Summary
针对入侵检测的性能, 提出了一种基于 HMCA 的成像板。该板块有助于形成三维 (3D) 肿瘤旋转椭球体和测量癌细胞侵入细胞外基质 (ECM)。通过半自动分析实现了入侵检测的定量化。
Abstract
癌症转移是已知的导致90% 的癌症致死率。转移是一个多级过程, 启动与渗透/侵入肿瘤细胞到邻近组织。因此, 入侵是转移的关键一步, 使入侵过程的研究和开发的抗转移药物, 具有非常重要的意义。为了满足这一需求, 需要开发 3D的体外模型, 以模拟实体肿瘤及其微环境的结构, 一方面最接近体内状态, 但同时具有可重现性、鲁棒性和适用于高产量和高含量测量。目前, 大多数入侵检测都依赖于成熟的微流控技术, 它们足够用于研究, 但不能用于高通量药物筛选。在每个井中使用具有独立单独旋转椭球体的板型设备的其他检测是材料消耗, 每个条件的样品尺寸都很低。目前的协议的目标是提供一个简单的和可重现的仿生3D 细胞系统, 以分析大种群肿瘤旋转椭球体的侵袭能力。我们开发了一种基于 HMCA 成像板的3D 入侵检测模型, 用于肿瘤侵袭和抗转移药物发现的研究。该器件可生产多种均匀的旋转椭球体 (每个条件下的高样本大小), 同时在单元素分辨率下连续、同时观察和测量旋转椭球体的介质抗转移药物的高通量筛选。这个平台是在这里提供的 HeLa 和 MCF7 旋转椭球体的例证单细胞和集体入侵的生产。比较了 ECM 成分透明质酸 (HA) 对旋转椭球体周围胶原的侵袭能力的影响。最后, 我们引入漆黄素 (入侵抑制剂) 对 HeLa 旋转椭球体和一氧化氮 (NO) (入侵激活剂) MCF7 旋转椭球体。通过内部软件对结果进行分析, 实现半自动、简单、快速的分析, 便于多参数检测。
Introduction
癌症死亡主要归因于转移细胞传播到遥远的地方。许多癌症治疗的努力重点是瞄准或预防转移性菌落的形成和系统性转移性疾病1的进展。癌细胞迁移是肿瘤转移过程中的重要一步, 因此, 对肿瘤侵袭性叶栅的研究是非常重要的, 也是寻找抗转移治疗的前提条件。
动物模型作为研究转移性疾病的工具被发现是非常昂贵的, 并不总是代表在人类的肿瘤。此外, 细胞外微环境的拓扑结构、力学和成分对癌细胞的行为有强烈的影响2。由于体内模型本身缺乏分离和控制导致癌症侵袭和转移的特定参数的能力, 因此需要对体外模型进行可控仿生。
为了转移到遥远的器官, 癌细胞必须表现出迁徙和侵入性表型特征, 这些性状可以被治疗。然而, 由于大多数体外肿瘤模型不模仿实体肿瘤3的实际特征, 因此检测生理相关表型非常具有挑战性。此外, 在肿瘤内存在的表型异质性, 决定了在单元素分辨率下分析肿瘤迁移的必要性, 以发现表现性定向疗法, 例如, 通过靶向转移起始细胞异质肿瘤中的人口4。
细胞运动和集体迁移的研究主要在同质平面表面上皮细胞的单层培养中进行。这些用于癌症细胞迁移的常规细胞模型是基于通过细胞膜和 ECM 组件5侵入的单个细胞的种群分析, 但在这种系统中, 单个细胞之间的内在差异不能研究。通过支架或无支架微结构生成3D 旋转椭球体被认为是研究肿瘤细胞生长和肿瘤侵袭6、7、8的一种优越手段。但是, 大多数3D 系统不适合高吞吐量格式, 并且在每个微井9中生成独立的单个旋转椭球体时, 通常无法实现椭球体之间的交互。最近涉及癌症迁移的研究基于微流控设备3,10,11,12, 然而, 这些复杂的微流控工具很难生产, 不能用于抗侵入性药物的高通量筛选 (HTS)。
两种主要表型, 集体和个体细胞迁移, 在肿瘤细胞中发挥作用, 克服 ECM 屏障和入侵邻近组织, 已证明13,14, 每个显示不同的形态学特征、生化、分子和遗传机制。此外, 在每个表型中观察到两种形式的迁移肿瘤细胞, 成纤维细胞样和变形虫。由于入侵表型和迁移模式, 主要是由形态学属性定义的, 因此需要对细胞模型进行基于成像的检测和检查所有形式的肿瘤侵袭和迁移细胞。
