Summary
Här presenterar vi ett protokoll för live-imaging av fluorescently märkt mänskliga livmodercancer fragment ympas in möss. Metoden gör det möjligt att studera effekterna av droger val på endometriotic lesionsstorlek genom övervakning och kvantifiering av fluorescens som avges av fluorescerande reportern på realtid
Abstract
Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av ett heterologt musmodell där progression av endometrios kan bedömas i realtid genom icke-invasiv övervakning av fluorescens som avges av implanterade ektopisk mänsklig livmodercancer vävnad. För detta ändamål erhålls biopsier av mänskliga endometriet från givare kvinnor pågående äggcellen donation. Mänskliga livmodercancer fragment är odlade i närvaro av adenoviruses konstruerad att uttryckliga cDNA för den reporter fluorescerande protein mCherry. Vid visualisering, märkt vävnader med en optimal frekvens av fluorescens efter infektion väljs därefter för implantation i mottagarens möss. En vecka före implantation kirurgi, mottagarens möss är oophorectomized och estradiol pellets placeras subkutant för att upprätthålla överlevnad och tillväxt av lesioner. På operationsdagen är möss sövda och peritoneal hålighet nås genom en liten (1,5 cm) snitt av linea-alba. Fluorescently märkta implantat är tweezed, kortfattat indränkt i lim och bifogas peritoneal lagret. Snitt är sys, och djur kvar för att återvinna för ett par dagar. Fluorescens som avges av endometriotic implantat är oftast icke-invasivt övervakas varje 3 dagar i 4 veckor med ett in vivo imaging system. Variationer i storlek av endometriotic implantat kan beräknas i realtid genom kvantifiering av mCherry signal och normalisering mot den första tidpunkt visar maximal fluorescensintensiteten.
Traditionella prekliniska gnagare modeller av endometrios tillåter inte icke-invasiv övervakning av lesion i realtid men snarare möjliggöra utvärdering av effekterna av narkotika analyseras vid slutpunkten. Detta protokoll gör att man kan spåra lesioner i realtid och är mer användbar för att undersöka den terapeutiska potentialen av droger i prekliniska modeller av endometrios. Den största begränsningen av frigjorda-modellen är att icke-invasiv övervakning inte är möjligt under en längre tid på grund av ett episomal uttryck för Ad-virus.
Introduction
Endometrios är en kronisk gynekologisk sjukdom som initierats av implantation av funktionella livmoderslemhinnan utanför livmoderhålan. Ektopisk lesioner växer och inducerar inflammatoriska processer som leder till kronisk bäcken smärta och infertilitet1. Det uppskattas att upp till 10 – 15% av kvinnor i fertil ålder är drabbade av endometriosis2, och det är närvarande i cirka 40 – 50% av infertila kvinnor3. Aktuella farmakologiska behandlingar för endometrios är inte att helt utrota lesioner och inte fria från biverkningar4,5. Forskning för effektivare terapier kräver av förfiningen av de befintliga djurmodeller av endometrios på ett sådant sätt att människors lesioner kan vara lämpligt härmade och effekterna av föreningar på lesionsstorlek bland annat kan bedömas noggrant.
Primate modeller har använts för att efterlikna endometrios genom att implantera ektopisk lesioner histologiskt identiska och på liknande platser som människor6,7,8. dock relaterade etiska betänkligheter och de höga ekonomiska kostnaderna till experiment med primater gräns deras användning9. Följaktligen, användning av små djur, speciellt gnagare, för genomförandet av in vivo-modeller av endometrios fortsätter att vara gynnad eftersom det tillåter studier med större antal individer10,11. Endometrios kan induceras hos dessa djur av omplantering antingen bitar av gnagare livmoderns horn (”homologa modeller”)12,13 eller mänsklig endometriehyperplasi/endometriotic vävnad till ektopisk webbplatser (heterologa modeller)14 . I motsats till människor, gnagare utgjuta inte deras livmodercancer vävnad och därmed endometrios kan inte utvecklas spontant i dessa arter. Homologa mus modeller av endometrios har kritiserats på grund av att implanteras ektopisk mus uterin vävnad avspeglar därför inte kännetecknen av mänskliga endometriotic lesioner15.
