Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58359
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Bar-Ilan University

Summary

На основе HMCA изображений пластина представлен для вторжения анализа производительности. Эта пластинка облегчает формирование трехмерной (3D) опухоли сфероидов и измерение раковых клеток вторжения в внеклеточного матрикса (ECM). Квантификация assay вторжения достигается полуавтоматического анализа.

Abstract

Метастазами рака известно причиной 90% рака летальность. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, который инициирует с нашествия/проникновения опухолевых клеток в соседние ткани. Таким образом вторжение представляет собой решающий шаг в метастазов, делая вторжение процесса исследований и разработок анти метастатического наркотиков, весьма значительный. Для удовлетворения этого спроса, существует необходимость разработки моделей 3D в пробирке , которые имитируют архитектура твердых опухолей и их микроокружения наиболее близко к в естественных условиях государства, с одной стороны, но в то же время быть воспроизводимость, надежные и подходит для высокая урожайность и высокое содержание измерения. В настоящее время, большинство анализов вторжения опереться на сложные microfluidic технологий, которые являются адекватными для научных исследований, но не для большого объема наркотиков скрининг. Другие анализы, с помощью устройств на основе плиты с изолированной отдельных сфероидов в каждой скважине материал потребления и имеют низкий выборки за состояние. Цель нынешнего протокола является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Мы разработали 3D модель для assay вторжения на основе изображений плита HMCA для исследования прорастание опухоли и анти метастатического лекарственных препаратов. Это устройство позволяет производство многочисленных единообразных сфероидов за хорошо (высокая выборки за состояние) окружении компоненты ECM, при этом постоянно и одновременно наблюдения и измерения сфероидов разрешением одного элемента для средних пропускная способность скрининг анти метастатического наркотиков. Эта платформа здесь представлено производство HeLa и MCF7 сфероидов для иллюстрирующих одну ячейку и коллективные вторжения. Мы сравнить влияние ECM компонент гиалуроновой кислоты (HA) на инвазивные способность коллагена, окружающих HeLa сфероидов. Наконец мы представляем Fisetin (вторжения ингибитор) HeLa сфероидов и оксида азота (NO) (вторжения активатор) для MCF7 сфероидов. Проанализированы результаты собственных программное обеспечение, которое позволяет полуавтоматический, простой и быстрый анализ, который облегчает Многопараметрический экспертизы.

Introduction

Смерти рака обусловлено главным образом распространение метастатическим клеток в отдаленные места. Многие усилия в лечении рака сосредоточены на ориентации или предотвращение формирования метастатического колоний и прогрессирования системных метастатической болезни1. Миграции клеток рака является важным шагом в процессе метастазов опухоли, таким образом, исследования рака вторжения Каскад очень важное и необходимое условие для нахождения анти метастатическим терапии.

Было установлено, что использование животных моделей как инструменты для изучения метастатической болезни очень дорого и не всегда представитель опухоли в организме человека. Кроме того внеклеточная микроокружения топологии, механики и состав сильно влияют на поведение клеток рака2. Поскольку в естественных условиях модели по своей сути не имеют возможности отделить и контролировать такие конкретные параметры, которые способствуют рака вторжения и метастазов, существует необходимость для управляемой biomimetic в vitro моделей.

Для того чтобы метастазировать в отдаленные органы, раковые клетки должны exhibit перелетных и инвазивные фенотипических признаков, которые могут быть направлены для терапии. Однако поскольку большинство моделей в vitro рака не имитируют фактические возможности солидных опухолей3, это очень сложно обнаружить физиологически соответствующих фенотипов. Кроме того фенотипической неоднородности, которая существует в пределах опухоли, диктует необходимость анализа миграции опухоли на одного элемента резолюции для того, чтобы обнаружить фенотип направленного лечения, например, путем инициирования метастазирования клеток населения в гетерогенных опухоли4.

Исследование клеток подвижности и коллективной миграции главным образом проводится в монослоя культур клеток эпителия на однородных плоских поверхностей. Эти обычные сотовой модели для миграции клеток рака основаны на анализе населения отдельных ячеек, вторжение через мембраны и компоненты ECM5, но в таких системах, не могут быть внутренние различия между отдельными ячейками изучал. Создание 3D сфероидов, либо через леса или эшафот свободный микро-структур рассматривается как улучшенные средства для изучения опухоли клеток роста и рак вторжения6,,78. Однако большинство 3D систем не подходят для форматов высокой пропускной способности, и взаимодействие между сфероида обычно не могут быть достигнуты, поскольку изолированные индивидуальные сфероидов создаются в каждом микро ну9. Недавние исследования с участием миграции рака основаны на microfluidic приборы3,10,11,12, однако, эти сложные microfluidic инструменты трудны для производства и не может использоваться для высокой пропускной способности, скрининг (HTS) борьбы с инвазивными наркотиков.

Два главных фенотипы, коллективных и индивидуальных клеток миграции, которые играют роль в опухолевых клетках, преодоление барьера ECM и вторжение в соседние ткани, были продемонстрировали13,14, каждый показ различных морфологических характеристики, биохимические, молекулярно-генетических механизмов. Кроме того две формы миграции опухолевых клеток, фибробластов как и Саркодовые, наблюдаются в каждом фенотип. Поскольку оба вторжения фенотипы и режимах миграции, определяются главным образом морфологических свойств, есть потребность сотовых моделей что включить обнаружение на основе изображений и изучение всех форм прорастание опухоли и миграции клеток.