目前的方法的总体目标是提供一个简单和可重现的仿生 3D体外细胞系统, 以分析肿瘤旋转椭球体大种群的侵袭能力。在这里, 我们介绍了基于 HMCA 的6孔成像板用于肿瘤侵袭和抗转移治疗的研究。该技术能够在水凝胶微室 (MC) 结构中形成大量均匀的3D 肿瘤旋转椭球体 (450)。将各种 ECM 组件添加到椭球体阵列中, 以使细胞侵入周围环境。通过对同一个体旋转椭球体/入侵细胞的短期和长期观察, 对入侵过程进行持续监测, 并在任何时候促进形态学表征、荧光染色和特定旋转椭球体的检索。由于许多旋转椭球体共享空间和媒介, 通过个体旋转椭球体之间的可溶性分子相互作用及其对彼此的影响是可能的。使用内部 MATLAB 代码进行半自动图像分析, 从而能够更快、更高效地收集大量数据。该平台能够以高效的方式对众多旋转椭球体/入侵细胞进行准确、同时的测量, 从而实现对抗入侵药物的中等吞吐量筛选。
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Protocol
1. HMCA 板压花
注: 本协议中使用的硅油 (PDMS) 图章和 HMCA 成像板的设计和制造的完整过程在我们前面的文章15,16中详细介绍。PDMS 图章 (负形状) 用于浮雕 HMCA (正形), 由大约450个 MCs (图 1A) 组成。如图 1B所示, 每个 MCs 都有一个被截断的倒置方形金字塔的形状 (高度: 190 µm, 小底座面积:90 µm x 90 µm, 大底座面积: 370 µm x 370 µm)。HMCA 板用于3D 肿瘤旋转椭球体的制备和培养, 并随后用于入侵检测。或者, 商业印章可用于 HMCA 生产。
- 准备6% 低熔点琼脂糖 (罩) 的溶液。将这一粉末和无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (0.6 g 每10毫升 pbs) 放入带磁力搅拌器的玻璃瓶中。将瓶子放在加热板上, 搅拌溶液, 加热至80摄氏度, 直到达到统一的解决方案。将解决方案保持在70摄氏度, 直到使用。
- 将 PDMS 图章预加热到烤箱中的70摄氏度。保持温暖, 直到使用。或者, 使用商业印章并按照说明操作。
- 将商用6孔玻璃底板放置在预热至75摄氏度的干式浴缸中。等待几分钟, 直到盘子完全暖和。
- 倒入一滴 (400 µL) 预加热的罩在每一个孔的玻璃底部的板块。轻轻地将预加热的 PDMS 图章放在琼脂糖滴上。在室温 (RT) 下孵育, 用于预凝胶和预冷却5–10分钟。在4摄氏度孵育20分钟, 实现全琼脂糖凝胶。然后, 轻轻剥离 PDMS, 留下琼脂糖凝胶图案。
注意: 此步骤在所有井中同时完成。 - 将浮雕板放在配备紫外线 (UV) 灯的光固化系统中, 孵育3分钟。
注意: 现在 HMCA 板是 UV 灭菌。 - 用无菌 PBS 填充宏井, 确保它们保持湿润, 然后盖上盘子, 用石蜡膜包裹, 并将其储存在4摄氏度, 直到使用。
- 使用前, 从 HMCA 板中清空 PBS 残余物。把它放在生物罩里
2. 加载单元格和椭球体形成
- 收集细胞, 如下所示: 从10厘米培养板细胞单层中取出所有培养基, 用10毫升 PBS 洗涤两次以处理血清残差, 加入5毫升胰蛋白酶 (预热至37摄氏度), 在3摄氏度孵育孵化器37分钟。然后, 轻轻摇动板, 以确保单层剥离, 增加10毫升的完整培养基 (预热至37摄氏度) 和移液器向上和向下直到均匀细胞悬浮液达到。用15毫升新鲜培养基离心和洗涤细胞悬浮液, 然后在适当浓度下悬浮在新鲜的完整培养基中。
- 轻轻地加载细胞悬浮液 (50 µL, 150–360 x 103细胞/毫升在中等, ~ 16–40细胞每 MC) 在 HMCA 的顶部, 并允许细胞通过重力沉降15分钟。
- 轻轻添加6–8等份500µL 新鲜培养基 (总3–4毫升) 到边缘的宏井塑料底部环和水凝胶阵列。
- 在37摄氏度和 5% CO 2 中孵育 72 h 和 MCF7 细胞的 HeLa 细胞,在旋转椭球体形成的湿润气氛中。
3. 丙啶碘化物 (PI) 染色的活性检测
- 准备一个 pi 的股票解决方案 (每1毫升 PBS 的 pi 500 µg)。保持在4摄氏度约6月。新鲜准备稀释 1:2, 000 (0.25 µg/毫升), 通过增加6µL 的库存到12毫升的完整培养基没有苯酚红, 为6孔 HMCA 板 (2 毫升每孔)。
