Summary
Burada, canlı görüntüleme, farelerde aşılı fluorescently etiketli insan endometrium parçacıkları için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi seçim ilaçların etkileri izleme aracılığıyla endometriotic lezyon boyutu ve gerçek zamanlı olarak flüoresan muhabir tarafından yayılan Floresans miktar sağlar
Abstract
Burada, biz hangi endometriozis ilerlemesini noninvaziv implante Ektopik insan endometrium dokusu tarafından yayılan Floresans izleme aracılığıyla gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir bir kapaklı fare modeli uygulanması için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu amaçla, insan endometrium biyopsi donör kadınlar devam eden oosit bağış elde edilir. İnsan endometrium parçaları muhabir floresan protein mCherry için hızlı cDNA için tasarlanmış adenovirüse bakın huzurunda kültürlü. Enfeksiyon daha sonra seçilen alıcı farelerde implantasyon için görselleştirme, doku floresan en uygun bir fiyata sahip adlı. İmplantasyon ameliyat öncesi bir hafta alıcı fareler oophorectomized ve östradiol granül subkutan hayatta kalma ve büyüme lezyonların sürdürebilmek için yerleştirilir. Ameliyat günü fareler küçük (1.5 cm) kesi linea alba. tarafından erişilen imzalat ve Periton boşluğu vardır. Fluorescently etiketli implantlar kaşların, kısa bir süre içinde tutkal batırılmış ve Periton katmana bağlı. İnsizyon sütüre ve hayvanlar birkaç gün kurtarmak için yaptı. Floresan endometriotic implantlar tarafından yayılan genellikle non-invaziv 3 günde 4 hafta içinde vivo bir görüntüleme sistemi ile izlenir. Endometriotic implantları boyutunda varyasyonlar gerçek zamanlı olarak mCherry sinyal ve normalleştirme maksimal floresan yoğunluğu gösteren ilk zaman noktası karşı miktar tarafından tahmin edilebilir.
Endometriozis modellerin geleneksel preklinik kemirgenler non-invaziv lezyon gerçek zamanlı izleme izin vermez ama oldukça bitiş noktası denetlesinler ilaçların etkilerinin izin. Bu iletişim kuralı bir lezyonlar gerçek zamanlı olarak izlemek izin verir ve endometriozis Preklinik modellerin uyuşturucu tedavi potansiyelini keşfetmek için daha yararlı olduğunu. Böylece üretilen modeli ana sınırlandırılması non-invaziv izleme reklam-virüs episomal ifadesi nedeniyle uzun süreler boyunca mümkün değildir.
Introduction
Endometriozis rahim boşluğuna dışında işlevsel endometrium implantasyonu tarafından başlatılan kronik bir jinekolojik hastalıktır. Ektopik lezyonlar büyümek ve iltihabi süreçleri kronik pelvik ağrı ve infertilite1için önde gelen neden. Bu kadar üreme çağındaki kadınların % 10-15 endometriosis2 tarafından etkilendiğini tahmin edilmektedir ve infertil kadınlar3yaklaşık % 40-50 mevcut. Endometriozis için mevcut farmakolojik tedaviler lezyonlar tamamen ortadan kaldırmak için ve yan etkileri4,5özgür değil. Endometriozis insan lezyonlar uygun şekilde taklit ve diğerleri arasında lezyon boyutu bileşikler etkilerini yakından tespit edilebilir şekilde varolan hayvan modellerinin arıtma, daha etkili tedaviler için araştırma gerektirir.
Primat modelleri endometriozis Ektopik lezyonlar implantasyonu histolojik olarak aynı ve benzer sitelerde olduğu gibi insanlar6,7,8taklit etmek için kullanılmıştır; Ancak, etik kaygılar ve yüksek ekonomik maliyetler primatlar sınırı ile deneme onların kullanım9ile ilgili. Sonuç olarak, küçük hayvanlar, özellikle kemirgenler, kullanım endometriozis ın-vivo modellerinin uygulanması için çalışmalar bireyler10,11daha büyük sayılarla verdiğinden tercih devam ediyor. Endometriozis indüklenen bu hayvanlara kemirgen rahim boynuzları ("homolog modelleri")12,13 adet veya Ektopik sitelere (kapaklı modelleri) insan endometrium/endometriotic doku nakli tarafından14 . Aksine insanlar, kemirgenler endometrium doku döken değil ve böylece endometriozis kendiliğinden bu türler içinde geliştirilebilir değil. Bu nedenle, homolog fare modelleri endometriozis gerçeğini Ektopik fare rahim dokusu implante nedeniyle eleştirdi var insan endometriotic lezyonlar15özelliklerini yansıtacak.
