработки изображений пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: курс мониторинг сырья флуоресценции, испускаемых поражения времени. Группа показывает представитель изображения сырье флуоресценции, выбрасываемых одной мыши имплантируются с метками человека поражения (блестящие желтые пятна) в течение времени. Моменты времени после операции, на котором проводился мониторинг обозначаются как «День (число)». Выбросов объявление возбуждения пара фильтров, используемых для мониторинга указаны в каждой группы/изображения. Каждая группа идентифицируется по коду (BKG) в верхней части, содержащие информация, связанные с даты, на которой была приобретена флуоресценции.
Рисунок 5: курс мониторинг времени нормализуются флуоресценции, испускаемых поражений. Представитель изображения соответствует несмешанные, нормализованных флуоресцентные сигнализации испускаемого человека поражения (пятна с цвета радуги), наложенного в одной мыши во время курса (дней после операции). Моменты времени после операции, на котором проводился мониторинг обозначаются как «День (число)». Каждая группа идентифицируется по коду (BKG) в нижней части, содержащие информация, связанные с даты, на которой была приобретена флуоресценции. Палитра цвета радуги на правой стороне идентифицирует флуоресценции интенсивности (лучистого эффективность) испускаемых поражений в каждый момент времени. Обратите внимание как сильной интенсивности флуоресценции в ходе начального времени пунктов (т.е., красный цвет в центре поражений на 1,5 и 8 дни) снижение в течение времени (т.е., голубой цвет в поражении дни 20 и 25). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: использование трансформирования для количественной оценки интенсивности флуоресценции в поражений в ходе времени. Рисунок показывает панель изображений нормализованных флуоресценции, испускаемых поражений в одной мыши во время курса (т.е., рис. 5) с добавлением трансформирования (разграничение поражений и фона) для количественной оценки интенсивности флуоресценции. ROI 1 и ROI 2 определить количество флуоресцирования, излучаемого каждым из двух поражений в ходе времени. BKG определить количество флуоресцирования, испускаемых ткани макроорганизма (фон флуоресценции) в течение времени. Фон флуоресценции вычитается из трансформирования для целей количественной оценки. Моменты времени после операции, на котором проводился мониторинг обозначаются как «День (число)». Изображения, полученные в каждый момент времени помечены с конкретным кодом (BKG) в нижней части каждого один содержащие информация относящиеся к даты в которых флуоресценции был приобретенных (первые восемь цифр, после BKG подробные данные за год (2014)-месяц (10) и - день (10 до 31)) , индивидуальный идентификационный код (последние 6 цифр) и конкретных профилей выбросов флуоресценции для unmixing (UMX2) радуги палитру цветов на правой стороне обеспечивает визуальный шкала интенсивности флуоресценции (лучистого эффективность) испускаемых поражения на каждый момент времени. Примечание как значения интенсивности флуоресценции в двух поражений (ROI1 и ROI2) выше на начальное время очков (дней 1 и 5) и распадается в течение времени достичь наименьшие значения в конце момента времени (дней, 20 и 25). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: нормализация интенсивности флуоресценции в ходе времени. В таблице в верхней части примера значения интенсивности флуоресценции (лучистого эффективность) испускаемых двух mCherry помечены поражений (ROI1 и ROI2), имплантированные в мышь (R25). Мониторинга флуоресценции была исполнена на разные дни после операции (D5-D25) в течение времени. D5 - граф внизу иллюстрирует типичный шаблон нормализованных флуоресценции, испускаемых поражений, инфицированных mCherry, распадаясь в течение времени. Ось y показывает значения флуоресценции, нормированный выразить процент распада с помощью формулы (сигнал интенсивности в каждый момент времени интенсивности максимального сигнала, отмеченный в течение времени) x 100. Время очков (дней (Dx) после имплантации хирургии) на которой флуоресценции контролировался указаны в оси x. Примечание первоначальное увеличение сигнализации в течение первых 24 ч после операции, соответствующий стабилизации поражения, пика интенсивности флуоресценции вокруг D1-D5 и его последующего распада из-за episomal выражение mCherry в течение времени , пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: макроскопический появление имплантированных endometriotic поражений. Представитель фото показаны макроскопических появление endometriotic поражений, имплантированные в мышах в конце процесса мониторинга на жертву пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол здесь подробно описывает реализацию животной модели эндометриоз, в котором архитектура имплантации поражения архитектура сохраняется пока одновременно позволяет реального времени оценки флуоресценции испускаемого mCherry с меткой эндометрия ткани. В этом протоколе мы описывают использование определенной в естественных условиях тепловизионные системы и соответствующего программного обеспечения неинвазивно оценить флуоресценции, испускаемых помечены поражение. Каждый пользователь должен адаптировать протокол в зависимости от конкретных изображений устройства и программное обеспечение доступно в их учебном заведении. Мониторинг осуществляется на наркотизированных животных через изофлюрановая газ анестезия машины в сочетании с системой визуализации в естественных условиях. Чтобы избежать вмешательства с авто флуоресценции испускаемых раны, рекомендуется начать мониторинг поражений флуоресценции по меньшей мере через три дня после операции имплантации.