Общая цель текущего метода является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D в vitro на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Здесь мы представляем на основе HMCA 6-ну изображений пластину для исследования прорастание опухоли и анти метастатическим терапии. Эта технология позволяет формирование большого числа сфероидов единообразных 3D опухоли (450 за хорошо) в структуре гидрогеля микро камеры (MC). Различные компоненты ECM добавляются в массив сфероида чтобы вторжения клетки в окружающую среду. Процесс вторжения непрерывно контролируется кратко - и долгосрочной перспективе наблюдения же индивидуальных сфероидов/вторжение клеток и способствует морфологическая характеристика, флуоресцентный окрашивание и поиска конкретных сфероидов в любой точке. Поскольку многочисленные сфероидов разделяют пространство и среднего, возможен взаимодействия через растворимых молекул между отдельными сфероидов и их влияние друг на друга. Анализ полуавтоматический изображения выполняется с помощью собственного кода MATLAB, который позволяет быстрее и эффективнее сбор большого объема данных. Платформа облегчает точную, одновременное измерение многочисленных сфероидов/вторжение клеток в времени-эффективно, позволяя средней пропускной способности скрининга наркотиков анти вторжения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HMCA пластина тиснение

Примечание: Полный процесс проектирования и изготовление полидиметилсилоксан (PDMS) штамп и HMCA изображений пластины, используемые в настоящем протоколе подробно в наших предыдущих статьях15,16. Отметку PDMS (отрицательные формы) используется для тиснения HMCA (положительные формы), которая состоит из приблизительно 450 МКН в колодец (рис. 1A). Как показано на рисунке 1B, каждый из МКС имеет форму усеченной пирамиды квадратная вверх вниз (высота: 190 мкм, небольшая базовая область: 90 мкм x 90 мкм и большая база площадь: 370 мкм x 370 мкм). Пластина HMCA используется для подготовки и культивирование сфероидов 3D опухоли и в дальнейшем, для вторжения assay. Кроме того коммерческие марки могут использоваться для производства HMCA.

  1. Подготовьте раствор 6% низких плавления агарозы (LMA). Вставьте LMA порошок и стерильные фосфатный буфер (PBS) (0,6 г LMA на 10 мл PBS) в стеклянной бутылке с магнитной мешалкой. Поместите бутылку на нагревательной пластинки и перемешать раствор во время нагрева до 80 ° C на несколько часов, пока не будет достигнуто единообразное решение. Держите решение при 70 ° C до использования.
  2. Предварительно нагрейте PDMS штемпеля до 70 ° C в духовке. Держите его теплой до использования. Можно также использовать коммерческие штамп и следуйте инструкции.
  3. Поместите пластины для коммерческих 6-ну стекло дно на сухой ванны, разогретую до 75 ° C. Подождите несколько минут, пока пластины полностью тепло.
  4. Залейте капли (400 мкл) разогретую LMA стекла дно каждого из этих скважин в пластине. Осторожно поместите отметку подогретую PDMS агарозы падение. Инкубации при комнатной температуре (RT) для 5 – 10 мин для предварительно гелеобразующего и предварительного охлаждения. Инкубируйте на 4 ° C в течение 20 минут для достижения полного агарозы гелеобразование. Затем аккуратно отделите PDMS, оставляя агарозном геле с MCs узором.
    Примечание: Этот шаг выполняется одновременно на всех скважинах.
  5. Место пластину тиснением в свете отверждения системы оснащены ультрафиолетового (УФ) лампы и Инкубируйте 3 мин.
    Примечание: Теперь HMCA пластина является УФ стерилизации.
  6. Заполните макро скважин с стерильных PBS для обеспечения они хранятся влажным, а затем накладка, оберните его с парафина и хранить при 4 ° C до использования.
  7. Перед использованием пустые PBS остатков от HMCA пластины. Поместите его в биологическое капот.

2. Загрузка клеток и формирования сфероида

  1. Собирать клетки следующим: удалить все среды от 10 см культуры плиты клетки однослойная, мыть дважды с 10 мл PBS для удаления остатков сыворотки, добавить 5 мл трипсина (предварительно разогретую до 37 ° C) и Инкубируйте 3 мин в инкубаторе при 37 ° C. Затем встряхните пластину осторожно, чтобы обеспечить монослоя отряда, добавить 10 мл полного среднего (предварительно разогретую до 37 ° C) и пипетки вверх и вниз, пока не будет достигнуто суспензию однородных клеток. Центрифуга и мыть суспензию клеток с 15 мл свежего среды, а затем, приостановить в соответствующих концентрациях в свежий полного среднего.
  2. Аккуратно загрузить суспензию клеток (50 мкл, 150-360 x 103 клеток/мл в среде, ~ 16 – 40 клеток в MC) на вершине HMCA и позволяют клеткам урегулировать самотеком за 15 мин.
  3. Аккуратно добавьте аликвоты 6 – 8 500 мкл свежие среды (всего 3 – 4 мл) на ободе макро ну пластиковые дна за пределами кольца и гидрогелевые массива.
  4. Инкубируйте НеЬа клетки за 72 ч и MCF7 клетки для 48 ч при 37 ° C и 5% CO2, в атмосфере увлажненные для формирования сфероидов.