- 将 HMCA 板与 48-72 h 旋转椭球体, 从孵化器到生物罩。从 HMCA 中移除所有介质, 方法是将尖端末端靠在水凝胶阵列旁边的宏井塑料底部边缘, 使阵列水箱充满介质。
- 轻轻地添加2毫升的 PI 稀释从步骤3.1 到每个井, 通过倾斜尖端末端的边缘的宏井塑料底部。在潮湿的气氛中孵育 HMCA 板1小时, 37 摄氏度和 5% CO2。继续执行步骤7。
注意: 其他染料也可以在这里使用, 例如, Hoechst 核染色, 四甲基罗丹明甲酯 (TMRM) 线粒体膜电位染色, 荧光素二乙酸 (FDA) 的活细胞检测, 膜联蛋白 V 为凋亡检测和其他。
4. 胶原蛋白混合物制备
- 用高压灭菌器制备无菌双蒸馏水 (DDW) 和100毫升1米氢氧化钠过滤灭菌溶液的库存。保持在 RT 的材料, 和用于胶原混合物制备的小贴士冷冻在-20 摄氏度, 直到使用。
- 10–20在使用前, 放置所有 intergrades 包括: 无菌 DDW, 1 米氢氧化钠无菌溶液, 无菌 10x PBS, i 型胶原蛋白从大鼠尾巴 (储存在4°c 3–月) 和一个无菌管进入冰桶, 直到完全冷却。把冰桶放在生物罩里。
- 准备1800µL 胶原混合物在最终浓度为3毫克/毫升, 6 孔 HMCA 侵入试验板 (300 µL 每孔) 如下。按以下顺序将 intergrades 添加到冷却管中: 515 µL DDW, 24.8 µL 1 米氢氧化钠和180µL 10x PBS。用涡流混合好, 放回冰中。最后, 将1080µL 的胶原蛋白添加到混合物中, 再次涡旋并放回冰中。
5. HA 和胶原蛋白混合物的制备
- 溶解10毫克 HA 在2毫升的无菌 DDW。在室温下孵育混合物几分钟, 轻轻涡旋, 直到粉末完全溶解。将库存解决方案存储在4摄氏度, 长达两年。
- 在使用前, 将 HA 库存解决方案放入生物罩内的冰桶中。
- 如步骤4所述, 制备3毫克/毫升胶原蛋白混合物。添加36µg (7.2 µL) HA 成1800微升的准备使用胶原蛋白混合物, 最终浓度为20µg/毫升。然后, 漩涡再次短暂地放回冰。
6. ECM 混合物添加
- 将 HMCA 板, 与 48–72 h 旋转椭球体, 从孵化器进入生物罩, 并把它放在冰上。孵育10分钟, 直到钢板冷却。在水浴中预加热1% 罩至37摄氏度的溶液。
- 移除 HMCA 周围的所有介质, 方法是将尖端末端靠在水凝胶阵列旁边的宏井塑料底部边缘。然后, 非常小心, 从阵列罐中取出所有介质, 并带有细尖/凝胶加载尖端, 通过倾斜末端在阵列边缘, 轻轻和缓慢吸吮所有中出。
注: 除去水凝胶阵列周围的所有介质后, 阵列罐仍充满介质。为了避免破坏水凝胶 MC 和旋转椭球体脱位, 必须轻轻移除该培养基。 - 将150µL 胶原蛋白混合物或 HA 和胶原混合物 (ECM 混合物) 与预冷冻的细尖, 并添加到阵列罐通过附加尖端到阵列边缘。缓慢释放混合物以避免椭球体脱位。重复此步骤与另一个等分150µL, 总共300µL 每井。按照相同的步骤为每个井, 直到所有水井被填满。然后将盘子放入孵化器中, 1 小时用于 ECM 的全凝胶。
- 完成 ecm 的全凝胶后, 移液器在 ecm 凝胶上的400µL 预热1%。用盖子盖住盘子, 然后在 RT 上孵育2分钟, 4 摄氏度, 用于琼脂糖凝胶。最后, 轻轻地添加2毫升完整的培养基通过倾斜尖端末端在宏观井塑料底部的边缘。
注: 琼脂糖层防止胶原凝胶基质从 HMCA 分离。
7. 入侵检测的采集和分析
- 将 HMCA 板装入带孵化器的电动倒置显微镜台上, 预调整至37摄氏度、5% CO2和加湿气氛。
- 预先确定每个井中图像采集的位置, 以覆盖整个阵列区域, 并使用10X 或4X 目标 (此处使用的图像采集软件需要此步骤, 请参阅下面的材料表了解详细信息)。或者, 通过选择 "施蒂希"选项, 使用任何图像采集软件来促进整个所需区域的自动扫描。
- 获取明亮场 (BF) 图像每 2–4 h 为 24–72 h 的总周期, 以遵循入侵的细胞从椭球体进入周围的 ECM。
- 使用专用荧光立方体 (励磁滤波器 530–550 nm、分色镜 565 nm 长通和发射滤波器 600–660 nm) 获取用于 PI 检测的荧光图像。