Гетерологичных мыши модели эндометриоза, подобный показанному здесь были ранее описаны состоящий в имплантации фрагменты эндометрия, помечены18,Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)19. Использование mCherry как репортер для пометки тканей человека обеспечивает однако преимущество над GFP из-за проникновения расширенной ткани бывшего. Из-за его большего спектра излучения и выше светостойкость mCherry выдает сигнал ярче, который является более подходящим для визуализации внутрибрюшинного фрагментов.
Из-за ее небольшой размер аденовирусов являются вектора выбора для инфекции (например, маркировка) из цельной ткани частей, как те обеспечивают приемлемые диффузии через 3D конструкций. Даже при том что доля ткани инфицированных клеток не выше 30-35%. Таким образом ограничение этой модели опирается на неэффективные маркировки ткани и дополнительно переходные выражение, достигнутые аденовирусов. Действительно флуоресценции не может контролироваться за 4 – 6 недель, как он постепенно исчезает из-за episomal переходных выражение Ad-вируса. Эффективности маркировки и период мониторинга может быть увеличена на срыв тканей донора и заражая изолированных одного эпителиальных/стромальные клетки с ад вирусом предшествовавших вводят в получателей мышей19,20. Такой подход, однако, уменьшает степень, в которой животную модель имитирует физиологии эндометриоз, при том условии, что внематочной поражения человека состоит не в дезорганизованы совокупность единичных клеток эпителия/стромальный а в структурированной endometriotic ткани.
В этом протоколе наиболее важным этапом является маркировка тканей и наиболее конкретно определение соответствующей концентрации вируса ад, необходимые для оптимального инфекции. Действительно 1 x 1010 ОРП/мл концентрация указал в протоколе является главным образом рисунок ориентировочно/консенсус, основанный на нашем опыте. Оптимальная концентрация могут отличаться в каждом эксперименте в зависимости от типа и качества биопсии или как быстро это обрабатывается. Таким образом мы предлагаем тестирование по крайней мере три различных титры (два раза) в каждом эксперименте и выбор одного, обеспечивая оптимальное маркировки на основе визуализации под флуоресцентным микроскопом.
Наша модель протокол является полезным для изучения механизмов, причастных к созданию и раннего развития endometriotic поражений. Несмотря на период времени мониторинга ограничен, эта модель все еще полезна для изучения и выявления воздействия фармакологических соединений могут оказать резкое воздействие на размер поражения в течение короткого времени, такие как антиангиогенные или антиэстрогенной препараты. Разработки более эффективных и долговременных методов маркировки тканей человека ожидается распространение Неинвазивный мониторинг как сводный способ исследовать потенциал терапевтического более широкого круга наркотиков в доклинических моделей эндометриоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана испанским министерством экономики и конкурентоспособности через Мигель Сервет программу [CP13/00077] создана ФЕДЕР (Европейский фонд регионального развития) и присуждена к д-р р. Гомес, а также Карлос III институт здравоохранения гранты Dr R Гомес [ПЭ14/00547 и PI17/02329] и профессор а. Кано [ПЭ12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