3. жизнеспособность обнаружение пропидий йодидом (PI) пятнать

  1. Подготовить раствор Пи (500 мкг Пи на 1 мл PBS). Держите его на 4 ° C для около 6 месяцев. Свеже подготовиться разрежения стоматологов (0,25 мкг/мл), путем добавления 6 мкл запасов до 12 мл полной среды без фенола красного, пластину HMCA 6-ну (2 мл на хорошо).
  2. Передача HMCA пластина с сфероидов 48-72 ч, из инкубатора в биологическом Худ. Удалить все среды из HMCA, опираясь на краю макро ну пластиковых дна помимо гидрогеля массив наконечник конца, оставляя массив бак наполнен среднего.
  3. Аккуратно добавьте 2 mL разбавления Пи от шаг 3.1 для каждой скважины, опираясь на краю макро ну пластиковые нижний наконечник конца. Инкубируйте HMCA пластину за 1 ч при 37 ° C и 5% CO2, в атмосфере увлажненной. Перейдите к шагу 7.
    Примечание: Другие красители могут быть использованы здесь также, например, "Хёхст" для окрашивания ядра, тетраметилродамина метилового эфира (TMRM) для потенциальных митохондриальной мембраны, окрашивание, флуоресцеин диацетат (FDA) для обнаружения живых клеток, Annexin V для апоптоз Обнаружение и др.

4. Подготовка смеси коллаген

  1. Подготовьте двойной стерильной дистиллированной воды (DDW), автоклавах и запас 100 мл раствора фильтр стерилизованные 1 M NaOH. Сохранять материалы на RT и советы, используется для приготовления смеси коллагена, Замороженные при температуре-20 ° C, до использования.
  2. 10-20 минут перед использованием, поместите все intergrades, в том числе: стерильные DDW, 1 M NaOH стерильный раствор, стерильные 10 x PBS, тип I коллагена от крыс хвост (хранить при 4 ° C в течение 3-месяцев) и стерильную пробирку в ведро льда до тех пор, пока полностью остынет. Место ведро льда внутри биологических вытяжки.
  3. Подготовьте 1800 мкл смеси коллагена в конечной концентрации 3 мг/мл, для 6-ну HMCA вторжения пробирного пластины (300 мкл в колодец) следующим образом. Добавить intergrades в охлажденную трубу в следующем порядке: 515 мкл DDW, 24.8 мкл 1 M NaOH и 180 мкл 10 x PBS. Смесь хорошо, вихрь и место обратно в лед. Наконец мкл 1080 коллагена в смесь, вихрь снова и положить обратно в лед.

5. га и подготовка смеси коллагена

  1. Растворите 10 мг в 2 мл стерильного DDW ха. Инкубируйте смеси на RT несколько минут и вихревой мягко пока порошок полностью не растворится. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до двух лет.
  2. Прямо перед использованием, место HA Стоковый раствор в ведро льда внутри биологических вытяжки.
  3. Подготовка 3 мг/мл смеси коллагена как описано в шаге 4. Добавьте 36 мкг (7.2 мкл) Ха в 1800 мкл готовых к использованию коллаген смесь, для окончательного концентрации 20 мкг/мл. Затем, вихрь снова кратко и положил обратно в лед.

6. ECM смесь дополнение

  1. Передача HMCA пластина с сфероидов 48-72 ч, из инкубатора в биологических капюшон и поместите его на льду. Проинкубируйте втечение 10 мин до тех пор, пока пластины охлаждается. Предварительно Нагрейте раствор 1% LMA до 37 ° C на водяной бане.
  2. Удалите все среды вокруг HMCA, от, опираясь на краю макро ну пластиковых дна помимо гидрогеля массив наконечник конца. Очень тщательно, затем удалите всех средних из массива бака с тонкой наконечник/гель загрузки кончиком, опираясь наконечник конца на краю массива, осторожно и медленно сосать всех средних из.
    Примечание: После удаления всех средних от вокруг гидрогеля массив, массив танк еще наполнен среднего. Эта среда должна быть удалена очень аккуратно во избежание разрушения гидрогеля MC и вывих сфероидов.
  3. Возьмите 150 мкл коллаген смесь или HA и коллаген смесь (смесь ECM) с предварительно замороженных штрафа отзыв и влить в бак массив путем присоединения кончик к краю массива. Релиз смесь медленно, чтобы избежать сфероида дислокации. Повторите этот шаг с другой Алиготе 150 мкл, для всего 300 мкл в колодец. Выполните ту же процедуру для каждой скважины, пока не будут заполнены все скважины. Затем поместите пластины в инкубатор на 1 ч для полного гелеобразования ECM.
  4. После того, как был достигнут полный гелеобразования ECM, Пипетка 400 мкл подогретым 1% LMA поверх геля ECM. Крышка с крышкой, инкубировать пластину на RT на 5-7 мин, а затем на 2 мин при температуре 4 ° C, для геля агарозы. Наконец осторожно добавьте 2 мл полного среднего, опираясь на краю макро ну пластиковые нижний наконечник конца.
    Примечание: Агарозы слой предотвращает отряд коллагена гелевой матрицы от HMCA.