Endometriozis uygun fizyolojisi nerede taze insan endometrium parçaları immünyetmezligi hayvana implante edilir endometriozis kapaklı modelleri taklit. Geleneksel Contegra modellerinde bileşikler ilgi tedavi edici etkileri yaygın lezyon boyutu değerlendirme Çap pergeli16kullanımı ile tarafından bitiş noktası değerlendirilir. Bu nedenle, bitiş noktası hayvan modelleri implantasyon dynamics ya da zaman içinde endometriotic lezyon geliştirme eğitim izin vermez, bir açık kısıtlamadır. Çap pergeli kullanımı doğru ölçümler lezyon boyutu izin vermez bir ek kısıtlamadır. Nitekim, aynı aralıkta (yani, milimetre) farelerde, böylece gerçek varyasyonları boyutu algılamak için bu araçları kapasitesine sınırlama implante lezyonlar boyutu olarak Çap pergeli tarafından sağlanan standart hata olduğunu.
Gibi sınırlamalar üstesinden gelmek için burada, implante insan dokusu içinde bir muhabir m-kiraz floresan protein hızlı şekilde tasarlanmıştır endometriozis bir kapaklı fare modeli oluşturmayı açıklar. Bir uygun görüntü sistemi ile floresan sinyal tespiti non-invaziv lezyon durumunu gerçek zamanlı olarak boyutunun aynı anda miktar ile izleme sağlar. Böylece, bizim model derecede o getirmek gerçek zamanlı non-invaziv izleme fırsatı ve olasılığı daha objektif ve varyasyonları doğru tahmin lezyon boyutunda gerçekleştirmek için geleneksel bitiş noktası modelleri karşılaştırıldığında Net avantajlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan dokusu örnekler kullanımı Kurumsal değerlendirme Komitesi ve hastane Universitario La Fe Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Tüm hastalar yazılı Onam sağlanan. Hayvanları içeren çalışma Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi ve tüm yordamlar Ulusal kurumları için bakım ve memeliler kullanım yönergeleri izleyerek gerçekleştirilmiştir Sağlık.
1. rahim dokusu koleksiyonu ve ön işleme
- Kaliteli biyopsi insan endometrium aspiratı ve emme bir aygıta bağlı bir kanül kullanarak elde. Biyopsi 10 mL steril serum fizyolojik ve nazik el ile ajitasyon ile yıkama içeren bir şişe içine dökün.
Not: Kaliteli biyopsi almak hakkındaki yordamlar yukarıda açıklanan17olmuştur. - Biyopsiyi kalan herhangi bir kan ya da mukus yıkayın. Doku doku temiz görülmektedir kadar gerektiği gibi çok sayıda diş taze serum fizyolojik içeren Şişeler için dökerek tekrarlayın.
- Transfer biyopsi parçaları 10 mL içeren bir çözüm içine sağlıklı bir görünüm ile Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) orta % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve % 1 antibiyotik antimycotic çözüm ile tamamlayın.
- İçeriği bir 10 cm Petri kabına dökün ve neşter çifti ile 5-10 mm3 parçaya doku kesmek için devam edin.
2. adenoviral Transfection, endometrium parçacıkları
Not: Sürecinde istihdam edilebilir dair bütün malzemeler mahallede önceden sunulması. Bu süreç içinde kullanılan ve bir şişe çamaşır suyu ile yerleştirmek için gitmiyor her şeyi al. Adenoviral vektör temas geliyor tüm malzeme biohazard kapsayıcısında atılmadan önce çamaşır suyu ile dezenfekte gerekir.
- Sonra doğranmış biyopsi, yeni Petri kabına alın. Birden fazla 30 – 50 µL DMEM damla bütün yemek boyunca yayılan pipette. Onlar kişiye gelmiyor bu yüzden damla arasında yeterli boşluk bırakın.
- Şırıngaya bağlı bir iğne ile destekli, tek bir parça her orta damla içinde yerleştirin.
Not: Her damla tek bir endometrium içermelidir. - Ad-mCherry çalışan çözüm 1:20 mCherry adenoviral hisse senedi çözüm [1 x 1010 pfu/mL] sulandrarak DMEM hazırlamak) orta (DMEM + % 10 filtre FBS) antibiyotik olmadan.
- 100-200 μL iyi parçaları Petri kabına damla (Adım 2.2) kullanılabilir gibi çok sayıda wells doldurma 96-şey tabakta başına reklam-mCherry çözüm dağıtmak. Buna ek olarak, en az 3 Kuyu adenovirus ücretsiz DMEM orta ile bir negatif kontrol doldurun.
- Şırıngaya bağlı bir iğne ile destekli, her bir Petri kabına (Adım 2.2) içinde parçaları her reklam-mCherry solüsyon 96-şey plaka içeren Wells aktarın.
- 96 iyi plaka 16 h için % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka içine reklam-mCherry çözüm ile endometrium parçaları içeren bir yer.