Lämpliga fysiologi endometrios kan vara härmade i heterologa modeller av endometrios där färska mänskliga livmodercancer fragment implanteras i nedsatt immunförsvar djur. I konventionella heterologa modeller bedöms de terapeutiska effekterna av föreningar av intresse vanligen vid slutpunkten av bedömningen av mållesionens storlek med hjälp av bromsok16. En uppenbar begränsning är att, som sådan, endpoint djurmodeller inte tillåter studerar implantation dynamics eller endometriotic lesion utveckling över tid. En ytterligare begränsning är att användningen av bromsok inte tillåter noggranna mätningar av mållesionens storlek. Standardfel som tillhandahålls av bromsok är faktiskt i samma intervall (dvs millimeter) i samma storlek som de lesioner som implanteras i möss, vilket begränsar kapaciteten av dessa verktyg att upptäcka faktiska variationer i storlek.
För att övervinna sådana begränsningar, beskriver vi häri, generering av ett heterologt musmodell av endometrios där implanterade mänsklig vävnad är konstruerad för att uttrycka en reporter m-Cherry fluorescerande protein. Påvisande av fluorescerande signalen med en lämplig bild system möjliggör icke-invasiv övervakning av lesion status med samtidiga kvantifiering av dess storlek i realtid. Vår modell ger således tydliga fördelar jämfört med konventionella endpoint modeller eftersom det ger möjlighet för icke-invasiv övervakning i realtid och möjligheten att utföra mer objektiva och korrekt uppskattning av variationer i lesionsstorlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av mänsklig vävnad exemplar godkändes av den institutionella Review Board och etikkommittén Hospital Universitario La FE. Alla patienter som skriftligt informerat samtycke. Studien som involverar djur godkändes av utskottet institutionella djur vård vid Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, och alla procedurer utfördes efter riktlinjerna för skötsel och användning av däggdjur från de nationella instituten av hälsa.
1. livmodercancer vävnad insamling och förbehandling
- Få en god kvalitet biopsi av mänskliga livmodercancer aspirera med hjälp av en kanyl som bifogas en suganordning. Häll biopsi i en kolv som innehåller 10 mL steril saltlösning och tvätta med mild manuell agitation.
Obs: Förfarandena att få bra kvalitet biopsier har varit tidigare beskrivna17. - Tvätta biopsi av återstående blod eller slem. Upprepa processen genom att hälla vävnaden som kolvar som innehåller färska saltlösning så många pinnar som krävs tills vävnad observeras ren.
- Överföring biopsi fragment med ett friskt utseende till en lösning innehållande 10 mL komplett Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) medium med 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 1% antibiotika-antimycotic lösning.
- Häll innehållet i ett 10 cm petriskål och fortsätt att hacka vävnaden i 5 – 10 mm3 bitar med ett par skalpeller.
2. adenovirala Transfection av livmodercancer fragment
Obs: Allt material som kommer att vara anställd i processen bör införas i huven i förväg. Ta ut allt som inte kommer att användas i processen och placera en kolv med blekmedel. Alla material som kommer i kontakt med adenovirala vektorn desinficeras med lut innan kasta det i behållaren biohazard.
- När biopsin har blivit hackad, ta en ny petriskål. Pipettera flera 30 – 50 µL DMEM droppar spreds över hela skålen. Lämna tillräckligt med utrymme mellan droppar så de inte kommer in i kontakt.
- Hjälp med en injektionsnål till sprutan, placera en enda bit av fragmentet inuti varje medium sjunker.
Obs: Varje droppe bör innehålla ett enda stycke av endometriet. - Förbereda Ad-mCherry arbetslösning genom spädning 1:20 mCherry adenovirala stamlösning [1 x 1010 pfu/mL]) i DMEM medium utan antibiotika (DMEM + 10% filtrerat FBS).
- Dispensera 100 – 200 μL Ad-mCherry lösning per brunn på en plattan med 96 brunnar, fylla så många brunnar som fragment finns i petriskål dropparna (steg 2.2). Dessutom Fyll minst 3 brunnar med adenovirus gratis DMEM medium som en negativ kontroll.