- 通过使用工具栏中的"数据库"选项卡, 然后在"导出记录文件"按钮, 从图像采集软件导出延时高炉/荧光图像, 并将其保存在带标签的图像文件格式 (TIFF) 到专用文件夹中。
注意: 我们在 MATLAB 软件中开发了一个特殊的内部分析代码, 其中包括一个设计的图形用户界面 (GUI), 入侵分析可以更快、更容易地执行。在该分析代码中, 旋转椭球体和入侵区的分割是用贝尔索过滤器半自动完成的, 其次是形态学算子的侵蚀和膨胀。在自动分割区域后, 在需要时进行手动校正以提高准确度。分段完成后, 软件自动计算一组参数, 并导出到 excel 文件以进行进一步操作。参数列表如下: 基本椭球截面面积在时间 = 0, 与椭球体相连的细胞侵入区域 = 主侵区, 与主侵区分离的细胞面积, 与主侵区分离的细胞数, 平均距离从基本的椭球体中心到主侵区和分离细胞的周长和集体入侵距离参数 = d (d = √ ((X2 -X1)2 + (Y2 -Y1)2) 出x 和 y 椭球体质心坐标, 之前 (x1, y1) 和之后 (x2, y2) 集体入侵过程)。或者, 可以使用任何其他专用软件来进行图像分析。 - 打开 GUI 并按下"加载 BF"按钮。图像打开后, 调整分割参数 (最小尺寸: > 1 和半径闭合: > 1) 以实现椭球体及其入侵区域的精确分割, 然后按"感兴趣区域 (ROI)"按钮执行和每个椭球体周围都会出现一个边框。如果自动分段不正确, 请按"删除"或"添加"按钮, 然后手动进行请求的更正。对后续图像重复相同的步骤。
- 按"跟踪"按钮对旋转椭球体进行编号, 软件将为每个时间间隔图像中的每个椭球体分配相同的编号。然后, 按下"测量"按钮, 将生成包含所有参数的电子表格。将此电子表格保存为 excel 文件, 以便在 excel 软件的结果处理和统计中进一步使用。
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Representative Results
独特的 HMCA 成像板用于3D 肿瘤旋转椭球体的侵袭性测定。整个测试, 开始与椭球体形成和结束与入侵过程和额外的操作, 在同一板块内执行。对于椭球体的形成, HeLa 细胞被加载到阵列盆地中, 并通过重力沉降到水凝胶 MCs 中。水凝胶 MCs 具有非附着性/低附着特性, 促进细胞细胞相互作用和3D 肿瘤旋转椭球体的形成。图 2A说明了在 MCs 中解决的单元格, 使用 150 x 103细胞/毫升加载解决方案 (i. e., 每 MC 计算值的16个单元格)。显然, 每个 mc 的单元格占用量不是通过阵列均匀分布的, 平均获得的统计分布是每个 mc 14.78 ±3.60 个单元格。图 2B中的表汇总了整个 HMCA 板的每个 MC 的单元格分布。宏阱中细胞分布的平均变异系数 (CV) 为 43.33%, 而宏阱之间的平均值为24.37%。细胞占用的差异是至关重要的, 直接决定了旋转椭球体形成的大小和整个板块的均匀性。为了减少/最小化每个 MC 的单元格数量所产生的变异性, 对结果的分析是在单元素分辨率下执行的。图 2C中的图解说明了3天旋转椭球体的大小 (截面积) 分布。图 2D清楚地说明了计算每个椭球体 (截面面积 3/天 2) 的生长比, 其分布比绝对尺寸分布 (图 2C) 更均匀, 产生的 CV 为15.48% 和 52.80%,分别。3天旋转椭球体的球状直径分布产生24.52% 的 CV, 生长比 (day3/day2 的直径) 为7.45%。这些 CV 值类似于17或更高的18其他报告, 通过重力来实现单元格加载。为了消除由于每个 MC 初始种子细胞数的变异性而产生的测量参数方差, 最好将所选参数规范化为初始像元数或同一对象的任何其他测量参数, 例如每个椭球体都有其内部控制。通过跟踪 HMCA 成像板上的对象, 可以很容易地应用这种方法。