- Kalan adenovirüse bakın dokular ile tam DMEM orta dolu yeni bir 96-şey plaka içine aktarma tarafından orta dışarı yıkama (antibiyotik-antimycotics ile adenovirus ücretsiz) ve % 5 CO2 için 24-48 h 37 ° C için kuluçkaya.
Not: Bütün iyi plakalar ve reklam-virüs ile temas geldi biohazard konteyner içine atarak önce ipuçları çamaşır suyu ile kapak unutmayın. - Kuluçka makinesi tabaktan dışarı almak ve 568 adlı bir floresan mikroskop altında yer en uygun etiketleme için test etmek için nm (kırmızı kanalı).
- En parlak parçaları seçin ve yeni bir 96-şey plaka ile taze tam DMEM orta içine koyun (antibiyotik-antimycotics ile adenovirus ücretsiz).
- İyi bir plastik parafin film ile plaka mühür ve kendisine endometrium parçaları implantasyonu içine alıcı hayvanlar için özel patojen ücretsiz hayvan alana taşıma.
3. nesil endometriozis fare modeli
Not: 6 – 8 hafta kullanın-eski korele çıplak (ya da benzer immün suşları) alıcı hayvanlar gibi patojen-ücretsiz spesifik koşullar içerisinde yer alan kadın fareler. Hormonal döngüsü bağımlı varyasyonları ve aynı anda yakıt lezyon büyüme estradiol ile önlemek için Ovariektomili ve ile yerleştirilen 60 günlük yayın kapsüller 17 βeta-Estradiol (17β-E2) 18 mg içeren hayvanlar vardır. Ooforektomi ve Pelet yerleşim var endometrium parçaları alıcı hayvanlara aşılama öncesinde en az bir hafta gerçekleştirilecek.
-
Ooforektomi
Not: Bir başlıklı cerrahi steril malzeme hazırlamak. Anestezi ekipman ve aynı odada bir ameliyat sonrası kurtarma bölge hazır hazır olun.- Morfin türevi bir doz 5 mg/kg / fare, subkutan enjeksiyon gerçekleştirin. Ağrı kesici ilaç etkileri tecelli olabilir bu yüzden sonra enjeksiyon için 30 dk bekletin fareler izin.
- İnhalasyon anestezi ekipman ve izin oksijen ve isoflurane (% 2 mg/kg) akışı için bir kaç dk mühürlü anestezi odasına bağlayın.
- Hayvan isoflurane anestezi odasına tanıtmak. 3-5 dakika için bekleyin ve hayvanlar tam olarak onun pençeleri birini basarak anestezi kontrol edin. Hayvan ameliyat alanına aktarmak ve anestezi sürekli solunum solunum yolları kapsayan isoflurane gaz akışının bir maskeyle yerleştirerek korumak.
- Alan chlorohexidine ile dezenfekte sonra kalça bir enine 0.5 cm kostal kesi-yaklaşık yükseklikte keskin makas ile gerçekleştirin.
- Cilt karın boşluğu erişin, yumurtalık çevreleyen beyaz yağ yastığı tanımlamak ve yumurtalık diseksiyon Forseps ile geri çekmek için kas ayırmak.
- Bir düğüm ovidukt absorbe dikiş ile çevresinde ve uygun hemostaz yumurtalık bilincin önce emin olmak için sıkın.
- 6-0 absorbe dikiş katmanı kas ve cilt 6-0 absorbe olmayan sütür ile kapatın. Antiseptik solüsyonu ile tekrar alanı temizleyin.
- Contra yanal yumurtalık kaldırmak için yordamı yineleyin.
-
Estradiol cips implant
Not: Hayvan ooforektomi ameliyatta peletler bu noktada yerleştirmek için anestezi ilgilen.- Hemen sonra ooforektomi yordamı tamamlandıktan, deri boyun çevreleyen antiseptik solüsyonla temiz ve keskin makas ense ile enine subkutan küçük (0.5 cm) kesi yapmak.
- Makas granül yerleştirerek izin vermek için yeterince büyük bir cep yapma kas, deriden incelemek için kullanın.
- 17β-E2 18 mg içeren Pelet takın ve cilt ile 6-0 absorbe olmayan dikiş dikerim. Antiseptik solüsyonu ile tekrar alanı temizleyin.
- Hayvan Kurtarma bölgesinde yer ve iyileşme süresi kolaylaştırmak için uzun süreli analjezi en iyi bir doz yönetmek.