- Hjälp med en injektionsnål till sprutan, överföra varje fragment i petriskål (steg 2.2) till var och en av brunnarna som innehåller ad-mCherry lösning i plattan med 96 brunnar.
- Placera 96 väl-plattan som innehåller livmodercancer fragment med Ad-mCherry lösning i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 för 16 h.
- Tvätta ut de återstående adenoviruses medium genom att överföra vävnader till en nya plattan med 96 brunnar fyllda med komplett DMEM medium (med antibiotika-antimykotika, utan adenovirus) och inkubera i 37 ° C med 5% CO2 för 24-48 h.
Obs: Kom ihåg att täcka med blekmedel alla plattor och tips som kom i kontakt med Ad-virus innan kasta i behållaren för biohazard. - Ta ut plåten ur ruvmaskinen och placera den i fluorescens Mikroskop på 568 nm (röd kanal) att testa för optimal märkning.
- Välja de mest lysande fragment och placera dem i en ny plattan med 96 brunnar med färska komplett DMEM medium (med antibiotika-antimykotika, utan adenovirus).
- Försegla plattan väl med en plast paraffin film och transportera det till in i specifika-patogenfria animaliska området för implantering av livmodercancer fragment i mottagarens djur.
3. generation av endometrios musmodell
Obs: Använd 6 – 8 veckors-gamla atymiska naken (eller liknande immunsupprimerade stammar) honmöss inrymt i specifika patogener – gratis villkor, som mottagaren djur. För att undvika hormonella cykel-beroende variationer och samtidigt bränsle lesion tillväxt med estradiol, är djur ovariectomized och placeras med 60 dagars release kapslar som innehåller 18 mg 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Ooforektomi och pellet placering måste utföras minst en vecka i förväg om ympning livmodercancer fragment i mottagarens djuren.
-
Ooforektomi
Obs: Förbereda kirurgiska steriliserat material med huva. Förbereda anestesiutrustning och postoperativ återhämtning zon redo i samma rum.- Utföra en subkutan injektion med morfin derivat vid en dos på 5 mg/kg per mus. Låt mössen vila i 30 min efter injektion så som analgetika effekterna av drogen kan manifesteras.
- Anslut inandning anestesi utrustning och låt syre och isofluran (2% mg/kg) flödet för några min i en förseglad anestesi kammare.
- Införa djuret in i kammaren med isofluran i narkos. Vänta 3 – 5 min och kontrollera att djuren bedövas fullt ut genom att trycka på en av tassarna. Överföra djuret till området kirurgi och underhålla anestesi genom att placera en mask med kontinuerligt flöde av isofluran gas som täcker luftvägarna luftvägarna.
- Efter desinfektion området med chlorohexidine, utföra ett tvärgående 0,5 cm costal snitt ungefärligt på höjd av höften med vass sax.
- Separera huden från muskler för att få tillgång till bukhålan, identifiera den vita fett pad som omger äggstocken och återkalla äggstocken med dissektion pincett.
- Knyt en knut runt i äggledaren med resorberbar sutur och dra den för att säkerställa lämpliga hemostas innan excising äggstocken.
- Stäng den muskulösa lagret med 6-0 resorberbar sutur, och stäng sedan huden med 6-0 icke-resorberbar sutur. Ren området igen med antiseptisk lösning.
- Upprepa proceduren för att ta bort contra laterala äggstocken.
-
Estradiol pellet implantat
Obs: Ta hand att djuret är sövd under operationen ooforektomi att placera pellets på den punkten.- Omedelbart efter slutförandet av förfarandet ooforektomi, rengör huden med antiseptisk lösning kring halsen och gör en tvärgående subkutan liten (0,5 cm) snitt med vass sax i nacken.
- Använda saxen för att dissekera huden från muskeln, att göra en ficka som är tillräckligt stor för att tillåta utsläppande pellets.