HMCA 成像板可以很容易地跟踪椭球体的形成和生长过程。图 3 a B显示了 HMCA 成像板上一个区域的 BF 图像, 其中包含24小时 HeLa 细胞集和成熟的5天3D 多体物体的各自图像, 它们变得更加球形和致密。显然, 大多数物体在5天的潜伏期内都保留了它们的位置。在椭球体形成过程中, 对形状 (球形度) 和尺寸 (截面面积) 进行了分析,如图 3C所示。散点图显示了从1天到5天的两个参数的增加;0.544 ±0.020 美大至 0.684±0.016 美大, 用于球形度 (p < 0.05) 和 0.00356± 0.00013 mm2至0.00538 ± 0.00015 mm2 , 用于截面积 (p < 0.05), 分别为。24 h 骨料体积小, 具有非常规形状, 相应的5天旋转椭球体较大, 获得球形形状。
通过使用低浓度 PI 进行染色19 , 避免了染料洗涤的需要, 对椭球体细胞活性的检测是执行的。PI 穿透细胞膜, 然后进而嵌入到非存活细胞的 DNA 中。图 4A显示5天 HeLa 旋转椭球体染色与 PI (红色)。图 4B总结了每个椭球体截面面积中红色面积 (代表死细胞) 百分比的分析。直方图显示85% 的椭球体种群的最大值为5% 红色染色面积, 平均为3.01 ± 2.34% (左直方图)。旋转椭球体的截面积 (右直方图) 显示正态分布, 平均分布为0.02447 ± 0.00487 mm2。
在生产3天成熟的 HeLa 旋转椭球体后, 入侵检测在 HMCA 成像板内进行。对3D 肿瘤椭球体侵入过程中的各种变量, 如 ECM 组成、抑制剂和活化剂的影响进行了研究。对于入侵检测性能, 介质被轻轻移除, 用 ECM 溶液移液器取代旋转椭球体进入 MC 阵列盆地。在 ECM 溶液完全凝胶后, 将完整培养基加入到宏井中。(1) 为了研究 HA 对 HeLa 椭球体自发侵袭过程的影响, 旋转椭球体的胶原蛋白和 HA 混合溶液 (图 5A), 并与仅胶原蛋白溶液 (图 5C) 相比较,在 ECM 凝胶 (t = 0 h) 后获得了 BF 图像。随后, 在63小时内每5小时对同一区域进行成像, 然后进行入侵过程的动力学。在孵育50小时后, 旋转椭球体嵌入在胶原蛋白和 HA (图 5B) 显示较低的细胞分散到周围的 ECM 与旋转椭球体嵌入在胶原蛋白 (图 5D)。图 5E总结了99旋转椭球体在单椭球分辨率下的入侵区动力学分析。图 5E绘制了两组时间内平均/平均侵入面积, 并清楚地表明, 将 HA 添加到胶原蛋白会抑制球体中的细胞色散, 从而导致较小的侵入区域。与胶原蛋白和 HA 溶液 (0.001410 ±0.000941 毫米2/小时) 相比, 每个旋转椭球体胶原蛋白 (0.001973 ±0.000894 毫米2/小时) 的线性回归调整曲线所产生的斜坡的平均值显著不同 (p = 0.003, t-检验: 假设相等方差的两个样本)。(2) 为了检验漆黄素 (在几种水果和蔬菜中发现的生物活性黄酮的影响, 通过对包括磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt/c-琼在内的几个分子靶作用来显示细胞抑制和 migrastatic 活性n-末端激酶 (JNK) 信令和 Wnt/β-连环蛋白信号下调基质金属蛋白酶 (基质金属蛋白酶) 等20) 在 HeLa 椭球体自发侵入过程中, 增加了药物浓度, 并BF 图像在 t = 0 (图 6A) 和 24 h 后获得 (图 6B-C)。如所示, 10 µM 的漆黄素 (图 6C) 抑制旋转椭球体周围细胞的分散, 与未处理的 HeLa 旋转椭球体相比 (图 6B)。剂量反应实验的侵袭区分析 (图 6D) 明显抑制了漆黄素 (p < 0.003) 的10-40 µM, 在10µM 和更高浓度下达到饱和。(3) 已表明, 在纳米摩尔水平上, NO 通过刺激肿瘤扩张和迁移16, 有助于更积极的乳腺癌表型。为了研究 NO 对胶原蛋白 MCF7 旋转椭球体集体侵袭过程的影响, 将1µM 硬脂酸/一氧化氮供体 (繁琐/no) 添加到完整培养基中, 在 t = 0 和 t = 20 h 处获得 BF 图像. 戏剧性在没有捐献者接触的情况下, 3D 旋转椭球体的形态和位置的变化是显而易见的 (图 7A-B)。旋转椭球体失去他们的球形度, 变得更拉长获取变形虫迁徙表型。同时, 观察到周围胶原基质中旋转椭球体的增强移位 (图 7C)。平均伸长值从1.305 ±0.193 美大显著增加到1.477 ±0.298 美大, (p < 0.0006)。测量相同旋转椭球体的平均迁移距离显著延长, 0.0788 ±0.0575 毫米和0.3164 ±0.3365 毫米在缺席和存在繁琐/NO, 分别 (p < 4 x 10-6)。