-
Endometrium implant ameliyatı
Not: En azından bir süre yedi gün karantina hayvanların tam kurtarma sonra ooforektomi endometrium parçası implantasyonu ameliyatı başlamadan önce izin vermek için izin. Dokusunun etiketleme ile en iyi eşitleme için 2 – 3 gün böylece uzun vadeli explants kültürünün önlemek için implantasyon ameliyattan önce biyopsi toplamak.- Belirli patojen serbest bölge cerrahi odaya önceden hazır olun. Ayrıca tüm gerekli cerrahi malzeme, anestezi ekipman ve ameliyat sonrası kurtarma bölgesi ile örtünün hazırlayın.
- Hayvanlar odaya getireceksin, her fare, 5 (mg/kg) bir doz morfin türevi bir Subkutan Enjeksiyon gerçekleştirin. Uyuşturucu analjezik etkileri tecelli olabilir bu yüzden sonra enjeksiyon için 30 dk bekletin fareler izin.
- İnhalasyon anestezi ekipman ve izin oksijen ve isoflurane (% 2 mg/kg) akışı için bir kaç dk mühürlü anestezi odasına bağlayın.
- Ameliyat başlamadan önce fluorescently içeren plaka bu PIN'i parçaları (Kimden adım 2.10) hood, etiketli ve parçaları bir petri daha kolay kullanım için içine dökün taşıyın.
- Hayvan isoflurane anestezi odasına tanıtmak. 3-5 dakika için bekleyin ve hayvanlar tam olarak onun pençeleri birini basarak anestezi kontrol edin. Hayvan ameliyat alanına aktarmak ve anestezi sürekli solunum solunum yolları kapsayan isoflurane gaz akışının bir maskeyle yerleştirerek korumak.
- Yer imzalat hayvan yüzleri yukarıya. Ventral bölgeyi dezenfekte. Boyuna 1,5 cm kesi karnından keskin makas ile gerçekleştirmek ve cilt kas ayrı. Sonra boyuna 1,5 cm kesi Periton boşluğuna erişmek için kas içinde gerçekleştirin.
- Karın kaslı duvar sol kenarına Mini Forseps ile tutun ve dış Periton iç yüzünü ortaya çıkarmak çalışırken katlayın.
- Endometrium implant mini cımbız ile kısa bir süre içinde bir n-butil-ester siyanoakrilat yapıştırıcı emmek alıp karın zarını için nerede o bağlı olsun yerleştirin. Bir kaç saniye için kurumasını bekleyin. 3.3.6 ve 3.3.7 bir implant karın zarını kontralateral tarafına yerleştirmek için adımları yineleyin.
- Bir absorbe 6-0 sütür ile kas katmanı ve 6-0 sütür ile bir olmayan-absorbe cilt kapatın. Antiseptik solüsyonu ile tekrar alanı temizleyin.
- Hayvan Kurtarma bölgesinde yer ve uzun ömürlü analjezi en iyi bir doz yönetmek.
4. içinde görüntüleme sistemi içinde bir Vivo floresan görüntüleme vivo
- İçinde vivo görüntüleme sistemi aygıtı açın, program başlatmak ve CCD fotoğraf makinesi birkaç dakika soğumasını sağlar.
- İnhalasyon anestezi ekipman hazırlayın. %2 min anestezik odası doldurmak için birkaç isoflurane akışı açın. Sonrası anestezi kurtarma bölge hazırlayın.
- Program başladı ve CCD kamera soğuduktan sonra Sihirbazı görüntüleme aracı tıklatın: bir öğretici ardışık windows görüntülenen bir dizi ile başlar, her biri birkaç ile ilgi bir parametreye karşılık gelen seçilecek kullanılabilir seçenekleri ilgili kutuya tıklayarak. Her pencerede uygun kutuları seçerek öğretici ile ileriye taşımak ve aşağıdaki sıra ile sonraki parametrelerinin taşımak için Tamam düğmesini tıklatın.
- Floresans parametresi için Epiluminescence kutusunu seçin, filtre çiftleri parametresi için mCherry kutusunu seçin. Fotoğraf modu ve Onaylamak odak kutuları işaretleyin ve pozlama parametresi için otomatik kutusunu seçin.
- Araç kurulmuş olan bir kez, bir hayvan anestezi odası içinde hareket. Tam anestezi zaman içinde sistem kafes görüntüleme in vivo hayvan aktarmak ve anestezi makineye bağlı bir tübül onun kafasında ile yan yerleştirin. Kapağı kapatın ve izlemek için Al düğmesini tıklatın.
- (Toplam beş fotoğraf, seçilen filtreleri her çift için bir görüntü) görünen görüntüleri ve veri Kaydet düğmesini tıklatarak kaydedebilirsiniz. Fare sonrası anestezi kurtarma alanına taşıyın. Kalan hayvanlar ile işlemi tekrarlayın.
- İki izlemeyi yineleyin veya üç kez bir hafta takip sinyali uygun zaman boyunca.
- Zamanlı kurs sonunda hayvan CO2 boğulma tarafından feda etmeye devam edin.