- Infoga den pellets som innehåller 18 mg 17β-E2 och suturera huden med en 6-0 icke-resorberbar sutur. Ren området igen med antiseptisk lösning.
- Placera djuret i zonen återhämtning och administrera en optimal dos av långvarig smärtlindring att lindra återhämtningsperioden.
-
Livmodercancer implantatkirurgi
Obs: Låt åtminstone en period av sju dagar i karantän så att full kostnadstäckning för djur efter ooforektomi innan livmodercancer fragment implantation kirurgi. För optimal synkronisering med märkning av vävnad, samla biopsi 2 – 3 dagar före implantation kirurgi för att undvika långtidsodling av bladsticklingar.- Redo kirurgiska rummet i specifika patogener frizonen i förväg. Förbereda huven med alla krävs kirurgiska material, anestesiutrustning och zonen postoperativ återhämtning också.
- Ta djuren till rummet, utföra en subkutan injektion med morfin derivat vid en dos på 5 (mg/kg) i varje mus. Låt mössen vila i 30 min efter injektion så analgetika effekterna av drogen kan manifesteras.
- Anslut inandning anestesi utrustning och låt syre och isofluran (2% mg/kg) flödet för några min i en förseglad anestesi kammare.
- Innan du börjar kirurgi, flytta plattan som innehåller fluorescently märkt fragment (från steg 2.10) till huven, unseal det och häll fragment i en petriskål för enklare hantering.
- Införa djuret in i kammaren med isofluran i narkos. Vänta 3 – 5 min och kontrollera att djuren bedövas fullt ut genom att trycka på en av tassarna. Överföra djuret till området kirurgi och underhålla anestesi genom att placera en mask med kontinuerligt flöde av isofluran gas som täcker luftvägarna luftvägarna.
- Placera den sövda djuren med framsidan. Desinficera området ventrala. Utföra en längsgående 1.5 cm snitt i buken med vass sax och separera huden från muskeln. Utför sedan en längsgående 1.5 cm snitt i muskler för att komma åt i bukhålan.
- Håll den vänstra kanten av buken muskulösa väggen med mini pincett och vik det försöker avslöja den inre ytan av bukhinnan på utsidan.
- Ta ett livmodercancer implantat med mini pincett, blöta det kortfattat i en n-butyl-ester cyanoakrylatlim och placera det till bukhinnan där det kommer att få fäst. Låt torka i några sekunder. Upprepa steg 3.3.6 och 3.3.7 att placera implantat på den kontralaterala sidan av bukhinnan.
- Stäng den muskulösa lagret med en absorberbara 6-0 sutur, och stäng sedan huden med en icke-absorberbara 6-0 sutur. Ren området igen med antiseptisk lösning.
- Placera djuret i zonen återhämtning och administrera en optimal dos av långvarig smärtlindring.
4. i Vivo fluorescerande Imaging med en i Vivo Imaging System
- Slå på systemet i vivo bildenheten, initiera programmet och tillåter CCD kameran svalna några min.
- Förbereda den inandning anestesiutrustning. Öppna isofluran flödet på 2% för ett par av min att fylla bedövningsmedel kammaren. Förbereda zonen efter anestesi återhämtning.
- När programmet har startats och CCD kameran har svalnat, klicka på verktyget Imaging Wizard : en handledning börjar med en serie av på varandra följande windows visas, var och en motsvarar en parameter av intresse med flera alternativ kan väljas genom att klicka i motsvarande ruta. Flytta framåt genom handledning genom att markera lämpliga rutor i varje fönster och klicka på OK -knappen för att flytta till nästa uppsättning av parametrar med följande sekvens.
- Välj Epiluminescence box för parametern fluorescens, mCherry box för parametern filter par. Du fotografera läge och Bekräfta fokus kryssrutorna och markera rutan automatisk för parametern exponering.
- När instrumentet har ställts in, flytta ett djur inne i anestesi kammaren. När fullt anesthetized, överföra djuret släpper den i vivo imaging system bur och placera den sida upp med huvudet inne en tubuli ansluten till anestesi maskinen. Stäng locket och klickar på Hämta för övervakning.