利用半自动化内部 MATLAB 软件实现了椭球体入侵的图像分析。HMCA 中的椭球体形成和侵入所获得的延时图像由一个图像中的许多旋转椭球体组成 (在10X 放大倍率下为4-6 旋转椭球体, 4X 放大时为25-30 旋转椭球体)。对图像中的所有旋转椭球体进行了椭球体的形成、生长和入侵分析。图 8A给出了椭球体入侵所提取的关键参数, 在一个时间点 (t = 16 h) 显示了4旋转椭球体的代表性图像分割。由红色边界定义的主要入侵区域, 以及分离和分散在它周围 (由黑色箭头指示) 的分隔单元格被跟踪和编号为每个球体随着时间的推移。在 t = 0 入侵前的椭球体大小由蓝色边界定义。从球体质心到入侵区周长 (包括分离细胞) 的平均/平均入侵距离, 由被包围的红色分割和黄色箭头表示。从这个延时实验中提取的数据总结于图 8B-D。图 8B展示了随着时间的推移, 每个椭球体中心的平均侵入距离的高程。图 8C显示了随着时间的推移, 每个旋转椭球体的总侵入面积的海拔 (包括主要入侵区和分离/脱离细胞区)。图 8D1-4显示了与每个球体 (随着时间) 的总侵入面积相比, 分离细胞面积的大小。旋转椭球体 #1、#2、#3 和 #4 分别为33、7、4和5。图 8E显示了在胶原蛋白中嵌入的 126 HeLa 旋转椭球体20小时以上的脱离细胞的累积数。这里展示了在被检查的种群中, 在未分离细胞的数量上存在着巨大的分布, 平均值为12.3 ±12.8 个细胞。
图 1: HMCA 成像板.(A) 用 HMCA 的一个宏观浮雕图像。(B) HMCA 成像板内一个 MC 的横截面。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: HMCA 成像板中细胞分布和椭球体生长比的均匀性.(A) 用 Hoechst 33342 1 µg/毫升预染色的 HMCA 的 BF 和荧光图像叠加 (每毫升装载浓度 150 x 103细胞)。图像在 MC 中的细胞沉降后获得. 图像放大倍率 4X, 比例尺 = 500 µm. (B) 表总结了 HMCA-6-well 成像板中 HeLa 细胞的分布情况。细胞计数从 90 MC/宏-好。结果以平均±标准差 (SD) 为基准, 在宏观井内和 SD/mean100 之间计算 CV 值。(C) 由 BF 图像确定的3天旋转椭球体、n = 418 的截面积的分布直方图。(D) 椭球体生长比的分布直方图 (3/天2天的截面积)。每418旋转椭球体的单元素分辨率计算生长比。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 在 HMCA 成像板中跟踪椭球体的形成.BF 细胞图像 (装载浓度 120 x 103细胞每毫升) 在 HMCA 中孵育1天 (A) 和5天 (B)。图像放大倍率 4X, 刻度条 = 500 微米。(C) 将3D 对象球形度的散射图作为其截面积的功能, 经过1天 (蓝色钻石) 和5天 (褐色方块) 孵育后细胞的加载。每个标记表示来自单个椭球体的分析数据, n = 83。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 检测成熟旋转椭球体细胞活性.5天旋转椭球体 (装载浓度 360 x 103细胞每毫升) 与 PI 0.25 µg/毫升 (A) 染色的 BF 和荧光图像的叠加。图像放大倍率 4X, 比例尺 = 500 µm. (B) 相对于椭球体 (左面板) 的截面积和截面面积的分布直方图 (右面板), n = 84 的 PI 面积百分比的分布直方图。PI 面积百分比在84旋转椭球体的每一个单元素分辨率下计算。