5. Vivo Floresans görüntülerin miktar
-
Görüntü unmixing aracılığıyla gerçek Floresans ayrılığı:
- Vivo analiz görüntüleme yazılım programı birleştiğindeaçın.
- Analiz başlamak için "Sequenceinfo" dosyasını seçin. İki pencere-ecek gözükmek: "Sıra görünüm" ve "Araç paleti". Araç paleti seçin ve görüntülenen menü sonra aşağıdaki seçenekleri işaretleyin.
- Düzeltmeler seçin ve istenmeyen floresan sinyallerini Işıksaçan görüntü verileri kaldırmak için Uyarlamalı FL arka plan çıkarma kutusunu tıklatın. Eşik büyük ilgi seçin ve ayarla' yı tıklatın.
- Tayf Unmixingtıklatın, dalga boyu ilgi, unmixing (Kütüphane için rehberli, otomatik veya el ile) seçilmiş olan yönteme bağlıdır seçin ve sonra Unmix Başlat ' ı tıklatın.
- MCherry sinyal için karşılık gelen Unmixed resmi seçin ve çift tıklatın. Yeni bir pencere faiz sinyal son görüntüleri ile gösterilir.
- 5.1.3 arasındaki adımları yineleyin.
- İsteğe bağlı: bir temsili resim (JPEG) unmix sonucu gerekiyorsa, araç paleti istenen ayarları seçmek | Görüntü ayarlama (renk tablosu, binning, kontrast, vs.) ve şu anki görüntüsü gibi ters bir resim olarak vermek için İhracat grafik unmix penceresinde tıklatın.
- Karışmamış dosyayı kaydedin: dosyası | Farklı Kaydet | Klasör seçin ve Ok.
- Bütün hayvanlar ile izleme gün geri kalanı ile işlemi yineleyin.
-
ROIs kurmak ve miktar sinyal
- Gözat ' ı tıklatın ve karışmamış dosya seçin (bkz. Adım 5.1.8) analiz edilebilir ilgi. Yeni pencere-ecek gözükmek.
- Tıklayın Listesine ekle her hayvan farklı zaman noktalarda tüm karışmamış dosyaları içerir ve Yükleme olarak bir grupüzerinde'yi tıklatın. Tüm görüntüleri tek bir sıra görünmesi gerekir.
- Araç paleti penceresine git: Ben aynı ölçekte tüm görüntüleri elde etmek içinkaynaklandığıdır ölçek kutusunu tıklatın.
- Çift sıra bir görüntüyü tıklatın ve bir yatırım Getirisi aşağıdaki işlem sırasını kullanarak faiz bölge üzerinde oluşturun. ROI araçlar ' a gidin ve Countour ve Otomatik 1 seçeneğini seçin, görünen daire şekli tıklatın, floresan sinyal üstünde belgili tanımlık merkez yerleştirin ve sonra görüntülenen pencerede Oluştur ' u tıklatın.
Not: Bu otomatik olarak piksel floresan arka plan değerleri (Yani, lezyon) yukarıda bir yoğunluk ile vurgular ve kimin alanı Seviyelendirilmiş piksel kucaklayan bir şekil oluşturur. - Oluşturulan yatırım Getirisi şekli kopyalayıp bir arka plan bölge olduğu yerde sinyal yok.
- Tıklatın ölçü ROIs üzerinde | Floresans yoğunluk değerleri görüntülemek için Tümünü Seç . Fare ile veri değerleri seçin, sağ düğmesini tıklatın, Kopyala seçeneğini tıklatın ve bir elektronik tabloya yapıştırmak için devam edin.