- Förvärva de bilder som visas (totalt fem bilder, en bild för varje par med filter som har valts) och spara data genom att klicka på knappen Spara som . Flytta musen till området efter anestesi återhämtning. Upprepa processen med de återstående djuren.
- Upprepa övervakning två eller tre gånger i veckan till uppföljning signalen på lämpligt sätt under tiden.
- Fortsätt att offra djur i slutet av Tidsförloppet av CO2 kvävning.
5. kvantifiering av In Vivo fluorescens bilder
-
Segregation av faktiska fluorescens genom bilden minoriteter:
- Öppna den In Vivo Imaging analys tillsammans programmet.
- Välj filen ”Sequenceinfo” att starta analysen. Två fönster visas: ”sekvens Visa” och ”verktygspaletten”. Välj Verktygspaletten och när menyn har varit visas väljer du följande alternativ.
- Välj korrigeringar och klicka på rutan Adaptiv FL bakgrund subtraktion ta bort oönskade fluorescerande signalerna från självlysande bilddata. Välja tröskeln till störst intresse och klicka på Ange.
- Klicka på spektral Unmixing, Välj våglängderna av intresse, vilken metod som valts för unmixing (bibliotek, guidade, automatisk eller manuell) och klicka på starta Unmix.
- Välj den oblandade bild motsvarar mCherry signal och dubbel klick. Ett nytt fönster visas med den slutliga bilden av signalen av intresse.
- Upprepa steg 5.1.3.
- Valfritt: Om en representativ bild (JPEG) av unmix resultatet behövs, Välj önskade inställningar i verktygspaletten | Bild justera (färg tabell binning, kontrast, osv.), och klicka sedan på Exportera grafik i fönstret unmix att exportera den aktuella vyn av bilden som en bild.
- Spara filen oblandade: fil | Spara som | Välj mapp och Ok.
- Upprepa processen med resten av de övervakning dagarna och med alla djur.
-
ROIs inrättas och signalera kvantifiering
- Klicka på Bläddra och välj den oblandade fil (se steg 5.1.8) av intresse som skall analyseras. Ett nytt fönster visas.
- Klicka Add To List för att inkludera alla oblandade filer från varje djur vid olika tidpunkter och klicka sedan på Belastning som en grupp. Alla bilder måste visas som en enda sekvens.
- Gå till Verktyget palett fönster: Klicka på rutan jagindividuella skala för att få alla bilder på samma skala.
- Dubbelklicka på en bild av sekvensen och skapa en ROI på zonen av intresse med hjälp av följande sekvens. Gå till ROI-verktyg och markera konturerna och alternativet Auto 1 , klicka på formen cirkel visas, placera den på center fluorescerande signalen och klicka sedan på skapa på fönstret som visas.
Obs: Detta automatiskt belyser pixlar med en intensitet av fluorescens över bakgrunden värden (dvs., lesion) och genererar en form vars område omfamnar de konturerade pixlarna. - Kopiera den skapa ROI-formen och klistra på en bakgrund zon där ingen signal.
- Klicka på åtgärd ROIs | Markera alla att visa värden av fluorescensintensiteten. Fortsätt att välja datavärden med musen, klicka höger knapp, tryck på Kopiera och klistra in i ett kalkylblad.