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: ECM 组成对椭球体侵入过程的影响.BF 图像的3天 HeLa 旋转椭球体嵌入3毫克/毫升胶原蛋白和20µg/毫升 HA (a) 和3毫克/毫升胶原蛋白 (C), 在 t = 0 h 和后 50 h 的孵化 (B) 和 (D), 分别。图像放大倍率 10X, 缩放栏 = 200 µm。将 HMCA 成像板加载到配备孵化器的倒置显微镜的舞台上。每5小时采集图像, 并在图 (E)、n = 99 中显示动力学分析。每条曲线代表入侵区域的平均± SD, 用于胶原蛋白和 HA (蓝色钻石) 和仅用于胶原蛋白 (棕色方块)。曲线上的平均线性回归曲线及其方程和 R 平方值表示。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6: 漆黄素抑制 HeLa 旋转椭球体的自发侵袭.BF 图像的3天 HeLa 旋转椭球体, 嵌入在3毫克/毫升胶原蛋白 (a) 的混合物在 t = 0, 然后, 24 h 添加0µM (B) 和10µM 漆黄素 (C) 到完整的培养基。图像放大倍率 4X, 比例尺 = 500 µm. 在终点 (t = 24 h) 的每个椭球体的侵入区域的分析显示在图 (D), n = 488。该曲线表示入侵区的平均± SD, 其功能为0-40 µM 漆黄素。漆黄素治疗显著抑制入侵在10µM (p = 4.65 x 10-6), 20 µM (p = 0.0021) 和40µM (p = 4.86 x 10-8), 使用 t-检验: 两个样本假设相等方差。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 7: NO 诱导集体入侵 MCF-7 乳腺癌旋转椭球体.BF 图像2天 MCF-7 乳腺癌旋转椭球体, 嵌入在胶原蛋白 (A) 在 (t = 0) 和 (B) 后 20 h 暴露于1µM 繁琐/NO。球体 ROI 分割是由红色边框定义的, 在 bf 图像 A 和 B 的 ROIs 上以红色进行叠加和编号, 在 bf 图像 b 上叠加表示椭球体大小和位置在 t = 0。放大倍率 4X, 比例尺 = 500 µm. (C) 与对照 (蓝色钻石) 相比, 单个乳腺癌的伸长率因子与迁移距离的散射图旋转椭球体1µm 繁琐/NO (棕方形)20小时, n = 54。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 8: HeLa 细胞自发入侵图像分析.BF 图像3天 HeLa 旋转椭球体, 16 小时后嵌入胶原蛋白 (A)。放大倍率10X。椭球体侵入区和脱离细胞由红色边界定义, t = 0 的球体大小由蓝色边界定义, 从球体质心的平均侵入距离由黄色箭头表示, 而脱离的细胞则用黑色箭头表示。绘制从椭球体中心 (B) 和总侵入区 (C) 的平均侵入距离的增加时间。曲线表示椭球体 #1 (蓝色钻石)、椭球体 #2 (褐色正方形)、椭球体 #3 (绿色三角形) 和椭球体 #4 (紫色 Xs)。(D) 主 (蓝色) 和分离细胞 (棕) 侵入区的条形图随着时间的推移而增加。(E) 在入侵过程的20小时内, 每个椭球体的离散单元格的累计数量的分布直方图, n = 126。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
据记载, 活生物体的特点是其复杂的3D 多细胞组织与常用的2D 单层培养细胞截然不同, 强调使用细胞模型更好地模仿功能的关键需要和生物药物筛选的过程。最近, 多细胞旋转椭球体、器官型文化、organoids 和片上器官已被引入8用于标准化药物发现。然而, 3D 多细胞模型的复杂性极大地危及了其鲁棒性、并行性和数据分析, 这对检测效率至关重要。
入侵能力的定量评估通常通过水凝胶材料测量细胞的移动。为了用传统的微孔板测量肿瘤的侵袭性, 大量的癌细胞被播种在圆底板上, 并通过离心21,22被强制聚合。这些板块限制相邻井中的细胞/椭球体相互作用, 而圆形底部则阻碍光学质量, 使图像采集复杂化。在其他方法中, 单个细胞随机封装在水凝胶中, 在3D 环境中生长和功能, 但不一定发展成成熟的旋转椭球体23,24。此外, 需要在水凝胶中进行细胞定位的复杂程序, 如基于磁力的细胞模式25或双光子激光照射生物活性凝胶26。