6. veri (floresan sinyal) normalleştirme
- Hangi sinyal şiddeti maksimal başlangıç zaman noktasını seçin. Formül kullanarak, her zaman bir noktada sinyal normale devam:
Sinyal şiddeti, her zaman bir noktada / maksimal sinyal şiddeti gözlenen zaman boyunca) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, böylece non-invaziv izin insan endometrium fluorescently etiketli adet immün fareler yerleştirerek tarafından lezyonlar mimarisini korunduğu endometriozis kapaklı bir model oluşturmak için süreci tanımlamak lezyon ilerlemesini izleme. Endometrium parçaları etiketleme tarafından Enfeksiyon Mod hızlı mCherry, Floresans yakın kızılötesi bölgesi yayan bir protein için tasarlanmış adenovirus ile elde edilir. Şekil 1' de, Ad-mCherry ile enfekte insan endometrium parçaları görüntülerini floresan mikroskop altında gözlenen temsilcisi gösteriyoruz. Floresans bulaşmış ve sigara enfekte dokuları (autofluorescence) arasındaki farklılıklar görülebilir böylece görsel amacıyla, etiketli ve etiketli olmayan parçaları dahil edilir. Floresan görüntüleri, ek olarak mCherry için referans dalga boyu izleme sırasında dokuların karakteristik floresan emisyon profili tanımlamak için uyarma/emisyon dalga boylarında filtreler (Şekil 2) farklı çiftleri ile alınır. Bu eyleminin amacını "ayıramayacağız gerçek Floresans lezyonlar arka plan ve ana bilgisayar doku tarafından yayılan autofluorescence tarafından yayılan ve ameliyat sırasında sırasıyla kökenli yara" dir. Unmix sürecinin açıklayıcı bir örnek şekil 3' te gösterilmiştir. Varyasyon lezyon boyutunda tahminleri miktarının ve floresan lezyonlar zaman boyunca yayılan sinyal normalleştirme tarafından gerçekleştirilir. Bu amaçla, ham Floresans hayvanlar tarafından her zaman olurken yayılan içeren izleme görüntüleri ilk birlikte Normalleştirilmemiş (şekil 4) tek bir dosyada götürülür. Daha sonra Floresans karışmamış, normalleştirilmiş ve bir yanlış renk görüntüsü (şekil 5) olarak temsil edilmektedir. İçin belirli lezyon ve arka planda otomatik olarak program tarafından tanınan ve sayısal sinyal karşılık gelen son olarak, ROIs (şekil 6). Arka plan düşülen lezyon ROI sinyal ve sonuçları yoğunluk her zaman noktası hangi yoğunluk maksimal zaman noktası karşı normalleştirilmiş sinyal ROI (Şekil 7). İzleme işleminin sonunda, birkaç hafta sonra ameliyat fareler kurban ve uygun implant elde edilebilir fare Periton (şekil 8) bağlı.
Şekil 1: Ad-mCherry enfeksiyon sonra Floresans mikroskobu ile endometrium parçalarının görselleştirme. Ad-mCherry ile 37 ° C ve % 5 CO2 ' de 24 saat inkübe olumlu bir örnek olarak(a)insan endometrium parçası. (B) insan endometrium parçası 37 ° C ve % 5 CO2 Ad-mCherry olmadan, bir negatif kontrol örnek olarak inkübe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ham görüntü Floresans tarafından yayılan etiketli fareler implante parçaları. Resmi bir belirli bir zaman noktasında aynı hayvan tarafından yayılan ham Floresans sinyalinin temsilcisi görüntüleme gösterir. Görüntüleri ekran içinde vivo bir görüntü sistem aygıtı için bir izleme oturumu sırasında birleştiğinde yazılımı kullanılarak elde edilen karşılık gelir. Her panel (1 – 5 numaralı sol köşede) fareler içeren görüntüleri alma için farklı belirli uyarma/emisyon çift filtre kullanarak gözlenen Floresans karşılık gelir. (Araç paleti) sağda panelini göster floresan parametreleri görüntüler edinimi için seçilen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: arka plan vs belirli Floresans lezyonlar tarafından yayılan, Unmixing. Unmixing sürecinin temsilcisi görüntüleri içinde vivo görüntüleme sistemi kullanarak lezyon üzerinden gerçek Floresans incelemek için gerçekleştirilen resmi gösterir yazılım birleştiğinde. Sol panelde grafik yara izi (yeşil hat, UMX1), lezyonlar (kırmızı çizgi, UMX2) ve ana bilgisayar doku (mavi çizgi, UMX3 paneli) tarafından Floresans emisyon normalleştirilmiş belirli profilleri göstermek. Farklı emisyon dalga boylarında (x ekseni) yoğunlukta Floresan ışık saçan verimliliği (y ekseni) birimlerinde temsil edilir. Sadece nasıl her belirli yapısı (yani, yara, lezyonlar ve ana bilgisayar doku etiketli) belirlenmesi ve onları yavru özellikle formu sağlayan bir farklı floresan profil birbirlerine yayar unutmayın. Sağ panosunda, yara izi (UMX1), belirli emisyon profillere başlatmasını doğan Floresans lezyonlar (UMX2) ve ana bilgisayar doku (UMX3) fareler fotoğraf görüntülerini Süperpoze gösterilir. Bileşik görüntü (kompozit) de lezyon üzerinden yara izi veya ana bilgisayar doku tarafından yayılan tarafından yayılan Floresans ayrılmasını belirtmek görsel amacıyla bulunmaktadır. Orta paneli gösterir görüntü yazılımı ile unmixing içinde vivo görüntü aygıtı için birleştiğinde için seçilen parametreler Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ders lezyonlar tarafından yayılan ham Floresans izleme zamanı. Paneli ham Floresans etiketli insan lezyonlar (parlak sarı lekeler) ile zaman boyunca implante tek bir fare tarafından yayılan temsilcisi görüntüleri gösterir. Zaman Puan hangi izleme gerçekleştirilen ameliyat sonrası "(sayı) günü" olarak belirtilir. İzleme için kullanılan emisyon reklam uyarma çifti filtreler her Masası/görüntü gösterilir. Her panel belirli bir kodla (BKG) Floresans elde tarihi ile ilgili bilgi içeren üst kısmında tanımlanır.