6. datanormalisering (fluorescerande signal)
- Välj den första tidpunkt vid vilken signal intensiteten är maximal. Gör att normalisera signal vid varje tidpunkt med hjälp av formeln:
Signalera intensitet vid varje tidpunkt / Maximal signalintensitet observerats under kursens gång) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här, beskriver vi processen för att skapa ett heterologt modell av endometrios där arkitekturen av lesioner bevaras genom att implantera fluorescently märkt bitar av mänskliga endometriet till immunsupprimerade möss, vilket möjliggör icke-invasiv övervakning av lesion progression. Märkning av livmodercancer fragment uppnås genom infektion med adenovirus konstruerad att uttryckliga mCherry, ett protein som avger fluorescens i nära infraröda området. I figur 1visar vi representativa bilder av mänskliga livmodercancer fragment infekterade med Ad-mCherry observerades under mikroskopet fluorescens. För illustrativa syften ingår både märkta och icke-märkta fragment så skillnader i fluorescens mellan infekterade och icke-infekterade vävnader (autofluorescens) kan noteras. Under övervakning, förutom våglängden som referens för mCherry, tas fluorescerande bilderna med olika par av excitation/utsläpp våglängder filter (figur 2) för att definiera den karakteristiska fluorescerande utsläpp profilen av vävnader. Syftet med denna åtgärd är att ”unmix” faktiska fluorescens som avges av lesioner från bakgrunden och autofluorescens som avges av värd vävnader och ärr sitt ursprung under kirurgi respektive. Ett illustrativt exempel av unmix processen visas i figur 3. Anseende av variation i lesionsstorlek utförs av kvantifiera och normalisera fluorescerande signalering som alstras av lesioner under kursens gång. För detta ändamål förs bilder av övervakning som innehåller råa fluorescens som alstras av djur under varje tidpunkt först samman unnormalized (figur 4) i en enda fil. Därefter är fluorescens oblandade, normaliserat och representerade som en falsk färgbild (figur 5). Slutligen, ROIs motsvarar specifika lesion och bakgrunden signalering automatiskt identifieras av programmet och kvantifieras (figur 6). Bakgrund ROI signalering subtraheras från lesionen ROI signalering och resultaten av intensiteten i varje tid punkt är normaliserade mot den tidpunkt vid vilken intensitet är maximal (figur 7). I slutet av övervakningsprocessen bifogas flera veckor efter kirurgi möss offras och livskraftig implantatet kan återställas mus bukhinnan (figur 8).
Figur 1: visualisering av livmodercancer fragment med fluorescens Mikroskop efter Ad-mCherry infektion. (A) mänskliga livmodercancer fragmentet inkuberas med Ad-mCherry vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 h som ett positivt exempel. (B) mänskliga livmodercancer fragment inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2 utan Ad-mCherry som negativa kontrollprov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Raw imaging fluorescens som avges av märkta fragment som implanteras i möss. Bilden visar representativa avbildning av rå fluorescens signal som avges av samma djur vid en specifik tidpunkt. Bilder motsvarar skärmdumpar som erhålls med hjälp av programvara som kopplas till en Invivo bildenhet systemet under en övervakning session. Varje panel innehåller möss (numrerade 1 – 5 i det vänstra hörnet) motsvarar den fluorescens observeras med hjälp av olika specifika excitation/utsläpp par filter för bilder. Panelen till höger (verktygspaletten) Visa fluorescens parametrar valts för förvärv av bilder vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: minoriteter av bakgrunden vs specifika fluorescens som avges av lesioner. Bilden visar representativa bilder av unmixing processen utförs för att dissekera verklig fluorescens från lesioner använder i vivo imaging system kopplat programvara. Diagram på den vänstra panelen beteckna normaliserade specifika profiler av fluorescens utsläpp av ärr (gröna linjen, UMX1), lesioner (röda linjen, UMX2) och värd vävnad (blå linje, UMX3 panel). Fluorescensintensiteten vid olika utsläpp våglängder (x-axeln) är representerad i enheter av strålande effektivitet (y-axeln). Bara Observera hur varje specifik struktur (dvs, ärr, märkt lesioner och värd vävnad) avger en annan fluorescens-profil som gör det möjligt att identifiera och segregerande dem specifikt formulär varandra. På den högra panelen, fluorescens uppkommer lanserar specifika utsläppet profiler för ärr (UMX1), visas lesioner (UMX2) och värd vävnad (UMX3) staplade på fotografi bilder av möss. En sammansatt bild (komposit) ingår också för illustrativa syften att beteckna segmentering av fluorescens som avges av lesioner från som avges av ärr eller värd vävnader. Mellersta panelen visar parametrar som valts för minoriteter med bildbehandlingsprogram kopplat till Invivo bildenheten vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: tid kursen övervakning av rå fluorescens som avges av lesioner. Panelen visar representativa bilder av rå fluorescens som avges av en enda mus implanteras med märkt mänskliga lesioner (lysande gula fläckar) under tiden. Tidpunkter efter kirurgi där övervakning utfördes betecknas som ”dag (antal)”. Utsläpp ad excitation par filter används för att övervaka anges i varje panel/bild. Varje panel identifieras av en särskild kod (BKG) i den övre delen som innehåller information som relaterade till datumet som förvärvades fluorescens.