本文提出的基于 HMCA 的技术在上述方法中具有优势: 可以很容易地实现细胞定位、自发聚集和从少数分散细胞中旋转椭球体创建, 从而使有价值的有限蜂窝样本 (g.、癌症干细胞样细胞或从患者标本中提取的原发细胞)。该系统在长期实验中控制了组成旋转椭球体的细胞的性质以及在其确切的空间位置。此外, MC 的平底便于在同一焦距图上生成大量旋转椭球体, 因此通过广域显微镜进行大面积的快速照明和图像采集是可能的, 无需复杂耗时的共聚焦显微镜。该系统易于处理, 实用性强。通过应用简单的操作程序, 我们实现了高占用的椭球体种群, 其中约50% 的旋转椭球体具有可比的尺寸和可靠的癌症细胞侵袭能力分析。此外, 利用高含量的分析方法和大量旋转椭球体培养的 HMCA 装置, 可以同时分析药物对侵袭能力的影响, 同时细胞抑制和/或细胞毒性作用。此外, 在 HMCA 中, 所有细胞元素共享相同的空间和媒介, 从而可以研究通常通过细胞分泌的细胞因子、趋化因子、激素和 ECM27介导的椭球体-椭球体相互作用。这种交叉对话促进了单个细胞/小细胞团在宏观井容积中的存活和功能。
执行该协议的一个关键步骤是在旋转椭球体上添加 ECM 混合物并验证其正确聚合。旋转椭球体不会显示迁移行为, 即使它们嵌入在 ECM 中, 除非组装和交联发生, 并且形成适当的胶原纤维。通过 BF 照明可以观察到胶原纤维, 我们建议在显微镜下检查板, 以确认在这个阶段结束时胶原纤维的创建。由于旋转椭球体的数量取决于初始细胞浓度和占用的 MCs 的百分比, 在初始单元格加载后应检查阵列, 如果单元格占用率不是最佳的, 则可以对同一阵列进行重新播种。事实上, 本文描述的 HMCA 的尺寸和几何形状是为了容纳相对较小的细胞簇 (直径高达150µm)。这可能被认为是一个限制, 因为设计一个新的数组类型将是分析从较大的细胞结构的细胞迁移所必需的。
目前的平台使用最小的细胞数和小试剂体积, 同时提供一个大样本大小 (数以千计的旋转椭球体每板)。为了分析12种不同化合物的抗转移活性, 需要2个单6孔 HMCA 基板, 产生约5000旋转椭球体的结果, 而至少需要五十96孔板才能达到相同的结果。在 HMCA 的单个对象分辨率下分析迁移的能力提供了高水平的统计鲁棒性和准确性, 从而能够研究众多旋转椭球体中的结构和功能入侵异质性。
这项研究唯一地证明了在暴露于繁琐/NO 的情况下, 乳腺癌椭球体种群的集体入侵。MCF7 细胞团簇显示变形虫迁移表型, 并可自动达到各椭球体形态和位置的定量变化。根据我们的知识, 这是第一个阵列系统, 便于监测和分析在许多3D 结构的集体入侵。通过分析各椭球体的相对方向和入侵距离, 可以研究旋转椭球体在种群中的相互作用。此外, 还对细胞外微环境因子对癌细胞行为的影响28进行了说明。在这些因素中, 微环境的刚度和组成被证明对细胞迁移有强烈的影响。HMCA 技术提供了一个定义的仿生的体外平台, 可以方便地访问和控制 ECM 的这些特性。在本研究中使用的3毫克/毫升浓度的纯胶原 i 型水凝胶的刚度, 据报告是大约 50-600 Pa29,30,31和增加 HA (20 µg/毫升; 0.4 wt%) 没有改变水凝胶的刚度显著32,33。因此, 中分子量 (毫米)-HA 对 3D HeLa 旋转椭球体侵袭的抑制作用不是由于刚度的变化。这些结果与以前的研究一致, 表明 ha 对细胞侵袭的双峰效应, 高依赖于 ha 分子量34、35、36、37。
这些方法的未来应用包括在宏观井中不同区域的肿瘤和基质细胞的侧边多细胞型培养, 以及对下游分子分析的特定旋转椭球体的检索。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了佩雷斯和朱蒂丝 Weisbrodt 的遗赠的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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