7. вторжение пробирного сбора и анализа данных

  1. Нагрузка HMCA пластину на моторизованных Перевернутый микроскопа оснащены инкубатора, заранее скорректирована до 37 ° C, 5% CO2 и увлажненные атмосферу.
  2. Предварительно определить позиции для захвата изображений в каждом хорошо с тем, чтобы охватить целый район и использовать 10 X или 4 X целей (этот шаг необходим для изображения приобретения программного обеспечения, используемый здесь, смотрите Материалы таблицу ниже для деталей). В качестве альтернативы использовать любое программное обеспечение приобретения изображений для облегчения автоматическое сканирование всего требуется области, выбрав «Стич» вариант.
  3. Приобрести яркие поля (BF) изображения каждые 2-4 ч для всего периода 24-72 ч для того, чтобы следовать за вторжения клеток от сфероида тела в окружающих ECM.
  4. Приобрести флуоресцентных изображений для обнаружения PI, используя выделенный флуоресцентные куб (возбуждения фильтр 530 – 550 Нм, дихроичное зеркало 565 Нм длинный проход и выбросов фильтр 600-660 нм).
  5. Экспорт покадровой BF/флуоресцентный изображений из программного обеспечения получения изображений и сохранять их в формате файла с тегами изображения (TIFF) в выделенную папку, используя вкладку «База данных» в панели инструментов, а затем кнопку «Экспортировать записи файлов» .
    Примечание: Мы разработали специальный внутренний анализ кода в MATLAB программное обеспечение, которое включает в себя дизайн графический пользовательский интерфейс (GUI), в котором вторжения анализ может быть выполнен быстрее и проще. В этот анализ кода сегментация сфероидов и вторжения области делается полуавтоматический с помощью фильтра Собел следуют морфологических операторов эрозии и растяжений. После автоматической сегментации районов ручной исправления были сделаны там, где необходимы для улучшения точности. После завершения сегментации набор параметров автоматически рассчитывались на основе программного обеспечения и экспортируются в файл excel для дальнейшей обработки. Список параметров являются: основные сфероида сечения на время = 0, вторжения область ячеек, подключенных к сфероида тела = основные вторжения, площадь клеток, отделены от основной вторжения области, количество клеток отделены от основной вторжения области, среднее расстояние от вторжения из основных сфероида центра масс на окружность основных вторжения района и разделенных ячеек и коллективные вторжения расстояние параметр = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) из Координаты X и Y сфероида центра масс, перед (X1, Y1) и после (X2, Y2) процесс коллективного вторжения). Кроме того анализ изображений может быть сделано с любым другим специализированным программным обеспечением.
  6. Откройте графический интерфейс и нажмите кнопку «BF нагрузки» . После открытия изображения, настроить параметры сегментации (минимальный размер: > 1 и радиус закрыть: > 1) чтобы добиться точной сегментации сфероида и его вторжения, затем нажмите кнопку «Регион интерес (ROI) сегментации» для исполнения и вокруг каждого сфероида появится граница. Если автоматическая сегментация неверно, нажмите кнопку «Удалить» или «Добавить» и внести запрошенные исправления вручную. Повторите те же шаги для последующего изображений.
  7. Нажмите кнопку «Отслеживание» на номер сфероидов и программное обеспечение будет назначать тот же номер для каждого сфероида в каждом из изображений промежуток времени. Затем нажмите кнопку «Измерение» , которая будет генерировать таблицу со всеми параметрами. Сохраните эту таблицу в виде файла excel для дальнейшего использования в обработки результатов и статистики в excel программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Уникальный HMCA изображений пластина используется для вторжения assay 3D опухоли сфероидов. Всего, начиная с формирования сфероида и заканчивая процессом вторжения и дополнительные манипуляции, генотипирования в пределах же пластины. Для формирования сфероида клетки HeLa загружаются в бассейне массива и поселиться в гидрогеля MCs самотеком. Гидрогель МКН, которые имеют характеристики non сторонник Лоу вложений, облегчить ячеек взаимодействия и формирования 3D опухоли сфероидов. Рисунок 2A иллюстрирует клетки, поселились в MCs, после использования 150 x 103 клеток/мл загрузки решения (т.е., ~ 16 ячеек на MC рассчитывается значение). Ясно, что размещение клеток на MC не распределяется равномерно по массиву, и средний полученная статистика распределения 14,78 ± 3,60 клетки в MC. В таблице на рисунке 2B распределения клеток в MC для всей HMCA пластины. Средний коэффициент вариации (кв) клетки распределения в рамках макро Ну это 43.33%, в то время как между макро Уэллс это 24.37%. Различия в размещение ячейки имеют решающее значение и непосредственно диктовать размер сфероидов сформирован и их однородности по всей пластине. Для того, чтобы уменьшить/минимизировать изменчивость, созданные количество ячеек на MC, на одного элемента резолюции проводится анализ результатов. Участки в рисунке 2 c-D иллюстрируют распределение (площадь поперечного сечения) размер 3-дневный сфероидов. Это четко проявляется в 2D фигура что расчет соотношения роста каждого сфероида (площадь поперечного сечения в день 3/день 2) имеет более равномерное распределение чем абсолютный размер распределения (рис. 2 c), уступая CV 15.48% и 52.80%, соответственно. Распределение сфероида диаметр 3-дневный сфероидов дает резюме 24.52% и роста коэффициент (диаметр на day3/день2) 7,45%. Эти величины CV похож на17 или выше, чем18 других сообщает о достижении ячейки загрузки под действием силы тяжести. В целях устранения измеряемого параметра дисперсии, вследствие изменчивости в первоначальных посеян мобильный номер в MC, предпочтительнее нормализовать выбранных параметров начальной ячейки номер или любой другой измеряемого параметра того же объекта, такие что каждый сфероида имеет его внутреннего контроля. Этот подход может легко применяться отслеживание объекта на пластину изображений HMCA.