Figur 5: tid kursen övervakning av normaliserade fluorescens som avges av lesioner. Representativa bilder motsvarar oblandade, normaliserade fluorescerande signalering som avges av mänskliga lesioner (fläckar med regnbågens färger) ovanpå i en enda mus under tiden jagar (dagar efter operation). Tidpunkter efter kirurgi där övervakning utfördes betecknas som ”dag (antal)”. Varje panel identifieras av en särskild kod (BKG) i den nedre delen som innehåller information som relaterade till datumet som förvärvades fluorescens. Rainbow palettfärg på höger sida identifierar fluorescensintensiteten (strålande effektivitet) som avges av lesioner vid varje tidpunkt. Observera hur stark fluorescensintensiteten under inledande tid punkter (dvs röd färg i mitten av lesioner på dag 1,5 och 8) minskar under tiden (dvs., blå färg i lesioner på dagar 20 och 25). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: användning av ROIs för kvantifiering av fluorescensintensiteten i lesioner under tidsförloppet. Bilden visar panelen bilder av normaliserade fluorescens som avges av lesioner i en enda mus under tiden (dvs., figur 5) med tillägg av ROIs (avgränsar lesioner och bakgrunden) för kvantifiering av fluorescensintensiteten. ROI 1 och ROI 2 identifiera beloppet för fluorescens som alstras av var och en av två lesioner under kursens gång. BKG identifiera beloppet för fluorescens som avges av den mottagande vävnaden (bakgrunden fluorescens) under tiden. Bakgrunden fluorescens subtraheras från ROIs för kvantifiering ändamål. Tidpunkter efter kirurgi där övervakning utfördes betecknas som ”dag (antal)”. Bilder som förvärvats vid varje tidpunkt är var märkta med en särskild kod (BKG) längst ned på varje en som innehåller information som avser datumet på vilket fluorescens förvärvad (åtta första siffrorna efter BKG detaljdata för år (2014)-månad (10) och -dag (10 till 31)) , en individuell identifieringskod (senast 6 siffror) och specifika profiler av fluorescens utsläpp används för unmixing (UMX2) Rainbow palett färgen till höger ger en visuell skala av fluorescensintensiteten (strålande effektivitet) som avges av lesioner vid varje tidpunkt. Observera hur fluorescens intensitetsvärden i de två lesionerna (ROI1 och ROI2) är högre vid första gången pekar (dag 1 och 5) och sönderfaller under kursens gång att nå de lägsta värdena i slutet tidpunkter (dagar 20 och 25). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: normalisering av fluorescensintensiteten under tidsförloppet. Tabell i den övre delen visar illustrativt exempel av fluorescensintensiteten (strålande effektivitet) värden som avges av två mCherry märkt lesioner (ROI1 och ROI2) implanteras i en mus (R25). Övervakning av fluorescens utfördes på olika dagar efter operation (D5-D25) under tiden. D5 - diagrammet längst ned visar typiska mönster av normaliserade fluorescens som avges av lesioner infekterade med mCherry förfalla under kursens gång. Y-axeln visar värden av fluorescence normaliseras för att uttrycka procentandelen av förfall med hjälp av formel (Signal intensiteten vid varje tidpunkt / Maximal signalintensitet observerats under kursens gång) x 100. Tid pekar (dagar (Dx) efter implantation kirurgi) på vilka fluorescens övervakades anges i x-axeln. Observera inledande ökning av signalering under de första 24 h efter operation, motsvarande stabilisering av lesion, toppen i fluorescensintensiteten runt D1-D5 och dess efterföljande förfall på grund av episomal uttryck för mCherry under tiden Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8: makroskopiska utseende av implanterade endometriotic lesioner. Representativa bilder visar makroskopiska utseende av endometriotic lesioner implanteras i möss i slutet av övervakningsprocessen vid offer vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs häri beskriver genomförandet av en djurmodell av endometrios där arkitekturen att implantera lesioner arkitekturen är bevarad medan samtidigt tillåter realtid bedömning av fluorescens som avges av mCherry märkt livmodercancer vävnad. I detta protokoll beskriver vi användning av en specifik i vivo imaging system och tillhörande programvara att bedöma icke-invasivt fluorescens som avges av märkt lesionen. Varje användare bör anpassa protokollet beroende på specifika bildenhet och relaterad programvara tillgänglig på deras institution. Övervakning utförs på sövda djur genom en isofluran gas anestesi maskin kopplad till ett in vivo imaging system. För att undvika störningar med auto-fluorescens som avges av sår, rekommenderas det att starta övervakning lesioner fluorescens minst tre dagar efter implantation kirurgi.