Şekil 5: ders izleme zaman normalize lezyonlar tarafından yayılan Floresans. Karışmamış için karşılık gelen temsilcisi görüntüleri normalleştirilmiş floresan sinyal insan lezyonlar (gökkuşağı renkli lekeli) tek bir fare süre içinde superposed tarafından yayılan (gün ameliyat sonrası) tabii ki. Zaman Puan hangi izleme gerçekleştirilen ameliyat sonrası "(sayı) günü" olarak belirtilir. Her panel Floresans elde tarihi ile ilgili bilgi içeren alt kısmındaki özel bir kodu (BKG) tarafından tanımlanır. Gökkuşağı palet rengi sağ tarafında, her zaman bir noktada lezyonlar tarafından yayılan floresan yoğunluğu (parlak verimliliği) tanımlar. Not ne kadar güçlü floresan yoğunluğu ilk kez puan (yani, kırmızı renkli lezyonlar 1,5 ve 8 gün ortasına) düşüşler sırasında saat boyunca (yani, mavi renk lezyonlarının günlerde 20 ve 25). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: floresan yoğunluğu lezyonlar miktar zaman ders sırasında ROIs kullanımına. Şekil paneli tek bir fare lezyonlarının tarafından saat boyunca yayılan normalleştirilmiş Floresans görüntülerin gösterir (yani, şekil 5) floresan yoğunluğu miktar için (lezyonlar ve arka plan operasyona) ROIs eklenmesi ile. Yatırım Getirisi 1 ve yatırım Getirisi 2 saat boyunca her iki lezyonlar tarafından yayılan Floresans miktarı tanımlayın. BKG ana bilgisayar doku (arka plan floresan) tarafından zaman boyunca yayılan Floresans miktarını belirlemek. Arka plan Floresans ROIs miktar amaçlar için çıkarılır. Zaman Puan hangi izleme gerçekleştirilen ameliyat sonrası "(sayı) günü" olarak belirtilir. Her zaman noktada alınan görüntüleri ile her bir içeren bilgi hangi Floresans tarihte ilgili altındaki belirli bir kodu (BKG) etiketli (BKG ayrıntı verileri için aşağıdaki yıl (2014)-ay (10) ve - gün (10-31) alınan ilk sekiz basamaklý) idi , bir bireysel kimlik kodu (son 6 basamaklı) ve unmixing (UMX2) gökkuşağı palet rengi sağ tarafında kullanılan Floresans emisyon belirli profilleri sağlar lezyonlar tarafından yayılan görsel ölçeğini floresan yoğunluğu (parlak verimliliği) her zaman noktası. Not floresan yoğunluğu iki lezyonlar (ROI1 ve ROI2), daha yüksek değerler nasıl ilk kez puan (gün 1 ve 5) ve bozunmaları olan en alt değerler vasıl belgili tanımlık son zaman puan ulaşmak için zaman boyunca (20 ve 25 gün). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: floresan yoğunluğu normalleştirme sırasında zaman ders. Tablo üst kısmında, bir fare (R25) implante lezyonlar (ROI1 ve ROI2) olarak etiketlenmiş iki mCherry tarafından yayılan açıklayıcı örnek floresan yoğunluğu (parlak verimliliği) değerleri gösterir. Floresans izleme farklı gün cerrahi (D5-D25) sonra saat ders sırasında gerçekleştirildi. D5 - altında grafik normalleştirilmiş floresan mCherry saat boyunca bozulması ile enfekte lezyonlar tarafından yayılan tipik desen gösterir. Y ekseni Floresans çürümesi yüzdesini formül kullanılarak ifade etmek için normalleştirilmiş değerini gösterir (sinyal şiddeti, her zaman bir noktada / maksimal sinyal şiddeti gözlenen zaman boyunca) x 100. Zaman puan (cerrahi Reproduction sonra gün (Dx)) hangi Floresans izlenen x ekseni gösterilir. Ameliyat sonrası ilk 24 saat sırasında sinyal ilk artış Not, lezyon, floresan yoğunluğu D1-D5 ve onun sonraki çürümesi nedeniyle mCherry episomal ifade saat boyunca çevresinde içinde en yüksek istikrar karşılık gelen tıklayınız Burada bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 8: implant endometriotic lezyonlar makroskopik görünümünü. Temsilcisi endometriotic lezyonlar kurban üzerine izleme işlemi sonunda farelerde implante makroskopik görünümünü gösteren görüntüleri Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada ayrıntılı iletişim kuralı aynı anda gerçek zamanlı değerlendirmesini Floresans izin yayılan iken lezyonlar mimari Reproduction Mimarlık mCherry tarafından korunur endometriozis bir hayvan modeli uygulamasını açıklar endometrium dokusu etiketli. Bu protokol için belirli içinde vivo görüntüleme sistemi ve non-invaziv etiketli lezyon tarafından yayılan Floresans değerlendirmek için ilgili yazılım kullanımını açıklar. Her kullanıcı bağlı olarak belirli görüntü aygıtı ve ilgili yazılım kendi kurum olarak mevcut Protokolü adapte olmalıdır. İzleme imzalat hayvanlarda içinde vivo bir görüntüleme sistemi birleştiğinde bir isoflurane gaz anestezi makine aracılığıyla gerçekleştirilir. Otomatik Floresans yaralar tarafından yayılan girişimi engellemek için bu lezyonlar Floresans implantasyon ameliyattan sonra en az üç gün izlemeye başlamak için tavsiye edilir.
Endometriozis burada gösterilen benzer kapaklı fare modelleri daha önce yeşil flüoresan protein (GFP)18,19ile etiketli implantasyon endometrium parçaları içinde oluşan tarif edilmistir. İnsan dokusu etiketleme için mCherry kullanım muhabirlik sağlar ancak eski gelişmiş doku penetrasyonu nedeniyle GFP üzerinde bir avantaj. Onun daha büyük emisyon spektrum ve daha yüksek photostability nedeniyle mCherry mayi parçaları görselleştirme için daha uygun olan daha parlak bir sinyal yayıyor.
Kendi küçük boyutları nedeniyle enfeksiyon için tercih adenovirüse bakın vektörleridir (yani, etiketleme) bütün doku parçaları bu 3D yapılar aracılığıyla kabul edilebilir Difüzyon sağlamak. Düz ile enfekte doku hücrelerinin yüzde 30-%35 yüksek değil. Böylece, bu model sınırlandırılması doku ve ayrıca adenovirüse bakın tarafından elde geçici ifade verimsiz etiketleme üzerinde dayanır. Nitekim, aşamalı olarak Ad-virüs episomal geçici ifade nedeniyle ererkendüşünceleriniz Floresans 4-6 hafta izlenen edemiyor. Maddelerinin etiketlenmesi verimliliği ve izleme dönemi donör doku engellemeden ve izole tek epitel/stromal hücreler ile alıcı fareler19,20enjekte önceki reklam-virüs bulaşmasını artış. Böyle bir yaklaşım, ancak, koşuluyla tek epitel/stromal hücreler düzensiz bir birikimi ama oldukça iyi bir şekilde yapılandırılmış Ektopik insan lezyonlar oluşur değil hangi hayvan modeli endometriozis fizyolojisi taklit eden ölçüde azaltır endometriotic doku.
Bu protokol için doku çoğu özellikle reklam-virüs için en uygun enfeksiyon gerekli uygun konsantrasyonu tayini etiketleme ve en önemli adımdır. Gerçekten de, 1 x 1010 pfu/mL konsantrasyonu iletişim kuralında işaret bizim deneyime dayalı çoğunlukla bir orientative/fikir birliği rakamdır. En iyi toplama her denemede kalite biyopsi ve/veya ne kadar hızlı bu işlenir ve türünü bağlı olarak farklılık gösterebilir. Görselleştirme floresan mikroskop altında en uygun etiketleme sağlayan bir seçme dayalı ve böylece her denemede en az üç farklı (iki kat) titreleri test öneririz.
Bizim iletişim kuralı/modeli kuruluş ve endometriotic lezyonların erken gelişme mekanizmaları incelemek yararlıdır. Rağmen izleme süre kısıtlı, model üzerinde çalışmaya ve farmakolojik bileşikler anjiogenik veya antiöstrojenik uyuşturucu gibi kısa bir sürede lezyon boyutu üzerinde dramatik efektler uygulamak için güçlü etkileri hala yararlıdır. İnsan dokusu etiketleme, daha verimli ve dayanıklı yöntem geliştirme preklinik modeli endometriozis uyuşturucu, daha geniş bir aralığı terapötik potansiyeli keşfetmek için birleştirilmiş bir teknik olarak non-invaziv izleme yaymak için bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser İspanyolca Ekonomi ve rekabet Miguel Servet FEDER (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) tarafından cofounded programı [CP13/00077] aracılığıyla Bakanlığı tarafından desteklenen ve Dr R. Gómez yanı sıra ödül Carlos III Sağlık Enstitüsü hibe tarafından ödüllendirildi Dr R Gómez [PI14/00547 ve PI17/02329] ve Prof A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