Процесс сфероида формирования и роста можно легко следует на HMCA изображений пластины. Рисунок 3A-B показывает BF изображение одного региона на HMCA изображений пластины, содержащий 24 h клеток HeLa агрегатов и соответствующие изображения пожилые, 5–день 3D многоклеточных объектов, которые становятся более сферической и плотнее. Четко показано, что большинство объектов сохраняют их местоположение в течение 5-дневного инкубационного периода. В рисунке отождествленыпредставлен анализ формы (шарообразность) и размеров (площадь поперечного сечения) во время формирования сфероида. Точечная демонстрирует увеличение обоих параметров от 1 дня до дня 5; 0,544 миллиметрах а.е. 0.684± 0,016 а.е. для сферичности (p < 0,05) и 0.00356± 0.00013 мм2 до 0.00538 0,00015 мм ±2 для площади сечения (p < 0,05), соответственно. В то время, как агрегатов 24-h малы и имеют нерегулярные формы, соответствующие 5-дневный сфероидов больше и приобрести сферической формы.

Обнаружение сфероида жизнеспособность клеток выполняется с помощью низкой концентрации PI для окрашивания19 , который обходит необходимость для мытья красителя. PI проникает через клеточные мембраны и затем встраивается в ДНК нежизнеспособных клеток. На рисунке 4A показано 5-дневный HeLa сфероидов окрашенных Пи (в красном). В Рисунок 4Bприводится анализ процент красной области (представляющие отмершие клетки) из каждой сфероида сечения. Гистограмма показывает, что 85% населения сфероида имеет максимальное значение 5% красный окрашенные области, и в среднем составляет 3.01 ± 2.34% (левая гистограмма). Площадь поперечного сечения сфероидов (правый гистограмма) показывает нормальное распределение с средним 0.02447 ± 0.00487 мм2.

После изготовления 3-дневный Зрелые HeLa сфероидов, вторжения генотипирования в пределах HMCA изображений пластины. Можно было бы изучить влияние переменных, таких как состав, ингибиторы и активаторы, ECM на 3D опухолевого процесса сфероида вторжения. Для вторжения анализа производительности средний осторожно удаляется и заменяется с пипетки решений ECM над сфероидов в бассейне массив MC. После полного гелеобразования решения ECM полного среднего добавляется в макро колодец. (1) в целях изучения влияния HA на процесс спонтанной вторжения сфероида HeLa, сфероидов были покрыты коллагена и HA смесь раствора (Рисунок 5A) и по сравнению с теми покрыты коллагена только решения (рис. 5 c), и BF-изображения были приобретены сразу после гелеобразования ECM (t = 0 h). Кинетические вторжения процесса последовали изображений тех же регионах каждые 5 ч в течение 63 h. После 50 ч инкубации сфероидов встроенных в коллагена и HA (Рисунок 5B) показан ниже ячейки дисперсии в окружающие ECM по сравнению с сфероидов, встроенных в коллагена только (рис. 5 d). Анализ области вторжения кинетическим временем для 99 сфероидов на сингл сфероид резолюции приводится в рисунке 5E. Рисунок 5E участков области среднее/среднее вторжения со временем двух групп и ясно показывает, что добавление HA коллаген подавляет клетки дисперсии из сфероида, что привело в небольших районах вторжения. В среднем склонах результате кривых перестройки линейной регрессии для каждого из сфероидов, встроенных в коллагена (0.001973 ± 0.000894 мм/ч2) по сравнению с коллагена и Ха решение (0.001410/ч ± 0.000941 мм2) являются значительно разные (p = 0,003, t тест: Двухвыборочный себя равными дисперсиями). (2) с целью изучения влияния Fisetin (биоактивные флавоноид найдены в нескольких фруктов и овощей, которые показывает цитостатическим и migrastatic деятельность, воздействуя на нескольких молекулярных целей, включая фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) / Akt/c Июнь N-Terminal киназ (JNK) сигнализации и сигнализации результате Wnt/β-катенина матрицы металлопротеиназ (MMPs) и другие20) HeLa сфероида спонтанное вторжения процесса, увеличение концентрации препарата были добавлены к полного среднего и BF изображения были приобретены при t = 0 (рис. 6A) и 24 h позже (Рисунок 6B-C). Как показали, 10 мкм Fisetin (рис. 6 c) подавляет дисперсии клеток вокруг сфероидов по сравнению с-лечение HeLa сфероидов (Рисунок 6B). Вторжения области анализа дозы ответ эксперимента (рис. 6 d) демонстрирует значительное торможение на 10-40 мкм Fisetin (p < 0,003), достижении насыщения при концентрации 10 мкм и выше. (3) было доказано, что нет, на уровне нано Молар, способствует более агрессивным фенотипу рака молочной железы стимулирования опухоли расширение и миграции16. Для того, чтобы изучить влияние NO на процесс коллективного вторжения сфероидов MCF7, встроенных в коллагена, 1 мкм diethylenetriamine/азотная окись доноров (DETA/NO) был добавлен к полной питательной среды и BF изображения были приобретены в t = 0, t = 20 h. драматического изменения в морфологии и местах 3D сфероидов при воздействии не доноров очевидны (рис. 7A-B). Сфероидов теряют их сферичность и стать более вытянутые приобретения Саркодовые мигрирующих фенотип. Одновременно расширенной транслокации сфероидов внутри окружающие коллагеновой матрицы было отмечено (рис. 7 c). Среднее удлинение значение значительно увеличилась с 1,305 ± 0,193 а.е. 1.477 ± 0,298 а.е., (p < 0,0006). Средняя миграции расстояние, измеренное по же сфероидов был значительно расширен, 0.0788 ± 0.0575 мм и 0.3164 ± 0.3365 мм, в отсутствие и в присутствии DETA/NO, соответственно (p < 4 x 10-6).