Heterologa musmodeller av endometrios liknar den som häri visas har beskrivits tidigare bestående i implantation livmodercancer fragment märkt med grönt fluorescerande protein (GFP)18,19. Användningen av mCherry som reporter för taggning av mänsklig vävnad ger dock en fördel över GFP på grund av förbättrade vävnad genomträngningen av tidigare. På grund av dess större emissionsspektrum och högre photostability avger mCherry en ljusare signal som är mer lämplig för visualisering av intraperitoneal fragment.
Adenoviruses är vektorerna av val för infektion på grund av dess liten storlek (dvs märkning) av hela vävnad bitar som de ge godtagbar diffusion genom 3D-strukturer. Även med att andelen infekterade vävnadsceller inte är högre än 30-35%. Således, begränsning av denna modell bygger på ineffektiva märkning av vävnad och dessutom övergående uttrycket uppnås genom adenoviruses. Faktiskt, fluorescens kan inte övervakas bortom 4 – 6 vecka som det bleknar successivt på grund av det episomal övergående uttrycket för Ad-viruset. Effektivitet av märkning och perioden av övervakning kan ökas av störa givaren vävnaden och smittar isolerade enda epitelial/stromaceller med ad-virus tidigare som injiceras in mottagarens möss19,20. Ett sådant tillvägagångssätt, men minskar i omfattning som härmar djurmodell physiologyen av endometrios förutsatt att ektopisk mänskliga lesioner inte består i en oorganiserad ackumulering av enda epitelial/stromaceller utan snarare i välstrukturerade endometriotic vävnad.
I detta protokoll är det mest kritiska steget märkning av vävnaden och mest specifikt bestämning av lämpliga koncentrationen av ad-virus krävs för optimal infektion. 1 x 1010 pfu/mL koncentration påpekade i protokollet är faktiskt mestadels en orientative/konsensus figur baserat på vår erfarenhet. Den optimala koncentrationen kan variera i varje experiment beroende på typ och kvalitet av biopsi eller hur snabbt detta bearbetas. Vi föreslår således testning minst tre olika (två gånger) titrar i varje experiment och att välja en som ger optimal märkning baserat på visualisering under mikroskopet fluorescens.
Våra protokoll/modellen är användbar för att studera de mekanismer som är inblandade i etablering och tidig utveckling av endometriotic lesioner. Trots tidsperioden av övervakning är begränsad, modellen är fortfarande användbar att studera och identifiera effekterna av farmakologiska föreningar kan utöva dramatiska effekter på lesionsstorlek i en kort tidsperiod såsom antiangiogenetisk eller antiestrogenic droger. Utvecklingen av mer effektiva och hållbara metoder för märkning mänsklig vävnad förväntas sprida icke-invasiv övervakning som en konsoliderad teknik att utforska potentialen terapeutiska av ett bredare utbud av droger i preklinisk modell endometrios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft genom Miguel Servet Program [CP13/00077] tillsammans grundade av ERUF (Europeiska regionalutvecklingsfonden) och tilldelas till Dr R. Gómez samt av Carlos III Institute of Health bidrag att Dr R Gómez [PI14/00547 och PI17/02329] och Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