Анализ изображений сфероида вторжения было достигнуто полуавтоматический доме MATLAB программного обеспечения. Замедленная съемка изображения приобретенных время сфероида формирования и вторжения в HMCA состоит из многочисленных сфероидов в одном изображении (4-6 сфероидов при 10-кратном и сфероидов 25-30 при 4-кратном). Одновременно, был проведен анализ сфероида формирования, роста и вторжения на всех сфероидов в изображении. В 8А рисунок, который показывает представитель изображения сегментации 4 сфероидов в один момент представлены ключевых параметров, извлеченных для вторжения сфероида (t = 16 h). Области основной вторжения определяется красная граница, а также отдельные клетки, которые разъединение и рассеянных вокруг него (показано черными стрелками), были отслеживаются и пронумерованы для каждого сфероида с течением времени. Сфероида размер до вторжения при t = 0 определяется по синей границей. Вторжения среднее/среднее расстояние от сфероида центра массы обхват области вторжения, включая разлученных клетки рассчитывается от обведенные красным сегментации и обозначается желтой стрелки. Данные, извлеченные из этого покадровой эксперимента резюмируется в Рисунок 8B-D. Рисунок 8B экспонатов Высота среднее вторжения расстояние от каждого центра сфероида со временем. Рисунок 8 c экспонатов высота области всего вторжения в каждом из сфероидов со временем (включая основные вторжения зона и зона отделена/разъединение клеток). Рисунок 8 d 1-4 показывает масштабы разделенные ячейки области по сравнению с всего вторжения области каждого сфероида (со временем). Совокупное количество расцепленными клеток — 33, 7, 4 и 5 для сфероидов #1, #2, #3 и #4, соответственно. Анализ совокупного числа расцепленными клеток более 20 h вторжения, полученные из 126 HeLa сфероидов встроенных в коллагена показан на рисунке 8E. Здесь показано, что существует огромный распределение в количество расцепленными клеток в исследуемого населения и среднее значение 12.3 ± 12.8 клеток.

Figure 1
Рисунок 1: HMCA изображений пластина. (A) изображение одного макро ну выбитый с HMCA. (B) поперечное сечение одной MC в пределах HMCA изображений пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: однородность клетки распределения и сфероида роста соотношения в визуализации пластины HMCA. (A) наложение BF и флуоресцентного изображения HMCA, нагруженные клетки HeLa, предварительно окрашенные с Hoechst 33342 1 мкг/мл (Загрузка концентрации 150 x 103 клеток / мл). Изображения были приобретены сразу после поселения клеток в увеличение MC. изображения 4 X, шкалы бар = 500 мкм. (B) таблицы приведены распределения клеток HeLa в пределах HMCA-6-ну изображений пластины. Клетки были подсчитаны с до 90 MC/макро хорошо. Результаты представлены как означает, что ± стандартное отклонение (SD), CV (SD/mean100) вычисляется в пределах и между макро Уэллс. (C) гистограммы распределения площади сечения 3 дня сфероидов, n = 418, определяется от BF изображений. (D) гистограммы распределения коэффициента роста сфероида (площадь поперечного сечения в день 3/день 2). Коэффициент роста рассчитывается на резолюции один элемент для каждого из 418 сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: отслеживание сфероида формирования в визуализации пластины HMCA. Образ BF клеток HeLa (Загрузка концентрации 120 x 103 клеток / мл) инкубировали в HMCA за 1 день (A) и 5 дней (B). Изображения масштаб 4 X, шкалы бар = 500 мкм. (C) разброс участок сферичности трехмерного объекта в зависимости от его площади сечения, после 1 день (Голубые бриллианты) и 5 дней (коричневый квадраты) пост инкубации клеток загрузки. Каждый маркер представляет проанализированы данные от одного сфероида, n = 83. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: определение жизнеспособности клеток в зрелых сфероидов. Наложение BF и флуоресцентного изображения 5 день сфероидов (Загрузка концентрации 360 x 103 клеток / мл) окрашенных Пи 0,25 мкг/мл (A). Изображения масштаб 4 X, шкалы бар = 500 мкм. (B) гистограммы распределения процентов PI площади по отношению к площади сечения сфероида (левая панель) и гистограммы распределения площади сечения (правая панель), n = 84. Процентов от PI площади рассчитывается на резолюции один элемент для каждого из 84 сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: влияние состава ECM на сфероиде вторжения процесса. Образы BF 3 день HeLa сфероидов встроенных в смеси коллагена 3 мг/мл и 20 мкг/мл HA (A) и коллагена (C), 3 мг/мл при t = 0 h и после 50 ч инкубации (B) и (D), соответственно. Изображения увеличение 10 X, шкалы бар = 200 µm. HMCA изображений пластины был загружен на сцену инвертированным микроскопом, оснащенных инкубатора. Изображения были приобретены каждые 5 h и кинетический анализ представлен в участок (E), n = 99. Каждая кривая представляет среднее ± SD вторжения области увеличения со временем, для коллагена и HA (Голубые бриллианты) и коллагена только (коричневый квадраты). Средняя линейной регрессии кривая и ее уравнение и значение R-квадрат, указаны выше кривых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Fisetin подавляет спонтанное вторжения HeLa сфероидов. Образы BF 3 день HeLa сфероидов, встроенные в смеси коллагена (A) 3 мг/мл при t = 0, а затем, 24 ч после добавления 0 мкм (B) и 10 мкм Fisetin (C) для полной питательной среды. Изображения масштаб 4 X, шкалы бар = 500 мкм. анализ вторжения области для каждого сфероида в конечной точке (t = 24 h) представлены в участок (D), n = 488. Эта кривая представляет среднее ± SD вторжения района как функция 0-40 мкм Fisetin. Fisetin лечения значительно препятствует вторжение на 10 мкм (P = 4,65 х 10-6), 20 мкм (P = 0.0021) и 40 мкм (P = 4,86 x 10-8), используя t тест: Двухвыборочный себя равными дисперсиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: NO индуцирует коллективных вторжения в сфероидов рака молочной железы MCF-7. Образы BF 2 дня MCF-7 груди Рак сфероидов, встроенных в коллагена (A) в (t = 0) и (B) после 20 h выдержки до 1 мкм DETA/нет Сфероида ROI сегментации определяется красная граница, накладными и пронумерованы в красном на BF изображения A и B. ROIs определяется синей границей, накладывается на BF изображения B представляют сфероида размера и расположения при t = 0. Увеличение: 4 X, шкалы бар = 500 мкм. (C) A точечная корреляции между удлинение фактор и миграции расстояние индивидуальных груди Рак сфероидов после воздействия 1 мкм DETA/нет (коричневый квадраты) как по сравнению с контролем (Голубые бриллианты) при t = 20 h, n = 54. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: анализ изображений спонтанное вторжения клеток HeLa. Образы BF 3 день HeLa сфероидов, 16 h после внедрения в коллагена (A). Увеличение 10 X. Сфероида вторжения области и Тайо клетки определяются красная граница, сфероиде размер при t = 0 определяется синей границей, среднее вторжения расстояние от центра массы сфероида обозначается желтой стрелки и Тайо клетки обозначаются черными стрелками. Участок увеличение со временем среднее вторжения расстояния от сфероида центра масс (B) и общая вторжения области (C). Кривые представляют сфероида #1 (Голубые бриллианты), сфероиде #2 (коричневый квадраты), сфероида #3 (треугольников зеленого цвета) и сфероида #4 (фиолетовый Xs). (D) Бар Индикаторы главного (синий) и разделенных ячеек (коричневый) вторжения области увеличения со временем. (E) гистограммы распределения совокупное количество разделенных ячеек на сфероиде во время 20 h вторжения процесса, n = 126. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это хорошо документированы, что живые организмы, характеризуются их сложные 3D многоклеточных Организации весьма отличаются от широко используемых 2D монослоя культивируемых клеток, подчеркивая настоятельную необходимость использования сотовой модели, которые лучше имитировать функции и процессы живого организма для наркотиков скрининг. Недавно многоклеточных сфероидов, organotypic культур, organoids и органов на чипе были введены8 для использования в стандартных лекарственных препаратов. Однако большой сложности 3D модели многоклеточных значительно подрывает ее надежности, параллелизации и анализа данных, которые имеют решающее значение для анализа эффективности.

Количественная оценка потенциала вторжения обычно измеряет движение клеток через гидрогелевых материалов. Для того чтобы измерить прорастание опухоли, с использованием традиционных микро ну пластины, посеяна в круглые пластины донные и заставили большое количество раковых клеток в совокупности путем центрифугирования21,22. Эти пластины ограничить взаимодействие клеток/сфероида в соседних скважин, в то время как круглым дном препятствует оптическое качество и затрудняет получение изображения. В других методах отдельные клетки случайно инкапсулирован в гидрогеля, расти и работать в 3D-среде, но не обязательно развиваются в зрелых сфероидов23,24. Кроме того сложные процедуры для клеток позиционирования в пределах гидрогеля необходимы, как на основе магнитной силы клеток патронирования25 или два фотона лазерного облучения биоактивные гидрогели26.

На основе HMCA технологий, представленных в настоящем документе окажется выгодным за вышеуказанные методы: мобильный позиционирования, спонтанное агрегации и могут быть легко достигнуты создание сфероидов от несколько рассеянных клеток, в возможность использования ценных ограниченное сотовых Пример (например., стволовых как раковые клетки или клетки первичной, полученных от пациентов образцов). Система имеет контроль над природой клетки, которые составляют сфероидов а также их точное пространственное расположение в ходе долгосрочных экспериментов. Кроме того плоское дно MC облегчает создание многочисленных сфероидов на один и тот же фокуса план, поэтому быстрое приобретение освещения и изображения больших областей через микроскоп широкое поле возможен, устраняя необходимость для сложных много времени confocal микроскопии. Система проста для обработки и ее практичности возможно. Применяя простые оперативных процедур, мы достигли высоких размещение населения сфероида, в которых примерно 50% сфероидов имеют сопоставимого размера и надежный анализ раковых клеток вторжения. Кроме того влияние препаратов на вторжения могут быть проанализированы одновременно с их цитостатиками и/или цитотоксических эффектов с помощью анализа высоким содержанием подход вместе с HMCA устройством, культивируемых с многочисленными сфероидов. Кроме того в HMCA, все клеточные элементы разделяют те же пространства и среднего, что делает его возможным расследовать сфероид сфероид взаимодействия, которые обычно опосредовано через клетки секретным cytokines, chemokines, гормоны и ECM27. Это кросс talk облегчает выживание и функцию отдельных клеток/маленькие ячейки кластеров в макро ну тома.

Важным шагом в выполнении протокола является добавление ECM смесь на вершине сфероидов и проверки ее надлежащего полимеризации. Сфероидов не покажет мигрирующих поведение, даже если они внедрены в ECM, если Ассамблея и cross-linking происходят, и формируются соответствующие коллагеновых волокон. Коллагеновые волокна можно наблюдать BF освещения, и мы советуем проверка пластину под микроскопом, чтобы подтвердить создание коллагеновых волокон в конце этого этапа. Поскольку количество сфероидов зависит первоначальная клеточная концентрация и процент заняты MCs, массива должны быть проверены после загрузки начальной ячейки, и если ячейка размещение не является оптимальным, повторное заполнение одного массива может выполняться. Действительно размер и геометрии HMCA, описанные здесь, были разработаны для размещения сравнительно небольшие клетки кластеры (до 150 мкм в диаметре). Это можно считать ограничение, поскольку проектирование новый тип массива будет необходимо для анализа миграции клеток от больших клеточных структур.

Текущая платформа использует минимальный мобильный номер и небольших реагент объем, хотя в то же время, обеспечивая большой выборки (тысячи сфероидов каждой пластины). Чтобы проанализировать 12 различных соединений для борьбы с метастатическим деятельности, 2 одного 6-хорошо HMCA на основе плиты потребуется, приносит результаты из приблизительно 5000 сфероидов, хотя для достижения одинаковых результатов потребуется по крайней мере 50 96-луночных пластины. Возможность анализа миграции разрешением индивидуальных объект в HMCA обеспечивает высокий уровень статистической надежности и точности, позволяя исследование гетерогенность структурных и функциональных вторжения в многочисленных сфероидов.

Это исследование однозначно демонстрирует коллективный вторжения населения сфероида рака молочной железы после воздействия DETA/№ Кластеры клеток MCF7 клеток показывают Саркодовые мигрирующих фенотип, и количественные изменения в морфологии и расположение каждого сфероида может достигаться автоматически. Насколько нам известно это первая выстроились система, которая облегчает мониторинг и анализ коллективных вторжения в многочисленных трехмерных структур. Путем анализа относительного направления и вторжения расстояние для каждого сфероида, это возможно для изучения взаимодействия между сфероидов населения. Кроме того установленным влияние микроокружения внеклеточных факторов на поведение клеток рака28 показано здесь. Среди этих факторов жесткость и состав микроокружения было показано сильно влияние миграции клеток. HMCA технология обеспечивает определенный, biomimetic, в пробирке платформы, в котором эти свойства ECM могут быть легко доступны и контролируется. Жесткость чистого коллагена типа I Гидрогель в концентрации 3 мг/мл, который был использован в этом исследовании, согласно сообщениям, примерно 50-600 ПА29,,3031 и добавлением га (20 мкг/мл; 0,4% wt) не изменился жесткость гидрогеля значительно32,33. Таким образом, подавляющие действие средней молекулярной массой (ММЗ)-га на вторжения 3D сфероидов HeLa, которая была продемонстрирована здесь — не из-за изменения жесткости. Эти результаты согласуются с предыдущих исследований, которые показали Бимодальная эффект HA на вторжение раковых клеток с высокой зависимостью от HA молекулярной массой34,35,,3637.

Будущего применения методов включают multi бок о бок ячейки тип культивирования опухоли и стромальных клеток в различных регионах в рамках макро Ну и поиска конкретных сфероидов течению молекулярного анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается завещание о Шимон Моше и Джудит Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

Tags

Исследования рака выпуск 140 3D многоклеточных объекты сфероида гидрогеля микро камеры пробирного вторжения ECM изображения анализ коллективные вторжения модель 3D культуры
Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N.,… More

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter